로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

요약

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

초록

심근 재생을 위한 세포 치료 효과 향상에 있는 결정적인 요인은 세포 생착 비율을 안전하고 효율적으로 증가하는 것입니다. Y-27632는 로-관련, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(RhoA/ROCK)의 매우 강력한 억제제이며 해리-유도 세포 세포 세포 사멸(anoikis)을 예방하는 데 사용됩니다. 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs^+RI)에대한 Y-27632 전처리가 급성 심근경색(MI)의 마우스 모델에서 세포 생착율 향상을 초래한다는 것을 입증한다. 여기서, 우리는 Y-27632를 가진 hiPSC-CM 분화, 정화 및 세포 전처리의 완전한 절차, 뿐만 아니라 생성된 세포 수축, 칼슘 과도 측정 및 마우스 MI 모델로의 이식에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 세포 생착 속도를 현저하게 증가시키는 간단하고 안전하며 효과적이며 저렴한 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 이식 효율을 더욱 향상시키기 위해 다른 방법과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 심장 질환의 메커니즘에 대한 연구에 유리한 기반을 제공합니다.

서문

줄기 세포 기지를 둔 치료는 MI 1에 기인한 심장손상을 위한 처리로 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 차별화된 hiPSCs의 사용은 hiPSC-CMs^2의 무한한 공급원을 제공하고 획기적인 치료법의 신속한 발전을 위한 문을 엽니다. 그러나, 이식된 세포의 심각하게 낮은 생착 율의 도전을 포함하여 치료 번역에 많은 한계가 남아 있습니다.

트립신과 세포를 해리하는 것은 anoikis^를시작합니다 3, 이는 이 세포가 허혈성 심근과 같은 가혹한 환경에 주입되면 가속되는, 저산소 환경은 세포 죽음을 향한 과정을 가속화. 나머지 세포의, 큰 비율은 혈 류로 이식 사이트에서 밖으로 세척 하 고 주변에 걸쳐 확산. 주요 apoptotic 경로 중 하나는 RhoA/ROCK통로 4. 이전 연구에 기초하여, RhoA/ROCK통로는 세포 기능 장애^7,8을담당하는 액틴 세포골격 조직^5,6을조절한다. 이 록 억제제 Y-27632는 체세포 및 줄기세포 해리 및 패시징 시 널리 사용되며, 세포 부착을 증가시키고 세포 세포 사멸을 감소시키는^데9,^10,11. 본 연구에서, Y-27632는 세포 생착 속도를 증가시키기 위한 시도로 이식 전에 hiPSC-CM을 치료하는 데 사용된다.

열 충격 및 지하 막 매트릭스 코팅(12)과 같은세포 생착 속도를 개선하기 위한 여러 가지 방법이 수립되었다. 이러한 방법 외에도, 유전 기술은 또한 심근세포 증식(13)을 촉진하거나 비근신세포(14)로 역전시킬 수 있다. 생명공학적 관점에서, 심근세포는 이식^효율을향상시키기 위해 생체 재료 스캐폴드상에 시드된다(15). 불행히도, 이러한 방법의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 반대로, 여기에 제안 된 방법은 간단하고 비용 효율적이며 효과적이며 이식 전 기저 치료뿐만 아니라 다른 기술과의 활용에도 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구결과의 모든 동물 절차는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 건강 실험실 동물 관리 및 사용 지침의 국립 학회 (NIH 간행물 No)에 근거를 두어 85-23).

1. 문화미디어및문화판의준비

1. 중간 준비
   1. hiPSC 배지의 경우, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 기저 배지 (재료표1) 및 hPSC 5x 보충제 의 100 mL의 400 mL를 혼합; 혼합물을 4 °C에 보관하십시오.
   2. RPMI 1640/B27 마이너스 인슐린(RB-) 매체의 경우, RPMI 1640 의 500 mL과 B27 보충제의 10 mL을 혼합하여 인슐린을 빼내.
   3. RPMI 1640/B27(RB+) 매체의 경우, RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙) 항생제 5mL를 혼합합니다.
   4. 정화 매체^16의경우, 무포도당 RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 펜 스트렙 항생제 5 mL 및 DL-젖산 나트륨 용액 1,000 μL (최종 농도 4 mM)을 혼합하십시오.
   5. 중화 용액의 경우, RPMI 1640, 태아 소 혈청 50 mL (FBS), 2.5 mL의 펜 스트렙 항생제, 50 μL의 Y-27632 (최종 농도 10 μM)를 혼합하십시오.
   6. 동결 매체의 경우, FBS 9 mL, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1mL, Y-27632 10 μL(최종 농도 10 μM)을 혼합합니다.
   7. 세포외 매트릭스 용액(EMS)의 경우, 4°C에서 집중된 세포외 매트릭스(재료표1)를 균일하게 일관된 액체 상태에 도달할 때까지 해동합니다. 얼음에 각각 350 μL의 매트릭스 aliquots를 만들기 전에 예냉각 파이펫 팁과 튜브, -20 °C에서 알리쿼트저장. 플레이트를 코팅하기 전에, 얼음 차가운 DMEM / F12 배지 (EMS)의 24 mL로 해동 된 알리쿼트 하나를 희석하십시오. EMS를 최대 2주 동안 4°C로 유지하십시오.
      참고: 지하 멤브레인 매트릭스 응고를 방지하기 위해 얼음에 모든 코팅 단계를 수행합니다.
   8. Tyrode의 용액의 경우, 최종 필요한 양의 조직 배양 등급의 물을 취하고, 다음 시약의 적당량을 추가하고, 용해될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 1 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 염화나트륨 140 mmol/L, 염화마그네슘 1mmol/L, 염화마그네슘 10m몰/L HEPES, 염화칼륨 5mmol/L, 염화10mmol/L, 염화칼슘 1.8mmol/L의 최종 농도에 물을 추가합니다. 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 여과에 의한 살균.
2. 세포 배양 플레이트 코팅
   1. hiPSC 배양 플레이트의 경우, 6웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 EMS를 적용하고 37°C에서 적어도 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 세포를 시드하기 전에 흡인 DMEM / F12 용액.
   2. 젤라틴 코팅의 경우, 0.2 g의 젤라틴 분말을 조직 배양 등급의 물에 용해하여 0.2% (w/v) 용액을 만듭니다. 121°C, 15psi에서 30분 동안 오토클레이브하여 멸균. 용액의 2 mL로 6웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 통과하기 전에, 용액을 흡인하고 플레이트가 조직 배양 후드 내부의 실온에서 적어도 1 시간 동안 건조되도록한다.

2. hiPSC 유지 보수 및 심근 세포 분이

1. hiPSC 배지에서 hiPSCs를 배양(단계 1.1.1 참조)을 세포가 웰당 80%-90% 합류에 도달할 때까지 일일 배지 변화를 배양합니다.
   참고: 유지 보수를 위해 hiPSCs는 일반적으로 4 일마다 통과 할 준비가되어 있습니다.
2. hiPSCs를 통과하려면 배지를 흡인하고 1x 인산완식염수(PBS)로 잘 1x를 세척합니다. 0.5 mL의 줄기 세포 분리 용액을 추가 (재료의 표1) 각 우물에 5-7 분 동안 37 °C에서 배양.
   참고: 배양 시간은 현미경으로 관찰 할 수있는 세포의 밀도와 해리 속도에 달려 있습니다.
3. 5 μM Y-27632로 보충된 hiPSC 배지 1 mL로 줄기 세포 분리 솔루션을 중화하십시오. 혼합물을 15 mL 원심분리기 튜브에 모읍니다. 200 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상월체를 흡인한 다음, 5 μM Y-27632를 함유하는 hiPSC 배지의 1 mL에서 세포를 재중단한다.
4. hiPSCs를 1:6 에서 1:18 사이의 비율로 새로운 EMS 코팅 된 6 웰 플레이트에 시드합니다. 24시간 후에 Y27632 없이 배지를 hiPSC 매체로 변경합니다.
5. 세포를 동결시키기 위해, 0.5-1백만/500 μL의 농도로 동결 배지에 해리된 hiPSCs를 다시 중단하고, 현탁액을 극저온에 놓고-80°C 냉동실에 보관하십시오. 24 시간 후에 액체 질소로 냉동 된 바이알을 옮김.
6. 분화하기 위해, hiPSC 배지를 80%-90% 세포 합류에서 10 μM GSK-3β 억제제 CHIR99021(CHIR)으로 보충한 2 mL의 RB-배지로 대체한다. 배지를 24시간 후 RB-배지의 3 mL로 교체하고 추가로 48시간(3일째)을 배양한다.
7. 3일째에, 48시간(5일째)에 대해 10 μM Wnt 억제제 IWR1로 배지를 3 mL로 바꾼 다음, 배지를 RB-배지의 3 mL로 교체하고 48시간(7일째)동안 유지한다.
8. 7일째에는 배지를 RB 배지 3mL로 교체하고 3일마다 배지를 변경합니다. hiPSC-CMs의 자발적인 박동은 일 7-10 사이에서 관찰되어야 합니다.

3. hiPSC-CM 정화 및 소분자 전처리

참고: 고도로 정제된 재조합 세포 해리 효소(표1)를 hiPSC-CM을 해리하는 데 사용하였다.

1. hiPSC-CM 분화 후 21일째에 배지를 흡인하고 세포를 멸균 된 PBS로 1 x 씻어 내다. 37 °C에서 5-7 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 세포를 철저히 해리시키기 위해 1 mL 파이펫을 사용하여 셀 현탁액을 반복적으로 피펫.
2. 세포가 해리 된 후, 각 우물에 중화 용액 1 mL을 추가하고, 3 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리튜브 및 원심 분리기로 세포 혼합물을 수집합니다.
3. 웰 당 2 백만 셀의 밀도에서 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 세포를 다시 심는다.
4. 24-48 시간 후, 배양 배지를 3-5 일 동안 정제 배지로 대체하십시오.
   참고: 각 현미경 시야에서 세포의 90% 이상이 박동할 때 정화가 완료됩니다. 심근 세포의 추가 손상을 방지하기 위해 5 일 이상 정화 기간을 연장하지 마십시오. 첫 번째 라운드가 필요한 순도를 산출하지 않으면 정제 배지를 1 일 동안 RB + 매체로 교체한 다음 두 번째 정화를 완료하십시오.
5. 이식 에 앞서, 10 μM Y-27632로 보충된 RB+ 배지에서 12시간 동안 치료군에서 세포를 배양하였다. 유사하게, 12 시간 동안 1 μM 베라파밀 (hiPSC-CMs +VER)로 RB+배지의 세포에 베라파밀 치료를 수행합니다.
6. 처리 후, HIPSC-CMs 1x를 PBS로 세척하고 최대 2 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 중화 용액으로 세포를 중화시키고, 15 mL 원심 분리관에서 세포 혼합물을 수집하고, 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를. 주입을 준비하는 동안 0.1 백만 세포 / 5 μL의 농도로 PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.

4. 심근 경색 및 세포 이식

참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브로 사전 살균되며 뜨거운 비드 멸균기를 통해 여러 수술 중에 무균 상태로 유지됩니다 (재료표2).

1. 흡입 된 이소플루란 (1.5 %-2 %)으로 NOD / scid 마우스 (재료표2)를 마취시킵니다. 발가락 핀치에 마우스의 반응에 의해 마 취 수준을 모니터링 합니다. 수술 중 건조하지 않도록 수의사에게 광학 연고를 눈에 놓습니다.
2. 공급 0.1 mg/kg buprenorphine 피하 수술 전에 통증 관리를 위한.
3. 가열된 수술대에 마우스를 고정시키고, 제모 크림을 사용하여 복부 목 부위와 왼쪽 흉부에서 모발을 제거하고, 피부를 노출시키고, 70% 알코올로 소독한다.
4. 외과 용 가위를 사용하여 목 중앙에 0.5cm 절개를 자르고 피하 지방을 멸균 집게로 분리하고 기관을 노출시다. 기관에 구두로 삽관 캐뉼라를 도입하고, 캐뉼라를 작은 동물 인공호흡기에 연결하고, 환기 설정을 조정합니다(조수량을 100-150 μL로 설정하고 호흡 속도를 분당 100x-150x로 설정).
5. 마우스가 안정된 후 왼쪽 가슴 피부 의 중간에 0.5 cm 절개를 잘라. 집게를 사용하여 근육 층을 무뚝뚝하게 분리하고 다섯 번째 늑간 공간에서 작은 절개를 하여 흉강을 노출시십시오. 절개에 리트랙터를 배치하여 흉강을 열고 왼쪽 내림차순 관상 동맥 (LAD)을 찾습니다. 해부 수술 현미경으로, 8-0으로 LAD를 리게이트 흡수할 수 없는 봉합사.
6. MI 유도 직후, hiPSC-CM^-RI,hiPSC-CM^+RI,hiPSC-CM^-VER,hiPSC-CMs^+VER또는 각 부위에 마우스의 심근에 동일한 양의 PBS를 주입합니다(3 x 10⁵ 세포/동물, 1 x 10⁵ 세포 / 사이트), 경색 지역에 하나 와 경색 주변 지역에 두.
   참고: 5 μL은 매우 작은 부피이기 때문에 주사기로 직접 빨아서 부피를 정확하게 제어하는 것은 쉽지 않습니다. 멸균 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집을 수 있으며, 세포의 5 μL은 먼저 피펫으로 뚜껑에 증착 될 수있다. 표면 장력으로 인해 확산되지 않지만 작은 액체 덩어리로 응축됩니다. 이것은 마우스의 심근에 쉽게 흡수되고 주입될 수 있습니다.
7. 따뜻한 소독식 식염수로 채우어 흉부 구멍의 잔류 공기를 제거합니다. 6-0 흡수성 봉합사로 갈비뼈, 근육 및 피부를 순차적으로 바느질하십시오. 이소플루란 마취 주사를 끕니다. 가열 패드에 수술 동물을 유지하고 밀접하게 그들이 전체 의식을 회복하는 동안 그들을 관찰. 그런 다음 동물을 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 동물을 돌려보내지 마십시오.
8. 수술 후, 부프레노르핀(0.1 mg/kg)으로 생쥐를 12일 동안 12회 씩 연속적으로 주입하고 12시간마다 이부프로펜(5 mg/kg)으로 주사하십시오. 지정된 시점에서 후속 해석 스터디를 수행합니다.
   참고: 지역 동물 관리 위원회 지침을 따라 진통제를 확인하십시오.

5. 칼슘 과도 및 수축력 기록

1. 오토클레이브 15 mm 직경 커버립 (재료의 표2) 및 핀셋은 121 ° C에서 작은 유리 비커에, 15 분 동안 15 psi. 4 °C에서 커버 립과 핀셋을 미리 냉각.
2. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 각 커버슬립에 세포외 매트릭스의 파이펫 300μL을 놓습니다.
   참고: 매트릭스가 매트릭스 코팅 량을 줄이는 것을 방지하기 위해 커버 슬립의 가장자리를 초과하지 마십시오. 12웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다.
3. 정제 된 hiPSC-CS로 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS로 1 x 씻어 낸 다음 0.5 mL의 세포 해리 효소로 1.5 분 동안 소화합니다. 중화 액 1 mL을 추가하고 1 mL 파이프로 5x -10x 를 반복적으로 피펫을 추가하십시오. , 혼합물을 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리한다.
4. 커버립에서 코팅 된 세포 외 매트릭스를 흡인합니다. 세포 수를 계산하고 중화 용액에서 세포를 40,000/300 μL의 농도로 다시 일시 중단한 다음 각 커버슬립에 300 μL의 셀 현탁액을 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 배양하였다.
5. 24 시간 후, 부드럽게 중화 된 용액을 흡인하고, 플레이트의 각 우물에 500 μL의 RB + 배지를 추가하고 2 일 동안 배양을 계속합니다.
6. Y-27632 (10 μM), 로키나아제 활성제 (RA, 100 nM), 베라파밀 (1 μM) 또는 HIPSC-CM의 배양 배지에 동일한 부피의 PBS를 첨가하고, 칼슘 과도 및 수축성 검출 전에 12 시간.
   참고: 화학적 처리 의 12 시간 후에 세포의 칼슘 과도 및 수축성의 검출 이외에, 이들 파라미터의 검출은 또한 화학적 금단 후 12, 24, 48 및 72 시간에서 시험되었다.
7. 접시를 꺼내 매체를 버리고 PBS로 플레이트를 1x 씻습니다. 계면활성제 폴리올(재료표1), 5 μM 칼슘 표시기(재료표1), 해당 Y-27632(10M), RA(100 nM), 베라파밀(1 μM) 또는 동일한 부피를 함유하는 페놀-적색 이물질이 없는 DMEM으로 배지를 변경 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양한다.
8. 상판액을 버리고, 세포를 염료가 없는 DMEM 배지로 3x 세척하고, 배지를 30분 간 쉬게 하여 매핑 염료를 제거한다.
9. 세포 씨드 커버슬립을 개탕 챔버에 넣고 자동 온도 조절기(재료표2)로 37°C에 평형으로 조정된 마이크로 인큐베이션 시스템에 챔버를 삽입하고 Tyrode의 용액과 함께 주입하고 지속적으로 추가합니다. 로키나아제 억제제(RI), RA, 또는 PBS를 관류 용액으로.
10. 거꾸로 된 형광 현미경 (재료표2)과 레이저 스캐닝 헤드 (재료표2)를 사용하여 x-t 라인 스캔을 사용하여 자발적인 칼슘과 과도성을 기록하고, 염료 여기및 515 ± 10 nm에 대한 488 nm 아르곤 레이저를 사용하여 배리어 필터를 사용하여 방출 광을 수집합니다. 공초점 현미경의 차동 간섭 대비 기능을 사용하여 hiPSC-CM의 자발적인 수축을 기록합니다(재료표2).
    참고: 칼슘 과도 기록은 MATLAB R2016A 소프트웨어(재료표 4)를사용하여 처리 및 분석하였다. 세포 수축 변화 분석제는 ImageJ 소프트웨어를사용하여 수행하였다(자료표 4).

결과

본 연구에 사용된 hiPSC-CM은 루시퍼라제 리포터 유전자를 가진 인간 기원으로부터 유래되었다; 따라서 생체 내 이식 된 세포의 생존율은 생물 발광 이미징 (BLI)¹⁷ (도 1A,B)에 의해 검출되었다. 조직학적 심장 절편을 위해, 인간 특이적 심장 트로포닌 T(hcTnT) 및 인간 핵 항원(HNA) 이중 양성세포는 이식?...

토론

이 연구의 주요 단계는 순수한 hiPSC-CM을 획득하고, Y-27632 전처리를 통해 hiPSC-CM의 활성을 개선하고, 마지막으로 정확한 양의 hiPSC-CM을 마우스 MI 모델로 이식하는 것을 포함합니다.

여기서 해결된 주요 이슈는 우선 포도당 없는 정제 방법^19를 최적화하고 새로운 효율적인 정화 시스템을 구축했다는 것입니다. 시스템 절차에는 세포 해리 효소를 적용하고, 젤라?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)	STEMCELL Technologies	#07920
B27 minus insulin	Fisher Scientific	A1895601
B27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red	Thermofisher	20163029
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)	Invitrogen/Thermofisher	F14201
Glucose-free RPMI 1640	Fisher Scientific	11879020
IWR1	Stem Cell Technologies	72562
Matrigel (extracellular matrix )	Fisher Scientific	CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)	STEMCELL Technologies	85850
Pen-strep antibiotic	Fisher Scientific	15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)	Sigma-Aldrich	P2443
Rho activator II	Cytoskeleton	CN03
RPMI1640	Fisher Scientific	11875119
Sodium DL-lactate	Sigma-Aldrich	L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)	Fisher Scientific	12-605-010
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments	PerkinElmer	CLS136334
15 mm Coverslips	Warner	CS-15R15
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Confocal Microscope	Olympus	IX81
Cryostat	Thermo Scientific	NX50
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	1645050
Fluoresence Microscope	Olympus	IX83
High Speed Camera	pco	1200 s
Laser Scan Head	Olympus	FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)	Warner Instruments	RC-42LP
Microincubation System	Warner Instruments	DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	845
NOD/SCID mice	Jackson Laboratory	001303
Precast Protein Gels	BIO-RAD	4561033
PVDF Transfer Packs	BIO-RAD	1704156
Trans-Blot System	BIO-RAD	Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab198580
Cardiac Troponin T	R&D Systems	MAB1874
Cardiac Troponin C	Abcam	ab137130
Cardiac Troponin I	Abcam	ab47003
Cy5-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Laboratory	711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-095-150
GAPDH	Abcam	ab22555
Human Cardiac Troponin T	Abcam	ab91605
Integrin β1	Abcam	ab24693
Ki67	EMD Millipore	ab9260
N-cadherin	Abcam	ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2	Cell Signaling Technology	3671s
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Matlab	MathWorks	R2016A
ImageJ	NIH	1.52g