Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Resumo

A angiogênese, como um processo crucial de progressão tumoral, tornou-se um ponto de pesquisa e alvo de terapia antitumoral. Entretanto, não há nenhum modelo de confiança para traçar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em uma maneira visual e sensível. A imagem latente de bioluminescence indica sua superioridade original na imagem latente viva devido a suas vantagens da sensibilidade elevada, da especificidade forte, e da medida exata. É apresentado aqui um protocolo para estabelecer um modelo do rato do tumor-rolamento injetando um renilla luciferase-etiquetou a linha de pilha do cancro da mama murino 4T1 no rato transgênicas com expressão angiogénese-induzida do luciferase do Firefly. Este modelo do rato fornece uma ferramenta valiosa para monitorar simultaneamente a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência em um único rato. Este modelo pode ser amplamente aplicado na triagem de drogas antitumorais e na pesquisa oncológica.

Introdução

A angiogênese é um processo essencial na progressão do câncer de neoplasias pequenas e localizadas para tumores maiores e potencialmente metastáticos^1,2. A correlação entre o crescimento tumoral e a angiogênese torna-se um dos pontos de ênfase no campo da pesquisa oncológica. Entretanto, os métodos tradicionais de medir mudanças morfológicas não conseguem monitorar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em animais vivos usando uma aproximação visualizada.

A imagem de bioluminescência (bli) de células tumorais é um método experimental particularmente apropriado para monitorar o crescimento tumoral por causa de sua não-invasividade, sensibilidade e especificidade^3,4,5,6 . A tecnologia de BLI é baseada no princípio que o luciferase pode catalisar a oxidação de um substrato específico ao emitir o bioluminescence. A luciferase expressa em células tumorais implantadas reage com o substrato injetado, que pode ser detectado por um sistema de imagem vivo, e os sinais refletem indiretamente as alterações no número de células ou na localização da célula in vivo^6,7.

Com exceção do crescimento tumoral, a angiogênese tumoral (o passo crítico na progressão do câncer) também pode ser visualizada através da tecnologia bli usando camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-Ki^8,9,10. O receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 2 (Vegfr2), um tipo de receptor de VEGF, é expressado na maior parte nas pilhas endothelial vasculares de ratos adultos¹¹. Em camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, a seqüência de DNA de Firefly luciferase (Fluc) é derrubado no primeiro exon da seqüência Vegfr2 endógena. Como resultado, o Fluc é expresso (que aparece como sinais de BLI) de uma forma que é idêntica ao nível de angiogênese em camundongos. Para crescer além de alguns milímetros de tamanho, o tumor recruta novas vasculaturas de vasos sanguíneos existentes, que expressam altamente o Vegfr2 desencadeado por fatores de crescimento das células tumorais¹. Isso abre a possibilidade de usar camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorar não invasivamente a angiogênese tumoral por BLI.

Neste protocolo, um modelo do rato do tumor-rolamento é estabelecido para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor em um único rato através da imagem latente do luciferase de Firefly (Fluc) e do luciferase de Renilla (Rluc), respectivamente (Figura 1). Uma linha de pilha 4T1 (4T1-RR) é criada que expressa estàvel Rluc e a proteína fluorescente vermelha (RFP) para traçar o crescimento da pilha por imagem latente de Rluc. Para investigar mais as mudanças dinâmicas da angiogênese na progressão e na regressão do tumor, uma outra linha celular 4T1 (4T1-RRT) é criada que expressa o vírus de herpes simplex do gene do suicídio truncado timidina kinase (HSV-TTK), rluc, e RFP. Pela administração de ganciclovir (GCV), as células de expressão de HSV-TTK são seletivamente abladas. Baseado nestas linhas de pilha, um modelo do tumor-rolamento em ratos de Vegfr2-Fluc-KI é construído que sere como um modelo experimental que ponte a progressão do tumor e a angiogênese do tumor in vivo.

Protocolo

Os experimentos devem obedecer aos regulamentos nacionais e institucionais relativos ao uso de animais para fins de pesquisa. As permissões para realizar experimentos devem ser obtidas. O tratamento dos animais e os procedimentos experimentais do estudo aderem às diretrizes da Comissão de cuidados e uso de animais da Universidade Nankai, que estão em conformidade com as diretrizes para a assistência aos animais aprovadas pelos institutos nacionais de saúde (NIH).

1. LV-Rluc-RFP (RR) e LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) embalagem e produção de Lentivirus

Nota: o pLV-RR transporta as sequências genéticas de Renilla luciferase (Rluc) e proteína vermelha fluorescente (RFP) o promotor EF1α, enquanto o pLV-RRT carrega as sequências genéticas codificando Rluc, RFP, e vírus herpes simplex truncado timidina quinase (HSV-TTK) ( Figura 2).

1. Semente 1 x 10⁶ de células de 293T por poço em uma placa de 6 poços e cultura durante a noite em uma incubadora humidificada com 5% co₂ a 37 ° c com o meio de águia modificada de DULBECCO (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS).
2. Prepare a suspensão do lipossomas: misture 7,5 μl do lipossomas e 0,25 ml do meio essencial mínimo (MEM) em um tubo de 1,5 ml que segue a incubação por 5 minutos na temperatura ambiente (RT) para dispersar lipossomas ingualmente.
3. Prepare a solução DNAs (DNAs-RR): separadamente, adicione o vetor pLV-RR e os plasmídos auxiliares a 0,25 mL de MEM em um tubo de 1,5 mL, conforme descrito na tabela 1.
4. Obtenha o composto de lipossomas/DNAs-RR: Adicione delicadamente a solução de DNAs-RR na gota de suspensão lipossomas preparada pela gota e incubar por 20 minutos no RT assim que as ligações do ADN à membrana do lipido.
5. Substitua o meio das células 293T por 1 mL de DMEM contendo 10% de FBS e adicione o composto liposome/DNAs-RR ao meio das células 293T suavemente.
6. Após a incubação em uma incubadora humidificada com 5% de CO₂ a 37 ° c por 12 – 16 h, substitua o composto liposome/DNAs-RR contendo meio das células 293T com 1 ml de DMEM contendo 10% de FBS e 100 U/ml de penicilina − estreptomicina.
7. Continue cultivando as pilhas 293T na incubadora humidificada para 48 h após o transfection. Em seguida, recolher o sobrenadante das células 293T e centrifugar o meio em 300 x g por 5 min para pellet as células 293T. Transfira o supernatante de Lentivirus-RR (LV-RR) para 1,5 mL de tubos de armazenamento estéreis de polipropileno e armazene a-80 ° c.
   Nota: uma instalação do nível 2 de biossegurança (BSL-2) é exigida a fim trabalhar com o Lentivirus de recombinação.
8. Repita as etapas 1.1 – 1.7 e use o vetor pLV-RRT em vez do vetor pLV-RR na etapa 1,3 para obter o Lentivirus-RRT (LV-RRT). Armazene o LV-RRT em-80 ° c.
   Nota: o estoque lentivirais não purificado pode inibir o crescimento celular em alguns casos. O estoque de Lentivirus pode precisar ser purificado. Os estoques de lentivirais contendo partículas de LV-RR ou LV-RRT devem ser divididos em tubos de 1,5 mL (1 mL por tubo) para armazenamento para evitar vários ciclos de descongelamento livre.

2. transdução lentivirais de LV-RR e LV-RRT para expressão gênica em células 4T1

1. Semente 4T1 células em uma placa de 6 poços (5 x 10⁵ células/poço) e cultura com Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 meio contendo 10% FBS durante a noite em uma incubadora humidificada com 5% co₂ em 37 ° c.
2. Retire o meio da placa de cultura e substitua-o por 1 mL de meio RPMI 1640 fresco, bem como 1 mL de estoque de Lentivirus (LV-RR ou LV-RRT) a cada poço. Adicione 8 μg/mL de polibreno e misture suavemente o meio que contém partículas de Lentivirus, introduzindo a pipetagem para cima e para baixo.
   Nota: por favor, esteja ciente de que o meio contém partículas lentivirais, que poderiam transduce células humanas.
3. Solução de transdução de centrifugação em centrífuga a 1.000 × g por 60 min em RT para ajudar a aumentar a eficiência de transdução. Após a centrifugação, as pilhas 4T1 da cultura para 4 – 12 h e mantêm-se em uma incubadora humidificada com 5% CO₂ em 37 ° c.
   Nota: para algumas linhas celulares, o polibreno pode ser tóxico para a cultura de longo prazo. Portanto, o tempo de incubação para transmófica de diferentes células pode ser mutável. Verifique o status da célula várias vezes para encontrar o tempo de incubação apropriado.
4. Atualize o meio das células 4T1 transvadas com 2 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 100 U/mL de penicilina − estreptomicina para remover partículas de Lentivirus e polibreno.

3. triagem de fármacos e identificação de células 4T1 transvadas com LV-RR e LV-RRT

1. Selecione células transvadas com meio contendo blasticidina (BSD) de acordo com o gene da BSD-Resistance transportado por LV-RR ou LV-RRT como os seguintes passos descritos.
   Nota: Alternativamente, as células transvadas que são RFP-positivas podem ser selecionadas por citometria de fluxo de acordo com o gene RFP transportado por LV-RR ou LV-RRT.
2. 48 h após a transdução, células de passagem 4T1 na proporção de 1:3 a 1:4 com meio de seleção (meio RPMI 1640 contendo 10% FBS, 100 U/mL de penicilina − estreptomicina e 5 μg/mL BSD). Altere o meio a cada 2 ou 3 dias.
   Nota: a concentração óptima de BSD pode variar da linha celular à linha celular. Conseqüentemente, um experimento piloto da curva da matança deve ser executado para determinar a concentração óptima de BSD antes do experimento inicial.
3. 7 dias de triagem pós-fármaco, observar as células 4T1 transvadas LV-RR (4T1-RR) e LV-RRT transtradas 4T1 células (4T1-RRT) o microscópio de contraste de fase invertido de fluorescência. Contar o número de células de RFP⁺ 4T1 e todas as células 4T1 em três campos de visão para estimar a relação RFP-positiva, respectivamente (Figura 2).
   Nota: Alternativamente, a relação RFP-positiva de células 4T1 transvadas pode ser identificada por citometria de fluxo.
4. Meça os sinais de renilla de células 4T1-RR e células 4T1-RRT usando um sistema de imagens vivas para detectar a relação linear entre números de células e sinais de renilla (Figura 3).
5. Expanda as células 4T1-RR e 4T1-RRT selecionadas com BSD com meio de seleção em proporções divididas entre 1:3 e 1:4 e armazene os estoques de linha celular em nitrogênio líquido.

ratos 4. Vegfr2-Fluc-KI e modelo do rato do tumor-rolamento

Nota: os camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, com 6-8 semanas de idade e fêmeas, são utilizados neste experimento para monitorar não-invasivamente a angiogênese in vivo pela BLI.

1. Células 4T1-RR de cultura e células 4T1-RRT em pratos de Petri de 60 mm em uma incubadora humidificada com 5% de CO₂ a 37 ° c, respectivamente. Quando as células estão em 80% confluência, remover o meio e enxaguar com fosfato tampão salina (PBS).
2. Retire o PBS e adicione um adicional de 2 mL de 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA solução respectivamente. Mantenha o prato em RT (ou a 37 ° c) até que as células se desanexem.
3. Adicionar 5 – 10 mL de meio fresco contendo 10% FBS, em seguida, aspirar e dispensar células para ressuscitar 4T1-RR e 4T1-RRT células em 15 mL tubos de centrífuga, respectivamente. Conte dois tipos de células 4T1 usando uma câmara de contagem e prepare as suspensões celulares em uma concentração de 1 x 10⁶ por 100 μl no meio rpmi 1640.
4. Anestesiar os camundongos Vegfr2-Fluc-KI com 1% – 3% de isoflurano em 100% de oxigênio na câmara de indução anestésica com vazão de 1 L/min. Monitore a resposta da pinça do dedo do mouse para confirmar o status da anestesia. Em seguida, aplique pomada oftálmico aos olhos do mouse para evitar a desidratação.
5. Remover o mouse da câmara e posição em nosecone. Remova inteiramente o cabelo do ombro do rato usando o creme elétrico da remoção do Shaver e do cabelo, que poderia fornecer uma boa vista do campo cirúrgico e para evitar obstruir os sinais de BLI em seguir-acima dos experimentos.
6. Injete subcutaneously as pilhas 4T1-RR (1 x 10⁶ pilhas em um volume total de 100 μL) e as pilhas 4T1-RRT (1 x 10⁶ pilhas em um volume total de 100 μL) nos ombros esquerdos e direito de cada rato, respectivamente (registro como o dia 0). Coloc ratos na área da recuperação com sustentação térmica até recuperado inteiramente.
7. Após a implantação das células 4T1-RR e 4T1-RRT, toque nas massas tumorais para verificar se os camundongos são portadores de tumor todos os dias (Figura S1). No borne-implante do dia 7, injete via intraperitoneal 50 Magnésio/quilograma ganciclovir (GCV) aos ratos do tumor-rolamento duas vezes por o dia até a extremidade do experimento.
   Nota: antes deste experimento, o citotóxico de GCV em células 4T1-RRT deve ser detectado. A eficiência de morte do GCV pode ser avaliada por ensaio de contagem de células com diferentes concentrações de GCV (Figura S2).
8. No dia 0, 3, 7, 14 e 21 após a implantação do 4T1, monitore o crescimento tumoral e a angiogênese dos camundongos portadores de tumor e avalie a imagem de Rluc e Fluc (Figura 4).

5. imagem de bioluminescência dupla do tumor (Rluc) e angiogênese (Fluc)

1. Abra o sistema de imagens vivas, inicialize o software de imagens vivas e, em seguida, inicialize o sistema.
   Observação: a inicialização do sistema levará alguns minutos para esfriar a câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) para-90 ° c antes de poder iniciar a imagem. A temperatura ficará verde quando a câmera CCD for arrefecida.
2. Utilize as seguintes definições da câmara:
   Verifique a luminescência e fotografia.
   Verifique a sobreposição.
   Definições de luminescência:
   Tempo de exposição define AUTO em condições normais.
   Binning ajusta-se a 8.
   F/stop define como 1.
   Os conjuntos de filtros de emissão abrem.
   Configurações de fotografia:
   Binning define para médio.
   F/stop define para 8.
   Definições do sistema IVIS:
   Campo de visão: C = 1 vista do mouse, D = 5 ratos vista.
   A altura do assunto ajusta 1,5 cm.
3. Pesar e registrar os camundongos e calcular o volume de Coelenterazina (CTZ; 2,5 mg/kg) e D-luciferina (150 mg/kg) necessário.
4. Anestesiar o rato do tumor-rolamento por 1%-isoflurano de 3% no oxigênio de 100% na câmara da indução da anestesia com uma taxa de fluxo de 1 L/min. Monitore a resposta da pitada do dedo do pé do rato para confirmar o status da anestesia. Em seguida, dispensar uma gota de lubrificante olho pomada em ambos os olhos para evitar danos na córnea.
5. Injete 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) por quilograma de peso corporal no retrobulbar do rato (por exemplo, para um rato de 20 g, injectar 15 μL para entregar 50 μg de CTZ) utilizando uma agulha de seringa de insulina.
6. Mova o rato do tumor-rolamento na câmara da câmera com seu nariz no cone da anestesia delicadamente e adquira diversas retratos do dorsal do rato imediatamente para começ os sinais de Rluc das pilhas 4T1 até que os sinais BLI desvaneçam-se afastado.
   Nota: a meia-vida de ctz é muito curto e os sinais de rluc cair vertiginosamente ~ 30 s. Para garantir que qualquer sinal residual de Rluc tenha se dissipado e o intervalo entre a imagem de Rluc e Fluc deve ser superior a 10 min.
7. Injectar intraperitonealmente 150 mg/kg D-luciferina (30 mg/mL) utilizando uma agulha de seringa de insulina (por exemplo, para um rato de 20 g, injete 100 μL para fornecer 3 mg de D-luciferina). Mantenha o mouse em RT por 10 min antes da imagem de Fluc.
8. Mova este rato na câmara da câmera com seu nariz no cone da anestesia outra vez e adquira diversos retratos do dorsal do rato para começ os sinais de Fluc da angiogênese.
   Nota: o monitor cinético de Fluc deve ser executado para cada rato até que os sinais alcancem o máximo e então desvaneça-se.
9. Repita as etapas de procedimentos 5.4 – 5.8 para cada mouse.
10. Após a imagem, manter os ratos em um ambiente quente até que os animais acordar.
11. No ponto de tempo desejado (dia 3, 7, 14 e 21), repita os procedimentos acima (etapa 5.3 – 5.10) para detectar a progressão do tumor e a angiogênese tumoral ao longo do tempo.
12. Analise os dados dos sinais de Rluc e Fluc para investigar a relação entre o crescimento tumoral e a angiogênese na progressão tumoral.
    Observação: as regiões de interesse (ROI) que cobrem o site de sinal BLI são usadas para analisar os dados. Meça a luminosidade total (fótons) de ROI na unidade de fótons/segundos/cm²/steradian (p/s/cm²/Sr) para cada ponto temporal.
13. Analise os sinais Rluc e Fluc de ROI usando softwares gráficos (Figura 4).

Resultados

Neste experimento, foi estabelecido um modelo de camundongo de câncer de mama utilizando células 4T1 para investigar a relação entre o crescimento tumoral e a angiogênese tumoral (Figura 1). Primeiramente, dois Lentivirus foram empacotados, que carregaram seqüências do gene que expressam Rluc/RFP (LV-RR) e Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), respectivamente, como relatado previamente⁷. Em seguida, duas linhas de células 4T1 diferentes, ...

Discussão

Neste protocolo, uma aproximação dupla não invasora de BLI é descrita para monitorar o desenvolvimento e a angiogênese do tumor. O sistema do repórter de BLI é desenvolvido primeiramente, contendo o gene do suicídio de HSV-TTK/GCV para seguir a progressão do tumor e a regressão in vivo pela imagem latente de Rluc. Enquanto isso, a angiogênese tumoral é avaliada usando camundongos Vegfr2-Fluc-KI via imagem Fluc. Este modelo do rato do tumor-rolamento é capaz de fornecer uma plataforma prática para o desenvol...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293