종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

요약

이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.

초록

혈관 신생은 종양 진행의 중요한 과정으로서 항 종양 치료의 연구 핫스팟및 표적이되었습니다. 그러나, 종양 진행 및 혈관 신생을 동시에 시각적이고 민감한 방식으로 추적하기위한 신뢰할 수있는 모델은 없다. 생물 발광 이미징은 높은 감도, 강한 특이성 및 정확한 측정의 장점으로 인해 살아있는 이미징에서 고유 한 우수성을 보여줍니다. 여기서 제시된 프로토콜은 혈관신생 유도반딧불 루시퍼라아제 발현을 가진 형질전환 마우스내로 르니야 루시퍼라아제 표지 된 뮤린 유방암 세포주 4T1을 주입함으로써 종양-베어링 마우스 모델을 확립하는 프로토콜이다. 이 마우스 모델은 단일 마우스에서 이중 생물 발광 이미징을 통해 종양 진행 및 혈관 신생을 실시간으로 동시에 모니터링하는 귀중한 도구를 제공합니다. 이 모델은 항종양 약물 스크리닝 및 종양학 연구에 널리 적용될 수 있다.

서문

혈관 신생은 작고 국소 된 신 생물에서 더 크고 잠재적으로 전이성 종양으로암의진행에 필수적인 과정입니다 1,^2. 종양 성장과 혈관 신생 사이의 상관 관계는 종양학 연구 분야에서 강조되는 점 중 하나가됩니다. 그러나, 형태학적 변화를 측정하는 전통적인 방법은 가시화 된 접근을 사용하여 살아있는 동물에서 동시에 종양 진행 및 혈관 신생을 모니터링하지 못합니다.

종양 세포의 생물 발광 이미징 (BLI)은 비 침습성, 민감성 및 특이성 3,^4,5, 6 때문에 종양 성장을 모니터링하는 특히 적절한 실험 방법입니다. . BLI 기술은 루시퍼라제가 생물 발광을 방출하면서 특정 기판의 산화를 촉매할 수 있다는 원리를 기반으로 합니다. 이식된 종양 세포에서 발현되는 루시퍼라제는 생체 영상 시스템에 의해 검출될 수 있는 주입된 기질과 반응하고, 신호는 생체내 세포 수 또는 세포 국소화의 변화를 간접적으로 반영한다 6,^7.

종양 성장을 제외하고, 종양 혈관신생(암 진행에 중요한 단계)은 또한 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스^8,9,^10을사용하여 BLI 기술을 통해 가시화될 수 있다. 혈관 내피 성장 인자(Vegf) 수용체 2(Vegfr2), Vegf 수용체의 한 유형은, 주로 성인 마우스(11)의혈관 내피 세포에서 발현된다. Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스에서, 반딧불 루시퍼라제(Fluc)의 DNA 서열은 내인성 Vegfr2 서열의 첫 번째 엑소로 노크된다. 그 결과, Fluc은 마우스에서 혈관신생 의 수준과 동일한 방식으로 (BLI 신호로 나타나는) 발현된다. 크기가 몇 밀리미터 를 넘어 성장하기 위해 종양은 종양 세포에서 성장 인자에 의해 유발 된 Vegfr2를매우 발현하는 기존 혈관에서 새로운 혈관을 모집합니다 1. 이것은 BLI에 의한 비침습적으로 종양 혈관신생을 모니터링하기 위해 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스를 사용할 가능성을 열어준다.

본 프로토콜에서, 종양 베어링 마우스 모델은 반딧불 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라루시퍼라제(Rluc) 이미징을 통해 단일 마우스에서종양 진행 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 각각 확립된다(도 1). 4T1 세포주(4T1-RR)는 Rluc 이미징에 의해 세포 성장을 추적하기 위해 Rluc 및 적색 형광 단백질(RFP)을 안정적으로 발현하는 것으로 생성됩니다. 종양의 진행 및 회귀에서 혈관신생의 동적 변화를 추가로 조사하기 위해, 또 다른 4T1 세포주(4T1-RRT)는 자살 유전자 포진 심플렉스 바이러스를 발현하여 티미딘 키나아제(HSV-ttk), Rluc 및 RFP를 발현하는 것으로 생성된다. 간시클로비르(GCV)의 투여에 의해, HSV-ttk 발현 세포는 선택적으로 절제된다. 이러한 세포주를 기반으로, Vegfr2-Fluc-KI 마우스의 종양 베어링 모델은 생체 내에서 종양 진행 및 종양 혈관신생을 연결하는 실험 모델역할을 한다.

프로토콜

실험은 연구 목적으로 동물의 사용에 관한 국가 및 기관 규정을 준수해야합니다. 실험을 수행할 수 있는 권한을 얻어야 합니다. 동물의 치료와 연구의 실험 절차는 국립 보건원 (NIH)이 승인 한 동물 관리 지침에 부합하는 난카이 대학 동물 관리 및 사용위원회 지침을 준수합니다.

1. LV-Rluc-RFP (RR) 및 LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) 렌티 바이러스 포장 및 생산

참고: pLV-RR은 프로모터 EF1α 하에서 레닐라 루시퍼라제(Rluc)와 적색 형광 단백질(RFP)의 유전자 서열을 전달하는 반면, pLV-RRT는 Rluc, RFP 및 헤르페스 심플렉스 바이러스를 코딩하는 유전자 서열을 운반하는 반면 티미딘 키나아제(HSV-ttk)(HSV-ttk) 그림2).

1. 종자 1 x 10^의 293T 세포 중 6 개의 웰 플레이트를 6 개의 웰 플레이트와 배양하여 37°C에서 5% CO2를 가진 가습 된 인큐베이터에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM을 함유한다.
2. 리포솜 현탁액을 준비하십시오: 리포솜7.5 μL과 0.25 mL의 최소 필수 배지(MEM)를 실온(RT)에서 5분 동안 인큐베이션한 후 1.5 mL 튜브에 섞어서 리포좀을 동등하게 분산시냅니다.
3. DNAs 용액(DNAs-RR)을 준비: 별도로, 표1에 기재된 바와 같이 1.5 mL 튜브에서 MEM의 0.25 mL에 pLV-RR 벡터 및 도우미 플라스미드를 추가한다.
4. 리포솜/DNAs-RR 화합물을 얻으세요: DNAs-RR 용액을 준비된 리포좀 서스펜션 드롭에 부드럽게 넣고 RT에서 20분 동안 배양하여 DNA가 지질막에 결합되도록 합니다.
5. 293T 세포의 배지를 10% FBS를 함유하는 1 mL의 DMEM으로 대체하고 리포솜/DNAs-RR 화합물을 293T 세포의 배지에 부드럽게 첨가한다.
6. 가습 된 인큐베이터에서 12-16 시간 동안 37 °C에서 5 % CO2로 인큐베이터에서 인큐베이션 한 후, 10 % FBS 및 100 U / mL 페니실린 - 스트렙 토마이신을 함유한 DMEM의 1 mL로 293T 세포의 배지를 함유하는 리포솜 / DNAs-RR 화합물을 교체하십시오.
7. 293T 세포를 형질전환 후 48시간 동안 가습된 인큐베이터에서 계속 배양하였다. 이어서, 293T 세포의 상상액을 수집하고 293T 세포를 펠렛하기 위해 5분 동안 300 x g에서 배지를 원심분리한다. 렌티바이러스-RR(LV-RR)-함유 상급물질을 1.5 mL 멸균 폴리프로필렌 저장 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관한다.
   참고: 재조합 렌티바이러스와 함께 작동하려면 생물안전수준 2(BSL-2) 시설이 필요합니다.
8. 1.1-1.7 단계를 반복하고 1.3 단계에서 pLV-RR 벡터 대신 pLV-RRT 벡터를 사용하여 렌티바이러스-RRT(LV-RRT)를 얻었다. LV-RRT를 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 비정제 렌티바이러스 스톡은 경우에 따라 세포 성장을 억제할 수 있습니다. 렌티바이러스 스톡은 정제해야 할 수도 있습니다. LV-RR 또는 LV-RRT 입자를 포함하는 렌티바이러스 스톡은 여러 번의 자유 해동 주기를 피하기 위해 저장을 위해 1.5 mL 튜브(튜브당 1mL)로 나누어야 합니다.

2. 4T1 세포에서 유전자 발현을 위한 LV-RR 및 LV-RRT 렌티바이러스 성 전환

1. 종자 4T1 세포를 6웰 플레이트(5 x 10⁵ 세포/웰)로 배양하고 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI)와 배양하여 10% FBS를 함유하는 배지를 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 하룻밤 동안 함유하였다.
2. 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 1 mL 의 신선한 RPMI 1640 배지뿐만 아니라 렌티바이러스 스톡(LV-RR 또는 LV-RRT)의 1 mL로 각각 잘 교체한다. 8 μg/mL 폴리브레인을 추가하고 렌티바이러스 입자를 함유한 배지를 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 블렌딩합니다.
   참고 : 매체는 인간 세포를 변환 할 수있는 렌티 바이러스 입자를 포함하고 있음을 유의하시기 바랍니다.
3. RT에서 60분 동안 1,000 × g의 원심분리기에서 트랜스덕션 용액을 회전시켜 트랜스덕션 효율을 높입니다. 원심분리 후, 배양 4T1 세포를 4-12시간 동안 배양하고 37°C에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 유지한다.
   참고: 일부 세포주의 경우, 폴리브레인은 장기 배양에 독성이 있을 수 있습니다. 따라서, 상이한 세포를 변환하기 위한 인큐베이션 시간은 변경될 수 있다. 적절한 배양 시간을 찾기 위해 세포 상태를 여러 번 확인하십시오.
4. 렌티 바이러스 입자와 폴리브레인을 제거하기 위해 10 % FBS 및 100 U / mL 페니실린 - 스트렙 토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지의 2 mL로 변환 된 4T1 세포의 매체를 새로 고칩니다.

3. LV-RR 및 LV-RRT 의 약물 스크리닝 및 식별 4T1 세포

1. 다음 단계에 기재된 바와 같이 LV-RR 또는 LV-RRT에 의해 운반된 BSD 저항 유전자에 따라 블라시딘(BSD)을 함유하는 배지를 가진 트랜스듀싱 세포를 선택한다.
   참고: 대안적으로, RFP 양성인 형질전환 세포는 LV-RR 또는 LV-RRT에 의해 운반된 RFP 유전자에 따라 유세포측정에 의해 선택될 수 있었다.
2. 48시간 후, 선택 배지를 사용하여 1:3 대 1:4의 비율로 4T1 세포를 계관합니다(RPMI 1640 배지는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 5 μg/mL BSD). 2일 또는 3일마다 매번 매체를 변경합니다.
   참고: 최적 BSD 농도는 세포주에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, 초기 실험 전에 BSD의 최적 농도를 결정하기 위해 킬 커브의 파일럿 실험을 수행해야 한다.
3. 7일 후 약물 스크리닝, LV-RR 형질전환 된 4T1 세포 (4T1-RR) 및 LV-RRT는 형광 반전 상 대비 현미경 하에서 4T1 세포 (4T1-RRT)를 시동관찰한다. RFP+4T1 셀의 수를 세고 3개의 시야분야에서 모든 4T1 셀을 각각 RFP 양성비를 추정한다(도 2).
   참고: 대안적으로, 형질전환된 4T1 세포의 RFP 양성비는 유세포측정에 의해 확인될 수 있었다.
4. 살아있는 이미징 시스템을 사용하여 4T1-RR 세포 및 4T1-RRT 세포의 레닐라 신호를 측정하여 세포 수와레닐라 신호 사이의 선형 관계를 검출합니다(그림 3).
5. BSD 스크린 4T1-RR 및 4T1-RRT 셀을 1:3과 1:4 사이의 분할 비율로 선택 배지로 확장하고 세포주 스톡을 액체 질소에 저장합니다.

4. Vegfr2-Fluc-KI 마우스 및 종양 베어링 마우스 모델

참고: 6-8주 령 및 암컷인 형질전환 Vegfr2-Fluc-KI 마우스는 BLI에 의해 생체 내 혈관신생을 비침습적으로 모니터링하기 위해 이 실험에 사용된다.

1. 배양 4T1-RR 세포 및 4T1-RRT 세포를 각각 37°C에서 5% CO2를 가진 가습된 인큐베이터에서 60 mm 페트리 접시에. 세포가 80 % 합류에있을 때, 배지를 제거하고 인산완충 식염수 (PBS)로 헹구는다.
2. PBS를 제거하고 각각 0.25% 트립신-0.53 mM EDTA 용액의 2 mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 접시를 RT(또는 37°C)에서 유지합니다.
3. 10% FBS를 함유한 신선한 배지 5-10 mL을 추가한 다음 세포를 흡인하고 분배하여 4T1-RR 및 4T1-RRT 세포를 각각 15 mL 원심분리튜브에 다시 삽입합니다. 카운트 챔버를 사용하여 2가지 유형의 4T1 세포를 카운트하고 RPMI 1640 배지에서 100 μL당 1 x 10^6의 농도로 세포 현탁액을 준비한다.
4. Vegfr2-Fluc-KI 마우스를 마취 유도 챔버에서 100% 산소로 1%-3%의 이소플루란으로 마취하여 1L/min의 유량으로 마우스의 발가락 핀치 반응을 모니터링하여 마취 상태를 확인합니다. 그런 다음, 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
5. 코콘의 챔버와 위치에서 마우스를 제거합니다. 전기 면도기와 제모 크림을 사용하여 마우스 어깨의 머리카락을 완전히 제거하여 수술 현장을 잘 볼 수 있으며 후속 실험에서 BLI 신호를 차단하지 않도록하십시오.
6. 피하적으로 각 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 어깨에 4T1-RR 세포(100 μL 총 부피에서 1 x 10 6셀)와 4T1-RRT 세포(총 부피가 100μL에서 1x10^6셀)를 각각 주입합니다(0일으로 기록). 완전히 회복될 때까지 열 지지대를 가진 회복 부위에 마우스를 놓습니다.
7. 4T1-RR 및 4T1-RRT 세포를 이식한 후, 종양 덩어리를 터치하여 마우스가 매일종양을 지니고 있는지 확인한다(도 S1). 7일째이식 이식 후, 복강 내 주사 50 mg/kg 간시클로비르(GCV)를 종양 을 지탱하는 마우스에 하루에 두 번 씩 실험이 끝날 때까지 주입합니다.
   참고 : 이 실험 전에 4T1-RRT 세포에서 GCV의 세포 독성을 검출해야합니다. GCV의 살해 효율은 GCV의 상이한 농도를 가진세포 계수 분석에 의해 평가될 수 있었다(도 S2).
8. 4T1 이식 후 0일, 3일, 7, 14, 및 21일째에, 종양-베어링 마우스의 종양 성장 및 혈관신생을모니터링하고 Rluc 및 Fluc 이미징 모두에 의해 평가한다(도 4).

5. 종양 (Rluc) 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징 (Fluc)

1. 살아있는 이미징 시스템을 열고 살아있는 이미징 소프트웨어를 초기화한 다음 시스템을 초기화합니다.
   참고: 시스템 초기화는 이미징을 시작하기 전에 충전 결합 장치(CCD) 카메라를 -90°C로 냉각하는 데 몇 분 정도 걸릴 것입니다. CCD 카메라가 냉각되면 온도가 녹색으로 바뀝니다.
2. 다음 카메라 설정을 사용합니다.
   발광 및 사진을 확인합니다.
   오버레이를 확인합니다.
   발광 설정:
   노출 시간은 정상 조건에서 AUTO를 설정합니다.
   비닝 세트는 8로 설정됩니다.
   F/스톱이 1로 설정됩니다.
   방출 필터가 열립니다.
   사진 설정:
   비닝은 중간으로 설정합니다.
   F/스톱은 8로 설정됩니다.
   IVIS 시스템 설정:
   시야: C=1 마우스 보기, D=5 마우스 보기.
   피사체 높이가 1.5cm를 설정합니다.
3. 마우스의 무게와 기록을 기록하고 필요한 coelenterazine (CTZ; 2.5 mg/kg) 및 D-루시페린 (150 mg/kg)의 부피를 계산합니다.
4. 1 L/min의 유속으로 마취 유도 챔버에서 100% 산소에서 종양 베어링 마우스를 1%-3% 이소플루란으로 마취합니다. 그런 다음 각막 손상을 피하기 위해 두 눈에 윤활 유황 눈 연고 한 방울을 분배하십시오.
5. 킬로그램 당 2.5 mg 의 CTZ (3.33 mg/mL)를 마우스의 레트로불바에 주입하십시오 (예를 들어, 20 g 마우스의 경우, 15 μL을 주입하여 50 μg의 CTZ를 전달함) 인슐린 주사기 바늘을 사용하여.
6. 종양 베어링 마우스를 마취 콘의 코를 가진 카메라 챔버로 부드럽게 이동하고 즉시 마우스 등쪽의 여러 사진을 획득하여 BLI 신호가 사라질 때까지 4T1 세포에서 Rluc 신호를 얻습니다.
   참고 : CTZ의 반감기는 매우 짧고 Rluc의 신호는 급격히 ~ 30 s를 떨어 뜨립니다. 잔류 Rluc 신호가 소멸되었는지 확인하고 Rluc와 Fluc 이미징 사이의 간격은 10분 이상이어야 합니다.
7. 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 150 mg/kg 의 D-luciferin (30 mg/mL)을 주입합니다 (예 : 20g 마우스의 경우 100 μL을 주입하여 D-루시페린 3 mg을 제공합니다). Fluc 이미징 전에 10분 동안 RT에 마우스를 보관하십시오.
8. 이 마우스를 마취 원뿔의 코가있는 카메라 챔버로 다시 이동하고 혈관 신생에서 Fluc 신호를 얻기 위해 마우스 등쪽의 여러 사진을 얻습니다.
   참고: 신호가 최대값에 도달한 다음 페이드 할 때까지 각 마우스에 대해 Fluc 운동 모니터를 수행해야 합니다.
9. 각 마우스에 대해 5.4-5.8 단계를 반복합니다.
10. 이미징 후 동물이 깨어날 때까지 따뜻한 환경에서 마우스를 유지하십시오.
11. 원하는 시점(3일째, 7일, 14일 및 21일)에서, 시간이 지남에 따라 종양 진행 및 종양 혈관신생을 검출하기 위해 위의 절차(단계 5.3-5.10)를 반복한다.
12. Rluc 및 Fluc 신호를 분석하여 종양 진행에서 종양 성장과 혈관신생 사이의 관계를 조사합니다.
    참고: BLI 신호 사이트를 포괄하는 관심 지역(ROI)은 데이터를 분석하는 데 사용됩니다. 모든 시간대에 대해 광자/초/cm 2/스테라디안(p/s/cm 2/s/sr)단위에서 ROI의 총 광도(Photons)를 측정합니다.
13. 그래픽 소프트웨어를 사용하여 ROI의 Rluc 및 Fluc신호를 분석합니다(그림 4).

결과

본 실험에서, 유방암 마우스 모델은 종양 성장과 종양 혈관신생 사이의 관계를 조사하기 위해 4T1 세포를 사용하여 확립되었다(도 1). 첫째로, 2개의 렌티바이러스는 이전에 보고된^대로각각 Rluc/RFP (LV-RR) 및 Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT)를 발현하는 유전자 서열을 운반하는, 패키징되었다. 이어서, 4T1-RR 및 4T1-RRT라는 두 개의 서로 다른 4T1 세포?...

토론

이 프로토콜에서, 비침습적 이중 BLI 접근법은 종양 발달 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 기술된다. BLI 리포터 시스템은 Rluc 이미징에 의해 생체 내 종양 진행 및 회귀를 추적하기 위한 HSV-ttk/GCV 자살 유전자를 포함하는 처음 개발되었습니다. 한편, 종양 혈관신생은 Fluc 이미징을 통해 Vegfr2-Fluc-KI 마우스를 사용하여 평가된다. 이 종양 베어링 마우스 모델은 높은 관련성, 재현성 및 번역성을 가진 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293