Deteção de parasitos extravascular do Trypanosoma pela aspiração fina da agulha

Resumo

A aspiração fina da agulha é uma técnica, por meio de que as pilhas são obtidas de uma lesão ou de um órgão usando uma agulha fina. Os materiais aspirados são manchados, manchados e examinados um microscópio para o diagnóstico ou usados para a biologia molecular, a citometria ou a análise in vitro. É barato, simples, rápido e provoca um trauma mínimo.

Resumo

A aspiração fina da agulha (FNA) é um procedimento diagnóstico rotineiro essencial às práticas médicas e veterinárias. Consiste na aspiração percutânea de células e/ou microrganismos de massas palpáveis, órgãos ou derrames (acumulação de fluidos em uma cavidade corporal) usando uma agulha fina semelhante à agulha regular usada para a punção venosa. O material coletado pela FNA é em geral altamente celular, e o aspirado recuperado é então manchado, ar seco, molhado-fixo, manchado e observado um microscópio. No contexto clínico, a FNA é uma importante ferramenta diagnóstica que serve como um guia para o manejo terapêutico adequado. Porque é simples, rápido, minimamente invasivo e requer investimento limitado no laboratório e recursos humanos, é amplamente utilizado por praticantes de veterinária, principalmente em doméstico, mas também em animais de fazenda. Em estudos que utilizam modelos animais, a FNA tem a vantagem de que pode ser realizada repetidamente no mesmo animal, possibilitando estudos longitudinais através da coleta de células de tumores e órgãos/tecidos ao longo da doença. Além do que a microscopia rotineira, o material recuperado pode igualmente ser usado para o Immunocytochemistry, a microscopia de elétron, a análise bioquímica, a citometria do fluxo, a biologia molecular ou in vitro ensaios. A FNA tem sido utilizada para identificar o protozoário parasita Trypanosoma brucei nas gônadas de camundongos infectados, abrindo a possibilidade de um diagnóstico futuro em bovinos.

Introdução

A aspiração fina da agulha (FNA) é amplamente utilizada no diagnóstico do cancro e das doenças não-neoplásticas, ambos em animais humanos e domésticos. A técnica tem sido padronizada ao longo dos anos e é descrita em inúmeros livros didáticos^1,2.

Consiste, em grande parte, na aspiração percutânea de massas palpáveis, órgãos ou derrames com uma agulha fina montada sobre uma seringa vazia, utilizando a pressão negativa para retirar células ou fluidos da massa^1,3. As agulhas são tipicamente 22 a 25 G (calibre que corresponde ao diâmetro interno da agulha), e o uso de uma agulha maior do furo (grande diâmetro, por exemplo, 21 G) é útil aumentar o cellularity, embora este possa produzir a contaminação excessiva do sangue. Comprimento da agulha dependerá da profundidade da massa, mas 1 ou 11/2 polegadas é comumente usado para massas superficiais. As seringas são tipicamente 5 a 10 mL, com as seringas maiores que atingem o vácuo mais elevado, que aumenta por sua vez o rendimento aspirado. Massas profundas não palpáveis também podem ser aspiradas, com agulhas mais longas e orientação de imagem (ultrassonografia). O aspirado recuperado pode então ser manchado, ar seco, molhado-fixo, manchado e observado um microscópio para conseguir um diagnóstico³ (Figura 1).

Esta é uma técnica simples, barata, painless e mìnima invasora usada principalmente no ajuste pré-operativo para conseguir um diagnóstico em massas palpáveis e igualmente para órgãos, como nós de linfa, tiróide, próstata ou mesmo as estruturas reprodutivas masculinas externas ¹. além de ser uma ferramenta diagnóstica, esta técnica também pode ser utilizada para a coleta de células para outros fins, ou seja, citogenética, microscopia eletrônica (Figura 1D), caracterização citométrica de fluxo^{4,5 ,6,7, estabelecimento}de culturas de células⁸. Um exemplo comum na prática clínica é A recuperação de espermatozóides para fertilização in vitro⁹.

A aspiração pode ser repetida várias vezes na mesma massa para obter múltiplos esfregaços. Em caso de lesão heterogênea, por exemplo, uma área sólida e um espaço cístico, é importante que as células sejam aspiradas de cada região. O material coletado pela FNA é em geral altamente celular, que na maioria dos casos permite o diagnóstico de doenças sem a necessidade de uma biópsia tecidual. Manchas especiais, imunofluorescência. Immunocytochemistry (Figura 1D), e as técnicas moleculars podem igualmente ser executadas nas manchas obtidas através de Fna, por exemplo, para a identificação de agentes infecciosos quando não reconhecíveis pela morfologia sozinho¹⁰. Uma breve visão geral das aplicações gerais e dos equipamentos e suprimentos necessários para a FNA estão resumidas nas tabelas 1 e 2, respectivamente.

O primeiro relatório no uso da punctura da agulha para finalidades diagnósticas é descrito em escritas adiantadas da medicina árabe, mas é no início do século XX que as técnicas modernas da aspiração da agulha foram executadas¹¹. Notavelmente, talvez o primeiro relato que sugere o uso da FNA para o diagnóstico de doenças infecciosas foi um estudo em 1904, onde Grieg e Gray relataram que as aspirações da agulha de linfonodos de pacientes com doença do sono revelaram tripanossomas motile¹² . Os autores relataram a presença de tripanossomas em casos precoces e avançados, e em maior densidade do que o observado em esfregaços sanguíneos, onde estes são frequentemente raros eventos¹².

O diagnóstico atual de tripanossomíase em bovinos depende da observação direta de parasitas no sangue, linfa ou em técnicas imunodiagnósticas^13,14,15. Nós mostramos previamente que em infecções experimentais de Trypanosoma no rato, o brucei de Trypanosoma (T. brucei) tem um tropismo notável ao tecido adiposo¹⁶ e também a algumas das estruturas reprodutivas masculinas externas, ou seja, epidídimo¹⁷. Os parasitas se acumulam no estroma desses tecidos em grandes números¹⁶.

O protocolo descrito abaixo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo para a FNA em camundongos vivos, visando a aspiração de tripanossomas presentes nas estruturas reprodutivas masculinas externas (testículos, epidídimo e gordura epididimérmica), seguidas por citologia convencional e imunocoloração para proteínas parasitas específicas (VSG)^16,17. A aspiração foi realizada 6 dias após a infecção e os procedimentos de segurança que se aplicam são aqueles comumente estabelecidos para manuseio rotineiro de animais experimentais. Medidas adicionais são necessárias para os animais que têm deficiências imunes (vestindo um vestido esterilizado a vapor, máscara, capota de cabelo, luvas estéreis, e garantir a técnica asséptica em todos os momentos) para mitigar a exposição acidental a patógenos oportunistas.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste protocolo foram realizados de acordo com a regulamentação da UE e aprovados pelo Comitê de ética animal do Instituto de medicina molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). A facilidade animal do iMM cumpre com a lei portuguesa para a utilização de animais de laboratório (Decreto-lei 113/2013) e segue a Diretiva Europeia 2010/63/UE e as diretrizes da FELASA (Federação das associações de Ciências dos animais de laboratório europeu) e recomendações relativas ao bem-estar dos animais de laboratório.

1. aspiração de parasitas dos órgãos reprodutivos masculinos externos do rato

Nota: A aspiração fina da agulha (FNA) foi executada em ratos machos do selvagem-tipo C57BL/6J, 6 a 10 semanas velhas, infectadas com o T. brucei através da injeção intraperitoneal de 200 μl do soro fisiológico com 2.000 parasita como descrito previamente¹⁶.

1. Para a FNA dos órgãos reprodutivos masculinos externos, coloque o rato numa capa de fluxo laminar, Anestesie o animal com uma injecção intraperitoneal de 200 μL de uma mistura de 75 mg/kg de cetamina + 1 mg/kg de medetomidina em soro fisiológico.
   1. Confirme a anestesia com o método de pinça do dedo do pé. Quando o reflexo da retração da perna está ausente, posicione o mouse na recumbência dorsal (Figura 2a).
   2. Palpar com cuidado o testis, avaliando o tamanho e a distância da pele sobrejacente. Contenha o órgão entre o índice e o dedo médio ou entre o dedo indicador e o polegar. Esticar a pele sobrejacente firmemente através da massa para imobilizar ainda mais o alvo. Limpe a superfície com toalhetes de álcool (Figura 2a).
   3. Segure a agulha montada de 22 G e a seringa de 5 mL e insira a ponta da agulha no alvo, sempre com o êmbolo no estado restante (Figura 2b-C).
   4. Aplique a sucção retirando o êmbolo da seringa para a marca de 4 mL a 5 mL 2-3 vezes. Redirecionar a agulha dentro do órgão em uma linha reta ou ao longo de várias tangentes diferentes para aumentar a probabilidade de uma amostra representativa e de segmentação de estruturas menores, como o epidídimo. Certifique-se de que este procedimento é delicado, para minimizar o dano tecidual (Figura 2C-D).
   5. Solte a sucção e, em seguida, retire a agulha. Não redesenhe a agulha com o êmbolo recolhido, pois isso levará à aspiração do aspirado para o tambor da seringa e impedirá a sua recuperação (Figura 2e). Após a retirada da agulha, controle qualquer sangramento aplicando pressão com uma esponja de gaze esterilizada no local da punção.
   6. Desligue a seringa da agulha, encha-a com ar, volte a ligar a agulha e retire suavemente o conteúdo da agulha para uma lâmina. Coloque a ponta da agulha muito perto ou até mesmo na corrediça para evitar o splattering (Figura 2F-I).
   7. Realize pelo menos uma aspiração adicional por órgão/animal para garantir a amostragem de repetição.
   8. Reverter a anestesia com uma injeção subcutânea de 200 μL de 1 mg/kg de Atipamezol em soro fisiológico e devolver animais à sua gaiola de repouso para recuperação e observar até à recuperação total.

2. preparação do esfregaço do material aspirado

Nota: Use luvas durante todo o procedimento e assegure a eliminação segura das agulhas e das seringas.

1. Dois passos puxar método
   1. Pegue o slide que tem a gota do aspirado usando a mão não dominante, e aperte a extremidade fosco entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3a).
   2. Pegue um segundo slide limpo, o slide propagador, com a mão dominante e trazê-lo através do primeiro slide com a gota do aspirado. Coloque a borda limpa e Lisa da lâmina na lâmina da amostra, apenas na parte superior da gota, em um ângulo de aproximadamente 30 ° (Figura 3B).
   3. Deslize o slide para a frente com um movimento leve, contínuo e constante para obter um filme fino (Figura 3C).
   4. Descanse a corrediça e permita a secagem de ar completa e rápida do material (Figura 3D). Não aqueça-fixe. Rotule a borda geada do slide com um lápis.
      Nota: O protocolo pode ser pausado nesta etapa e os esfregaços podem ser armazenados indefinidamente até que estejam prontos para ser manchados.

3. coloração dos esfregaços

Nota: Use luvas durante todo o procedimento e assegure-se de que as etapas 3.1.4 e 3.2.9 estejam executadas dentro de uma capa das emanações.

1. Protocolo de coloração de Giemsa
   1. Fixar manchas secas ao ar, imersando as lâminas em um frasco de Coplin contendo 100% de metanol por 5 min (Figura 3E).
   2. Transfira o slide para um frasco de Coplin contendo 20% de solução de Giemsa (diluída para 1/5 em água destilada) por 30 min, ou 10% de Giemsa por 10 min (Figura 3F).
   3. Enxágüe em água da torneira e seque cuidadosamente usando papel tissue para DAB.
   4. Segure o slide horizontalmente e aplique uma gota do meio de montagem não aquoso no esfregaço. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, abaixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.
2. Immunocytochemistry em esfregaços de FNA
   1. Fixar esfregaços secos a ar em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Lave a corrediça por 5 minutos em um frasco de Coplin com tampão de fosfato 1x (PBS), repetindo este passo 3 vezes usando o PBS 1x fresco cada vez.
   3. Retire a corrediça do frasco de Coplin, limpe o amortecedor adicional sem tocar na mancha e desenhe um círculo em torno do esfregaço com uma caneta repelente de água (tabela de materiais).
   4. Segure o slide horizontalmente e aplique 150 μL de solução de anticorpo primário diluído em cada esfregaço e incubar por 1 h à temperatura ambiente.
      Nota: O anticorpo preliminar usado aqui é um antígeno não-purified do soro do coelho anti-t. brucei VSG13 (Cross-Reactive com muitos t. brucei vsgs, produzidos em casa), diluído em 1X PBS em 1:50000. Executar controles negativos, substituindo o anticorpo primário apropriado com soro pré-imune (tabela de materiais) para permitir a avaliação da ligação não específica do anticorpo secundário.
   5. Lave a corrediça por 5 minutos em um frasco de Coplin com 1X PBS, repetindo esta etapa 3 vezes usando o PBS 1x fresco cada vez.
   6. Segure o slide horizontalmente e aplique 150 μL de sistema de visualização peroxidase/DAB de rábano disponível comercialmente para cada esfregaço. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (tabela de materiais).
   7. Lave por 3x por 5 min em 1X PBS.
   8. Contratura por imersão das lâminas em um frasco de Coplin contendo Harris hematoxilina. Enxágüe em água da torneira e seque cuidadosamente usando papel para DAB.
   9. Segure o slide horizontalmente e aplique uma gota do meio de montagem não aquoso no esfregaço. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, abaixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.

Resultados

A PAAF foi realizada nos órgãos reprodutivos externos masculinos de camundongos infectados com T. brucei usando uma agulha de 22 G acoplada a uma seringa de 5 ml e lâminas de vidro para a preparação do esfregaço (Figura 1a-C). O método é simples mas os resultados óptimos confiam em etapas críticas: a imobilização perfeita do rato conseguida com a anestesia geral, e a estabilização dos órgãos durante todo o procedimento inteiro (Figura 2a-B). A sucção foi aplicada 2-3 vezes e a agulha redirecionada 1-2 vezes para permitir a amostragem representativa dos órgãos e dos tecidos menores: epidídimo e gordura epididimal. A pressão negativa foi liberada antes de externalizar a agulha. O aspirado contido no lúmen e no cubo da agulha (aproximadamente 20 μL), foi utilizado para produzir 2 esfregaços (Figura 3a-C). Nos casos em que a agulha foi retirada sem a liberação da sucção, o material foi sugado para dentro da seringa e não foi recuperável. O processo foi repetido com sucesso duas vezes, um para cada órgão emparelhado. Após a secagem, esfregaços foram molhados-fixos e Immunocytochemistry para as proteínas de superfície do tripanossoma foi executado.

Um esfregaço de boa qualidade (figura 4a-C) foi caracterizado por uma monocamada de células com boa densidade celular, em que as células hospedeiras apresentam características morfológicas preservadas, permitindo a identificação de seu tecido de origem e relativa proporção entre si. Os parasitas foram eficientemente imuno-manchados, identificáveis e contáveis (Figura 4B). Um exemplo de um FNA de uma efusão peritoneaa em um rato contaminado, manchado com Giemsa para a observação direta e o diagnóstico, é mostrado igualmente (Figura 3D-F e Figura 4C).

Um resultado pobre ou negativo de FNA pode ser devido às razões diferentes: (1) demasiado pouco material de FNA é expressado na corrediça e é subrepresentante da amostra; (2) muito material de FNA é expressado em um único slide, fazendo manchas excessivamente grossas e prejudicando a avaliação citológica; (3) demasiada força é aplicada ao fazer o esfregaço, e as células são interrompidas, resultando em um monte de núcleos nus e raias de DNA (artefato esmagamento); ou (4) não se aplica força suficiente ao fazer o esfregaço e as células não se desagregam, resultando em uma camada estratificada que impede a avaliação das características morfológicas das células (Figura 5).

Quando comparamos a Citopatologia da FNA com a histopatologia, ou seja, a análise de células versus tecidos, o punho tem a vantagem de que a morfologia celular é melhor preservada e as proporções relativas e a contagem das células podem ser melhor avaliadas (Figura 6). Além disso, o Immunocytochemistry é mais simples, mais rápido e mais fácil de aperfeiçoar do que Immunohistochemistry, que é executado tipicamente no tecido formalin-fixado e parafina-encaixado.

Alvo	Aplicativos	Vantagens	Limitações
Massa palpável	Microscopia de rotina, diagnóstico	Simples, rápido	Nenhuma arquitetura do tecido
Órgão	Immunohistochemistry	Baixo custo	Aspiração cega (a agulha pode faltar alvo tangencialmente; a aspiração pode segmentar áreas necróticas, císticas ou hemorrágicas)
Efusões	Citometria de fluxo	Amostragem de vários sites
	Citogenética	Morfologia celular bem preservada
	Microscopia eletrônica	Livre de complicações
	PCR, outras técnicas moleculares	Exatidão diagnóstica elevada
	Análise bioquímica	Anestesia (para imobilização)
	Ensaios in vitro, cultura celular	Procedimento não terminal

Tabela 1: alvo, aplicações gerais, vantagens e limitação da aspiração fina da agulha.

Kit FNA	Archetype de uma agulha e de uma seringa da aspiração
Aspiração:	Peças da agulha:
1. seringas plásticas descartáveis (5 ou 10 mL) (Figura 1b)	Chanfro. A ponta do eixo da agulha é inclinada para dar forma a um ponto, a inclinação que é o chanfro. Somente as agulhas chanfradas são apropriadas para aspirações percutaneous.
3. agulhas de 22 a 25-gauge (diâmetro); 0,75, 1,0, 1,5 polegadas de comprimento, com borda chanfrada padrão da ponta da agulha (Figura 1a)	Eixo. Porção tubular oca da agulha cujo comprimento pode ser ajustado de acordo com a profundidade da massa. O calibre da agulha corresponde ao diâmetro de seu furo, que é o diâmetro do interior do eixo (as agulhas menores têm um calibre mais elevado). O uso de agulhas maiores do furo (menos de 22 G) é útil aumentar o cellularity, embora este possa produzir a contaminação iatrogênica excessiva do sangue.
1. anestesia (se necessário). A dor associada à PAAF é semelhante à de punção venosa, porém, boa aspiração requer boa imobilização do sujeito, especialmente importante em animais de pequeno porte e/ou para lesões e órgãos pequenos e flutuantes. Ratos e camundongos sujeitos à PAAF devem ser adequadamente restrinados passivamente, ou, quando necessário, sedados ou anestesia geral leve.	Hub. Porção plástica da agulha que está presa à seringa; deve ser transparente para permitir a visualização do material aspirado. O material aspirado obtido durante a PAAF deve ser coletado no eixo da agulha e a aspiração interrompida quando o material é visto entrando no cubo.
Tomada e interpretação da mancha de FNA:	Peças da seringa:
1. fosco final microscópio de vidro slides (Figura 1C)	Tambor/cilindro. Porção oca da seringa. A menos que lidar com lesões císticas ou derrames, o material que é aspirado para o barril geralmente não pode ser recuperado. O volume ideal de aspirado para a citologia de FNA é aproximadamente 5 μL, correspondendo ao volume médio de aspirado que ocupa o eixo e o cubo da agulha.
2. romanowsky manchas tipo (por exemplo, diff-Quik, Giemsa)	A gorjeta. Fim do barril ao qual o cubo da agulha está anexado.
3. microscópio (brilhante-campo)	Êmbolo. Porção móvel da seringa que tem um disco liso ou lábio em uma extremidade e um selo de borracha na outra extremidade. Cabe no tambor e fornece a pressão para desenhar as células, fluido na agulha. Um êmbolo perfeitamente selado que cria uma boa pressão negativa é obrigatório para obter um bom rendimento aspirado.

Tabela 2: equipamentos e suprimentos necessários para a aspiração de agulhas finas.

Figura 1 : Ferramentas e resultados para a aspiração fina da agulha. (A) o diâmetro ideal da agulha para Fna é de 22 a 25 G. (B) o volume ideal da seringa para obter um bom rendimento aspirado é de 5 a 10 ml. (C) Limpe, seque, livre da corrediça de vidro da graxa com área geada da marcação para escrever com lápis e pre-coated (se para immunohistochemistry). (D) exemplo de Trypanosomes observado com coloração de Giemsa (ponta de seta preta), imunomanchada para as proteínas superficiais do VSG (ponta de seta branca) e microscopia eletrônica de transmissão (seta de bloqueio). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Esquemas que mostram a aspiração fina da agulha (Fna) dos órgãos reprodutivos masculinos externos (testis, epididymis, e gordura epididimal) nos ratos. (A) uma vez que o animal é fixado, o instrumento de aspiração previamente montado é recolhido. (B-C) Insira a ponta da agulha no órgão alvo. (D) Aplique a sucção retraindo o êmbolo da seringa para a marca de 1 ml a 2 ml, repetidamente 3-4 vezes. A ponta da agulha pode igualmente ser movida para a frente e para trás dentro do alvo ao aplicar a sucção, para coletar o suficiente material. (E) Solte a sucção e retire a agulha. (F) Retire a agulha da seringa e (G) Puxe o êmbolo para trás. (H) volte a colocar a agulha. (I) expelir o material sobre uma lâmina de vidro empurrando o êmbolo rapidamente através da seringa. A fim evitar splattering, assegure-se de que a ponta da agulha descanse muito perto ou mesmo na corrediça. A gota do aspirado é coloc aproximadamente 1 cm da borda da área geada da marcação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Preparação e coloraçãoda mancha. (A) Segure uma extremidade do slide (área fosco) entre o polegar e o dedo indicador. (B) Coloque a borda limpa lisa de uma segunda corrediça (propagador) na corrediça da amostra apenas na frente da gota do material. (C) deslize a propagação para a frente uma vez com velocidade moderada para obter um filme fino. (D) permita que a corrediça seque e rotule a borda geada da corrediça com um lápis. (E) após a correção de secagem completa com metanol por 5 min. (F) mancha com solução de Giemsa 20% por 30 min (ou 10% Giemsa por 10 min). Enxague levemente com água, seque completamente, mergulhe no xileno e montado com um agente de montagem insolúvel em água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Microfotografias de esfregaços obtidos de PAAF de estruturas reprodutivas masculinas externas em camundongos infectados com T. brucei. (A) aparência bruta de um esfregaço direto de boa qualidade: o material foi expresso no slide a aproximadamente 1 cm de distância da borda fosco (ponto preto), manchado e parado 0,5 cm antes da borda do slide (linhas paralelas). (B) Immunocytochemistry para as proteínas de superfície do parasita (VSG) foi executado para os esfregaços obtidos de Fna dos órgãos reprodutivos masculinos externos no dia 6 da infecção. Numerosos parasitas (Arrowhead) foram detectados misturados com células germinativas do camundongo (seta). DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 40x (barra de escala = 50 μm). (C) Giemsa-coloração do esfregaço obtido após a PAAF de uma efusão peritoneal no dia 21 da infecção, mostrou numerosos parasitas (Arrowhead) misturados com células hospedeiras (camundongo), neste caso, células inflamatórias, macrófagos (seta) e linfócitos. Ampliação original: 40x (barra de escala = 50 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Má qualidade esfregaços de Fna. (A) esfregaço mal celular, subrepresentante da massa ou órgão. (B) esfregaço muito espesso. (C) artefato esmagado, com células interrompidas, núcleos nus e estrias de DNA. (D) agregados e camadas estratificadas de células. DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 20x (barra de escala = 100 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Comparação da citologia epididimérmica e histologia em camundongos infectados com T. brucei. (A) microfotografias correspondentes a um esfregaço da Fna e (B) uma seção de parafina de 4 μm, na mesma ampliação (ampliação original de 20x, barra de escala = 100 μm), ambas imunomanchadas para as proteínas superficiais do parasita (VSG). O esfregaço mostrou grande número de parasitas (Arrowhead) com morfologia celular bem preservada, misturado com números moderados de células germinativas e poucos espermatozóides (seta). A seção histológica mostrou uma arquitetura bem preservada do tecido, compor dos dutos epididimal com espermatozóides intraluminal (seta), e a presença de um grande número parasitas que expandem o estroma epididimal (Arrowhead). DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 20x (barra de escala = 100 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A aspiração fina da agulha (FNA) é um método amplamente utilizado para diagnosticar a doença em animais humanos e domésticos. A técnica tem sido padronizada ao longo de muitos anos^{1,2, o}que faz uso de uma agulha de pequeno furo para aspirar células ou fluidos de uma massa palpável ou órgão^1,3. O aspirado é então tipicamente manchado em uma corrediça de vidro e manchado para a observação microscópica para conseguir um diagnóstico, mas a técnica pode igualmente ser usada para recuperar pilhas para outras finalidades^{4,5,6, 7} anos de ^{, 8} . º ^, a ⁹.

O procedimento é rápido (< 5 min por mouse, para um pesquisador experiente) e o risco de complicações é mínimo, semelhante ao risco incorrido quando submetido a punção venosa simples. Por esta razão, para FNA de massas palpáveis, a anestesia é exigida somente para posições anatômicas sensíveis ou quando uma boa imobilização do animal e a estabilização do órgão ou da massa a ser aspirada são extremamente cruciais para resultados os melhores. Isto é freqüente para animais pequenos do laboratório, como a contenção segura e eficaz de um roedor pequeno com uma mão ao assegurar o melhor acesso à área para a aspiração com a outra mão, é difícil de conseguir sem anestesia. A anestesia de curto prazo é, na maioria dos casos, suficiente, no entanto necessário, para uma boa FNA no mouse. Uma boa imobilização maximiza as chances de obter um aspirado que é representativo dos componentes celulares da lesão e também minimiza as chances de externalizar a ponta da agulha enquanto a pressão negativa é aplicada.

Embora o procedimento em si seja muito simples, a aplicação coordenada e a liberação de vácuo são as etapas mais críticas. Após a inserção da agulha, o êmbolo da seringa é retraído para conseguir um vácuo controlado (sucção), e a agulha só pode ser removida da massa depois de liberar a pressão negativa, deixando ir do êmbolo (Figura 2); caso contrário, o aspirado é sugado para o barril da seringa e, em seguida, é muito difícil de recuperar. Outro passo muito importante é a preparação de esfregaços de alta qualidade. Existem vários métodos para fazer um esfregaço, mas independentemente do método, esfregaços devem ser preparados imediatamente após o material foi colocado sobre o vidro. O material biológico deve ser espalhado suavemente para evitar artefatos de esmagamento de células. O uso de uma lamínula como propagador pode ajudar a evitar esses artefatos. No entanto, a aplicação de demasiada força ao fazer o esfregaço vai quebrar a lamínula. Uma mancha da boa qualidade tem tipicamente a maioria da população da pilha distribuída como o monocamada de modo que possam facilmente transmitir a luz. O material celular não deve ser excessivamente preso no coágulo sanguíneo.

O objetivo de uma FNA é coletar células de uma massa, tecido ou órgão. O uso de agulhas maiores do furo é útil aumentar o cellularity, mas pode ser associado com a contaminação excessiva do sangue, quando a amostragem com agulhas menores rende uma qualidade mais elevada, embora o material menos abundante. No nosso caso, a aspiração percutânea das estruturas reprodutivas masculinas externas em camundongos infectados experimentalmente com T. bruceifoi realizada com agulhas de calibre 22 acopladas a uma seringa de 5 ml. Os camundongos foram anestesiados, o testis foi estabilizado com uma mão e punção e aspiração guiada e realizada com a outra mão. Foram recuperados numerosos tripanossomas misturados com células germinativas, espermatozóides, células epiteliais e células estromais, que foram manchadas e imunomanchadas para as proteínas superficiais dos parasitas (VSG) (Figura 4).

Há sempre o erro potencial da amostragem nos aspirados produzindo resultados negativos porque embora as áreas múltiplas de uma lesão dada possam ser amostradas várias vezes, esta é uma aspiração cega onde nós não visualizamos a ponta da agulha e o órgão ou a massa do alvo. Isto é extremamente relevante em um ajuste clínico, onde um Fna negativo de uma lesão suspeita não evitar umas investigações mais adicionais, mas não é tão relevante em modelos animais da doença. Assim, as limitações gerais incluem principalmente resultados falsos negativos, e menos freqüentemente resultados falsos positivos (por exemplo, da contaminação do sangue), mas a limitação a mais importante no ajuste da experimentação animal é a falta da informação no tecido arquitetura¹⁷, como temos com histopatologia, por exemplo, padrão de distribuição de parasitas, de células imunes e características de interação celular-célula. No entanto, as vantagens são de que a PAAF é um procedimento não terminal que permite a amostragem repetida no mesmo animal ao longo do tempo e sempre possibilita uma melhor morfologia celular preservada (Figura 5). Alternativas para a FNA para a colheita de células hospedeiras, células imunes ou microrganismos de um rato sempre dependem de eutanizar o rato para recolher a massa ou órgãos de interesse.

A nosso conhecimento, há somente alguns relatórios no uso de Fna em animais pequenos do laboratório, um de 1949 que corresponde à aspiração da medula com a agulha de 22 G para estudar o hematopoiese¹⁸, e todo o outro em combinação com a citometria do fluxo a quantificar células inflamatórias associadas ao tumor ou células endoteliais^7,19,20. Nosso trabalho mostra que esta técnica pode ser estendida ao diagnóstico e ao estudo de modelos infecciosos da doença e pode combinar a citologia com as técnicas como o Immunocytochemistry ou a microscopia de elétron. Duas das principais vantagens do método em animais experimentais são: (1) este procedimento não é terminal, ou seja, pode ser realizado em camundongos vivos; e (2) devido à sua gravidade leve, permite aspirações seriais no mesmo animal. Portanto, menos camundongos são necessários para cada estudo, e a correlação entre progressão da doença clínica e evolução das características celulares e moleculares de uma doença e/ou microrganismo pode ser facilmente realizada, possibilitando estudos longitudinais.

Talvez o primeiro relato sobre o uso da FNA para diagnosticar doenças infecciosas seja um estudo de Grieg e Gray em 1904 que relata aspirações de agulhas de linfonodos de pacientes com doença do sono, que revelaram tripanossomas motile¹². Se nossos achados em camundongos laboratoriais encontrarem tradução para bovinos, ou seja, se o Trypanosoma pode ser facilmente amostrado pela Fna a partir das estruturas reprodutivas masculinas externas, pode-se esperar que essa técnica seja útil para os veterinários para o diagnóstico de animais tripanossomose na fazenda, no gado.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL)	Bio 2	7418046	Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1)	VWR	631-0664	Smear making
DAB	Dako	K3468	Immunocytochemistry
Entellan (500 mL)	VWR	1.07961.0500	Mounting media
Envision Flex antibody diluent	Dako	8006	Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit)	Dako	K4010	Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer	Dako	K8007	Immunocytochemistry
Giemsa stain	Atom Scientific Ltd	RRSPSS-A	Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus)	VWR	631-9483	Smear making
Harris Haematoxylin	Bio-optica	05-06004E	Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution	Sigma	H1009-500ML	Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23G)	Henry Schein	902-8001	Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1000 - 10 mL)	Bio 2	7410928	Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL)	Bio 2	7418335	Anesthesia
Methanol	Merck	1.06009.2511	Smear fixative
Pap pen	Merck	Z377821-1EA	Immunocytochemistry
Protein Block Serum free	Dako	X0909	Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL)	Henry Schein	900-3311, 900-3304	Aspiration technique