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Resumo

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

Resumo

As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias. Como muitos outros tipos de células, os ESCs liberam pequenas vesículas de membrana, como exosomos, para o ambiente extracelular. Os exosóis servem como mediadores essenciais da comunicação intercelular e desempenham um papel básico em muitos processos (patho)fisiológicos. O fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) funciona como uma citocina para modular a resposta imune. A presença de GM-CSF em exosóis tem o potencial de aumentar sua função imuno-regulatória. Aqui, GM-CSF foi expressado na linha de células ESC murina ES-D3. Um protocolo foi desenvolvido para isolar vesículas extracelulares supercelulares (EVs) de células ES-D3 superexpressas GM-CSF. EVs isolados enriquecidos com exosome foram caracterizados por uma variedade de abordagens experimentais. É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram encontradas presentes em EVs exosome enriquecidos. No geral, os EVs exosóicos enriquecidos por GM-CSF dos ESCs podem funcionar como vesículas livres de células para exercer suas atividades imuno-reguladoras.

Introdução

Os ESCs são derivados do estágio blastocisto de um embrião de pré-implantação1. Como células-tronco pluripotentes, os ESCs têm a capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em qualquer tipo de célula embrionária. Devido ao seu notável potencial de desenvolvimento e capacidade proliferativa a longo prazo, os CES são extremamente valiosos para a pesquisa biomédica1. Os esforços atuais de pesquisa têm se concentrado em grande parte no potencial terapêutico das ESCs para uma variedade de doenças patológicas graves, incluindo diabetes, doenças cardíacas e doenças neurodegenerativas2,3,4.

As células mamíferas, incluindo os ESCs, são conhecidas por liberar vesículas com tamanhos variáveis para o ambiente extracelular, e esses EVs possuem muitas funções fisiológicas e patológicas devido ao seu papel na comunicação intercelular5. Entre diferentes subtipos de EVs, exósmos são pequenas vesículas de membrana liberadas de vários tipos de células para o espaço extracelular após a fusão de compartimentos endocíticos intermediários, corpos multivesiculares (MVBs), com a membrana plasmática6. Exosomos têm sido relatados para mediar a comunicação intercelular e estão criticamente envolvidos em muitos processos (patho)fisiológicos7,8. Exosomos herdam algumas funções biológicas de suas próprias células parentais, porque exosomos contêm materiais biológicos adquiridos a partir do citosol, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. Assim, os antígenos ou fatores associados que estimulam a resposta imune específica para uma determinada doença são encapsulados nos exossomos de determinados tipos de células9. Isso abriu caminho para testes clínicos explorando exosóis derivados de tumores como uma vacina anticâncativa10.

GM-CSF é uma citocina secretada por diferentes tipos de células imunes11. Evidências emergentes demonstram que o GM-CSF ativa e regula o sistema imunológico e desempenha um papel essencial no processo de apresentação de antígenos12. Por exemplo, um relatório clínico sugere que o GM-CSF estimula a resposta imune aos tumores como adjuvante da vacina13. Várias estratégias de imunoterapia contra o câncer baseadas em GM-CSF para explorar a potente atividade imuno-estimulante do GM-CSF têm sido investigadas em ensaios clínicos14. Entre elas, uma vacina contra o câncer composta por células tumorais irradiadas de GM-CSF tem mostrado alguma promessa em pacientes com melanoma avançado, induzindo respostas de antitumorais celulares e humorais e necrose subsequente em tumores metástases15.

Como os exosóis derivados de ESCs possuem atividades biológicas semelhantes às ESCs originais, talvez exosósmos portadores de GM-CSF de ESCs possam funcionar como vesículas livres de células para regular a resposta imune. Neste artigo, é descrito um método detalhado para produzir EVs exossome enriquecidos de alta qualidade de ESCs expressando GM-CSF. Esses EVs exosome enriquecidos têm o potencial de servir como vesículas imuno-regulatórias para modular a resposta imune.

Protocolo

1. Culturing células ES-D3

  1. Para gerar soro bovino fetal livre de exosome (FBS), carregue FBS em uma ultracentrifuagem e centrífuga a 100.000 x g por 16 h a 4 °C. Após a centrifugação, colete o supernante soro como FBS sem exosome para a cultura da linha celular ES-D3 e a aquisição de EVs enriquecidos com exosomos.
  2. Antes de emplacamento das células ES-D3, cubra pratos de cultura tecidual de 15 cm usando gelatina (0,1%) à temperatura ambiente por 30 minutos.
  3. Seguindo um protocolo descrito anteriormente16,cultura as células ES-D3 sem células de camada alimentador nos pratos de cultura tecidual revestidos de gelatina de 15 cm. O meio de cultura celular ES-D3 é composto por DMEM, FBS livre de exosome (15%), aminoácidos não essenciais (0,1 mM), L-glutamina (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e fator inibidor de leucemia (LIF; 100 unidades/mL). Cultura Células ES-D3 a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2.
  4. Uma vez que as células ES-D3 atinjam cerca de 90% de confluência em pratos de cultura tecidual de 15 cm, remova o meio por aspiração. Lave as células usando trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) aos pratos e incubar a 37 °C por 5 min. Pegue as células dos pratos.
  5. Adicione meio de cultura fresco (5 mL) às células coletadas para inativar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspenda as células em meio fresco e determine o número de células usando um hemócito.
  6. Para células passantes, emplaque as células ES-D3 (5 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) e cultura por 3 dias antes de subculturar as células.
  7. Para coletar a cultura celular supernante para isolamento de EVs enriquecidos com exosome, emplaque as células ES-D3 (1 x 107) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) por 3 dias antes de coletar a cultura celular supernadente.

2. Geração de plasmídeo de expressão GM-CSF

NOTA: Gere a transfecção plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CSF em células ES-D3. Neste plasmídeo, a expressão de murine GM-CSF cDNA juntamente com a proteína marcador humanizada Renilla reniformis GFP (hrGFP) é impulsionada pelo fator de alongamento da cadeia de polipeptídeo humano 1α (EF1α) promotor17,18.

  1. Gere a espinha dorsal do vetor.
    1. Digerir o pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg de DNA) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C por 2 h para gerar dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,0 kb) e a inserção FD3ER (2,5 kb).
    2. Transfira 50% do DNA plasmídeo digerido (10 μg) em um tubo de microcentrifuso de 1,5 mL e trate com fosfattase alcalina (20 unidades) a 37 °C por 1 h. Resolva o DNA não tratado e desfosforilado usando eletroforese de gel agarose (2%).
    3. Purificar os fragmentos de DNA da coluna vertebral vetorial (6,0 kb) usando um kit de extração de gel de DNA . Enquanto a espinha dorsal vetorial não tratada servirá como vetor vazio (pEF1α-IRES-hrGFP), a espinha dorsal vetorial desfosforilada será usada para gerar plasmídeos expressos gm-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-HRGFP).
  2. Gerar a inserção cDNA GM-CSF.
    1. Digerir a enzima plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C para produzir dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,5 kb) e a inserção cDNA murina GM-CSF (474 bp).
    2. Resolva o DNA digerido através da eletroforese de gel agarose (2%). Purifique o fragmento de cDNA murine GM-CSF (474 bp) usando um kit de extração de gel de DNA.
  3. Gerar a expressão plasmídeos.
    1. Configure 2 reações de ligadura (volume total de 10 μL) usando um kit de ligadura de DNA.
      1. Para gerar o bitor vazio pEF1α-IRES-hrGFP, ligar a espinha dorsal vetorial não tratada da etapa 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
      2. Para gerar pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligadurar os seguintes fragmentos de DNA: (1) a espinha dorsal vetorial defosfosfolada da etapa 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) e (2) o fragmento de cDNA mGM-CSF gerado na etapa 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. Ligate a 25 °C por 5 min. Transforme DNA ligado em células E. coli competentes DH5α. Emplaque as células E. coli transformadas em placas lb-ágar contendo carbenicilina (50 μg/mL).
    3. Purificar plasmídeos de colônias E. coli usando um kit de isolamento de DNA. Validar as identidades dos plasmídeos por sequenciamento de DNA.

3. Geração de células ES-D3 superexpressando GM-CSF

NOTA: Transfeito as células ES-D3 com o pEF1α-mGM-MGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CS. Cotransfecte o pBabe-Neo plasmídeo em células ES-D3 para facilitar a seleção de células transfectadas18,20.

  1. Transfeito os plasmídeos para as células ES-D3.
    1. Emplaque as células ES-D3 (1,4 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) 10 cm com meio cultura (10 mL) para transfecção. Células ES-D3 banhadas à cultura a 37 °C por 24 h.
    2. Prepare duas misturas de plasmídeos em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, controle vetorial) com pBabe-Neo (4 μg) e (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, expressando GM-CSF) com pBabe-Neo (4 μg). Realizar a transfecção usando um kit de transfecção seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Adicione o meio de transfecção (1 mL) e o reagente de transfecção (64 μL) a cada tubo contendo as misturas plasmidas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
    4. Adicione as misturas de transfecção aos respectivos pratos de 10 cm de células ES-D3. Incubar a 37 °C por 5 h.
    5. Substitua o meio em pratos de 10 cm por meio de cultura fresca (10 mL). Incubar a 37 °C por 24 h.
  2. Gerar populações em massa de células ES-D3 transfectadas.
    1. Remova o meio das células ES-D3 transfeinadas. Lave as células com trippsina (2 mL; 0,05%). Adicione trippsina (2 mL) e incubar a 37 °C por 5 min. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 2 mL de meio de cultura fresco para neutralizar a trippsina. Centrifugar a 390 x g por 5 min.
    2. Resuspend as células transfectadas em meio de cultura fresca (10 mL). Avalie a intensidade de fluorescência do GFP em células ES-D3 transfecidas usando a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Transfira as células transfeinadas em dois pratos de 10 cm contendo meio de cultura fresca (10 mL). Adicione neomicina (0,5 mg/mL) para eliminar células não traduzindo.
    4. Continue a cultivar as células transfeinadas em meio de cultura contendo neomicina (0,5 mg/mL). Quando o ES-D3 transfeinado atingir 90% de confluência, transfira as células para pratos de cultura tecidual de 15 cm novamente. Repita o procedimento por 2 semanas.
  3. Gerar clones de células ES-D3 transfectadas.
    1. Uma vez geradas populações em massa de células ES-D3 transfectadas, colecione as células como antes. Determine os números de células usando um hemócito. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspend as células (1 x 107 células/mL) em meio de cultura fresca.
    2. Filtre as células através de um coador celular estéril de 40 μm. Purifique as células ES-D3 soropositivos usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Emplaque uma única célula ES-D3 classificada em um poço de uma placa de cultura de tecido revestida de gelatina (0,1%) de 96 poços contendo células ES-D3 parentais (1 x 103) em meio livre de neomicina (200 μL). Co-culminar células ES-D3 transfectadas com suas contrapartes parentais não traduzindo garante que as células ES-D3 únicas transfectadas transfetam e se proliferam como um único clone.
    4. Cultue as células por 48 h e, em seguida, adicione neomicina (0,5 mg/mL) a placas de 96 poços para eliminar células ES-D3 não transtravas.
    5. Continue a cultivar as células ES-D3 GFP positivos em placas de cultura tecidual de 96 poços com neomicina média (0,5 mg/mL) durante 1 semana. Transfira linhas de células clonais ES-D3 para antenas de cultura de tecido de 6 cm com meio de cultura (5 mL) contendo neomicina (0,5 mg/mL) durante 1 semana.
    6. Determine a intensidade da fluorescência GFP em cada um dos clones de células ES-D3 transfectados usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante. Selecione os clones ES-D3 expressando GM-CSF ou o vetor vazio com altos níveis de fluorescência verde.
    7. Determine as quantidades de GM-CSF secretados por células ES-D3 usando um kit MURine GM-CSF ELISA, seguindo o protocolo do fabricante.

4. Isolamento de vesículas extracelulares enriquecidas por exosome

  1. Cultura as células ES-D3 (1 x 107) em pratos de cultura tecidual de 15 cm por 72 h a 37 °C. Recolher a cultura celular supernante. Loja coletada supernante a 4 °C até 1 semana para manter a integridade exosmal.
  2. Centrifugar a cultura celular supernacida a 5.000 x g por 60 min a 4 °C usando uma centrífuga para sedimentar grandes fragmentos celulares.
  3. Colete o supernatante e a centrífuga a 100.000 x g por 90 min a 4 °C usando uma ultracentrifuagem.
  4. Remova o supernatante. Enxágue suavemente cada pelota duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS; 1 mL) para remover a cultura residual sobrenatante.
  5. Resuspend cada pelota na PBS. Quantifique os EVs enriquecidos com exosome por seu teor deproteínas 5.
    1. Meça a concentração proteica de EVs exossome enriquecidos com um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA). O rendimento esperado de EVs exossome enriquecidos de células ES-D3 é de aproximadamente 4 μg de proteína/mL de supernanato da cultura celular. Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos em PBS (concentração de proteínas: ~6 μg/μL). Armazene os EVs enriquecidos com exososome a -80 °C.

5. Caracterização de vesículas extracelulares enriquecidas exóssomeas por microscopia eletrônica de transmissão

NOTA: Investigue a composição e a estrutura dos EVs enriquecidos com exosome isolados dos ESCs usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM)5.

  1. Fixar os EVs enriquecidos com exossome (3-5 μg/μL) com uma concentração final de paraformaldeído de grau EM de 2% à temperatura ambiente por 2 h.
  2. Carregar amostras fixas (10 μL) em redes de cobre com filme de suporte a carbono. Incubar as amostras com grades de cobre por 1 min e, em seguida, drenar as grades com papel filtro.
  3. Manche as grades com uma solução de coloração seguindo o protocolo do fabricante.
  4. Transfira as grades para um pedaço de papel filtro usando pinças. Deixe as grades secarem durante a noite à temperatura ambiente.
  5. Adquira imagens de microscopia eletrônica usando um microscópio eletrônico de transmissão (ampliação de 50.000x), seguindo o protocolo do fabricante.

6. Avaliação de vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela análise de manchas ocidentais

  1. Prepare extratos celulares inteiros.
    1. Remova o meio das células ES-D3 cultivadas em pratos de 15 cm. Lave as células com trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) às células. Incubar a 37 °C por 5 min. Colete as células e adicione meio de cultura fresco (5 mL) para neutralizar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspende as células na PBS.
    2. Determine números de células usando um hemócito. Centrifugar as células novamente a 390 x g por 5 min. Resuspengem as células no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo 0,5% de SDS (5.000 células/μL).
    3. Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.
  2. Prepare os lysates de EVs enriquecidos com exosomos.
    1. Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo SDS de 0,5% a uma concentração de 1,2 μg/μL.
    2. Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.
  3. Detecte proteínas por mancha ocidental.
    1. Carregar extratos celulares inteiros (10 μL; 5.000 células/μL) e lises EV enriquecidos com exosome (10 μL; 1,2 μg/μL) em cada poço de um gel de PÁGINA Bis-Tris (4-20%). Transfira proteínas para membranas de flúor de polivinilideno (PVDF).
    2. Incubar membranas com anticorpos primários e secundários apropriados. Anticorpos diluídos (nas concentrações indicadas abaixo) no tampão de manchas contendo PBS, Tween-20 (0,2%) e leite seco sem gordura (10% c/v).
      1. Use os seguintes anticorpos primários: anti-anexo V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromome c (100 ng/mL), isomerase anti-proteína dissulfeto (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) e anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
      2. Use os seguintes anticorpos secundários: anti-coelho de cabra conjugado peroxidase (20 ng/mL) e anti-rato conjugado por peroxidase (20 ng/mL).
    3. Detecte proteínas usando um kit de detecção de quimiominascência aprimorado.

7. Determinando concentrações GM-CSF em vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela ELISA

NOTA: Avalie as quantidades de GM-CSF em EVs exosome enriquecidos pela ELISA usando um kit para murine GM-CSF, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

  1. Cubra a placa ELISA com anticorpo de captura. Trate EVs enriquecidos com exosome (0,6 μg) apenas em PBS ou PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) em temperatura ambiente por 30 min. Adicione amostras tratadas à placa ELISA revestida e incubar à temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.
  2. Adicione anticorpo de detecção às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20. Adicione Avidin-HRP às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.
  3. Determine as concentrações de GM-CSF em EVs enriquecidos com exosomos medindo a absorvância a 450 nm em um leitor de microplacas.

Resultados

O GM-CSF é superexpresso em ESCs murine.
Para expressar de forma estável GM-CSF em células ES-D3, o cDNA murine GM-CSF foi clonado em um vetor de transfecção para gerar a expressão vetor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(Figura 1A). O GM-CSF foi superexpresso em células ES-D3 por transfecção, e cerca de 20% das células ES-D3 transitóriamente transfectadas foram GFP-positivos. Clones de células que expressam demais o GM...

Discussão

Este estudo mostra um método altamente eficiente de produção de EVs enriquecidos com exosomos carregando a proteína imuno-estimulante GM-CSF, que pode ser empregada para estudar os efeitos imuno-modulatórios de EVs enriquecidos com exosomos. Vários estudos sugerem que os exosóis exibem funções imuno-regulatórias e anti-tumores22. Assim, exosóis de ESCs expressando GM-CSF também podem possuir atividades biológicas que regulam a resposta imune. Neste protocolo, o exógeno murine GM-CSF ...

Divulgações

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li e John W. Eaton apresentaram um pedido de patente dos EUA "Composições que compreendem exosóis embrionários projetados derivados de células-tronco e métodos de uso dela".

Agradecimentos

Somos gratos ao Sr. Arkadiusz Slusarczyk e à Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imagens de microscópio eletrônico de transmissão. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline phosphate, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assayThermo Fisher23223Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher10177012Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLow speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLow speed centrifugation
Cu grids with carbon support filmElectron Microscopy SciencesFF200-CuAcquiring electron microscopy images
EcoRINew England BiolabsR0101Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection systemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonExamining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serumATCCSCRR-30-2020Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μmThermo Fisher22-363-547Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)Thermo FisherES006BCulturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory FactorThermo FisherESG1106Medium for ES-D3 cells
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher11668019Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XSBioTekDetermining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorterBeckman CoulterIsolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenerating GM-CSF expression plasmid
NeomycinThermo Fisher10-131-035Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acidsThermo FisherSH3023801Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milkThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062Transfecting ES-D3 cells
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycinVWRsc45000-652Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranesMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SGenerating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscopeHitachiHT7700Acquiring electron microscopy images
TrypsinVWR45000-660Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottleBeckman Coulter355622High speed centrifugation
UranyLess staining solutionElectron Microscopy Sciences22409Acquiring electron microscopy images

Referências

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