Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

Riepilogo

Questo studio descrive un metodo per isolare vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano fattori di stimolazione delle colonie di macrofagi dei granulociti immunostimoltori da cellule staminali embrionali.

Abstract

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule staminali pluripotenti in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule embrionali. Come molti altri tipi di cellule, le ESC rilasciano piccole vescicole di membrana, come gli esosomi, nell'ambiente extracellulare. Gli esosomi fungono da mediatori essenziali della comunicazione intercellulare e svolgono un ruolo fondamentale in molti processi (pato)fisiologici. Il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) funziona come una citochina per modulare la risposta immunitaria. La presenza di GM-CSF negli esosomi ha il potenziale per aumentare la loro funzione immuno-regolatoria. Qui, GM-CSF è stato stabilmente sovraespresso nella linea cellulare murina ESC ES-D3. È stato sviluppato un protocollo per isolare vescicole extracellulari (EV) arricchite di esosomi di alta qualità da cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF. I veicoli elettrici isolati arricchiti di esosomi erano caratterizzati da una varietà di approcci sperimentali. È importante sottolineare che quantità significative di GM-CSF sono risultate presenti nei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Nel complesso, i veicoli elettrici arricchiti di esosomi contenenti GM-CSF provenienti da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per esercitare le loro attività di immunoregolamentazione.

Introduzione

Le ESC sono derivate dallo stadio di blastocisti di un embrione preimpianto¹. Come cellule staminali pluripotenti, le SC hanno la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula embrionale. Grazie al loro notevole potenziale di sviluppo e alla capacità proliferativa a lungo termine, le SC sono estremamente preziose per la ricerca biomedica¹. Gli attuali sforzi di ricerca si sono in gran parte concentrati sul potenziale terapeutico delle ESC per una varietà di importanti disturbi patologici, tra cui diabete, malattie cardiache e malattie neurodegenerative^2,3,4.

Le cellule di mammifero, comprese le ESC, sono note per rilasciare vescicole di dimensioni variabili nell'ambiente extracellulare e queste EV possiedono molte funzioni fisiologiche e patologiche a causa del loro ruolo nella comunicazione intercellulare⁵. Tra i diversi sottotipi di EV, gli esosomi sono piccole vescicole di membrana rilasciate da vari tipi di cellule nello spazio extracellulare dopo la fusione di compartimenti endocitici intermedi, corpi multivesicolari (MVB), con la membrana^{plasmatica 6}. Gli esosomi sono stati segnalati per mediare la comunicazione intercellulare e sono criticamente coinvolti in molti processi (pato)fisiologici^7,8. Gli esosomi ereditano alcune funzioni biologiche dalle proprie cellule parentali, perché gli esosomi contengono materiali biologici acquisiti dal citosol, tra cui proteine e acidi nucleici. Pertanto, gli antigeni associati o i fattori che stimolano la risposta immunitaria specifica per una data malattia sono incapsulati negli esosomi di particolari tipi di cellule⁹. Ciò ha spianato la strada a studi clinici che esplorano gli esosomi derivati dal tumore come vaccino anti-cancro¹⁰.

GM-CSF è una citochina secreta da diversi tipi di cellule immunitarie¹¹. Prove emergenti dimostrano che GM-CSF attiva e regola il sistema immunitario e svolge un ruolo essenziale nel processo di presentazione dell'antigene¹². Ad esempio, un rapporto clinico suggerisce che GM-CSF stimola la risposta immunitaria ai tumori come adiuvante^{vaccinale 13}. Diverse strategie di immunoterapia del cancro basate su GM-CSF per sfruttare la potente attività immunostimolante di GM-CSF sono state studiate in studi clinici¹⁴. Tra questi, un vaccino antitumorale composto da cellule tumorali secrete di GM-CSF irradiate ha mostrato qualche promessa nei pazienti con melanoma avanzato inducendo risposte antitumorali cellulari e umorali e successiva necrosi nei tumori metastatizzati¹⁵.

Poiché gli esosomi derivati dalle ESC possiedono attività biologiche simili a quelli delle ESC originali, forse gli esosomi portatori di GM-CSF da ESC potrebbero funzionare come vescicole prive di cellule per regolare la risposta immunitaria. In questo documento, viene descritto un metodo dettagliato per produrre veicoli elettrici arricchiti di esosomi di alta qualità da ESC che esprimono GM-CSF. Questi veicoli elettrici arricchiti di esosomi hanno il potenziale per fungere da vescicole immunoregolatrici per modulare la risposta immunitaria.

Protocollo

1. Coltivazione di cellule ES-D3

1. Per generare siero bovino fetale privo di esosomi (FBS), caricare FBS in un ultracentrifuga e centrifuga a 100.000 x g per 16 ore a 4 °C. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante sierico come FBS privo di esosomi per la coltura della linea cellulare ESC murina ES-D3 e l'acquisizione di veicoli elettrici arricchiti di esosomi.
2. Prima di placcare le cellule ES-D3, rivestire piatti di coltura tissutale di 15 cm usando gelatina (0,1%) a temperatura ambiente per 30 minuti.
3. Seguendo un protocollo¹⁶precedentemente descritto, le cellule ES-D3 senza cellule dello strato di alimentazione nelle stoviglie di coltura tissutale di 15 cm rivestite di gelatina. Il terreno di coltura cellulare ES-D3 è composto da DMEM, FBS privo di esosomi (15%), amminoacidi non essenziali (0,1 mM), L-glutammina (2 mM), β-mercaptoetanolo (0,1 mM), penicillina (50 unità / mL), streptomicina (50 μg / mL) e fattore inibitorio della leucemia (LIF; 100 unità / mL). Coltura di cellule ES-D3 a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO_2.
4. Una volta che le cellule ES-D3 raggiungono circa il 90% di confluenza in piatti di coltura tissutale di 15 cm, rimuovere il mezzo mediante aspirazione. Lavare le cellule con tripsina (5 ml; 0,05%). Aggiungere la tripsina (5 ml) ai piatti e incubare a 37 °C per 5 min. Raccogli le cellule dai piatti.
5. Aggiungere il terreno di coltura fresco (5 ml) alle cellule raccolte per inattivare la tripsina. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risusciscere le cellule in mezzo fresco e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
6. Per le cellule che passano, placcare le cellule ES-D3 (5 x 10⁶) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 15 cm con terreno fresco (15 ml) e colturare per 3 giorni prima di soggioturare le cellule.
7. Per raccogliere il surnatante di coltura cellulare per l'isolamento di EV arricchiti con esosomi, placcare le cellule ES-D3 (1 x 10⁷) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 15 cm con mezzo fresco (15 ml) per 3 giorni prima della raccolta del surnatante di coltura cellulare.

2. Generazione di plasmidi di espressione GM-CSF

NOTA: Generare il plasmide di trasfezione pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP per sovraesprimere GM-CSF nelle cellule ES-D3. In questo plasmide, l'espressione del cDNA murino GM-CSF insieme alla proteina marcatore umanizzata Renilla reniformis GFP (hrGFP) è guidata dal promotore del fattore di allungamento della catena polipeptidica umana 1α (EF1α)^17,18.

1. Generare la dorsale vettoriale.
   1. Digerire il plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg di DNA) utilizzando l'enzima di restrizione EcoRI (100 unità) a 37 °C per 2 ore per generare due frammenti di DNA: la spina dorsale vettoriale (6,0 kb) e l'inserto FD3ER (2,5 kb).
   2. Trasferire il 50% del DNA plasmidico digerito (10 μg) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e trattare con fosfatasi alcalina (20 unità) a 37 °C per 1 ora. Risolvere sia il DNA non trattato che il DNA defosforilato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarose (2%).
   3. Purificare i frammenti di DNA della spina dorsale vettoriale (6,0 kb) utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA. Mentre la dorsale vettoriale non trattata fungerà da vettore vuoto (pEF1α-IRES-hrGFP), la dorsale vettoriale defosforilata verrà utilizzata per generare plasmide che esprime GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
2. Generare l'inserto cDNA GM-CSF.
   1. Digerire il plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP¹⁹ (20 μg) utilizzando l'enzima di restrizione EcoRI (100 unità) a 37 °C per 2 ore per produrre due frammenti di DNA: la spina dorsale vettoriale (6,5 kb) e l'inserto murino GM-CSF cDNA (474 bp).
   2. Risolvere il DNA digerito attraverso l'elettroforesi su gel di agarose (2%). Purificare il frammento murino di cDNA GM-CSF (474 bp) utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA.
3. Generare i plasmidi di espressione.
   1. Impostare 2 reazioni di legatura (10 μL di volume totale) utilizzando un kit di legatura del DNA.
      1. Per generare il vettore vuoto pEF1α-IRES-hrGFP, ligate la dorsale vettoriale non trattata dal passaggio 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. Per generare pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligate i seguenti frammenti di DNA: (1) la spina dorsale vettoriale defosforilata dal passo 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) e (2) il frammento di cDNA mGM-CSF generato nel passaggio 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
   2. Ligate a 25 °C per 5 min. Trasformare il DNA legato in cellule di E. coli competenti DH5α. Placcare le cellule di E. coli trasformate su piastre LB-agar contenenti carbenicillina (50 μg/mL).
   3. Purificare i plasmidi da singole colonie di E. coli utilizzando un kit di isolamento del DNA. Convalidare le identità dei plasmidi mediante sequenziamento del DNA.

3. Generazione di cellule ES-D3 che sovraesprimono GM-CSF

NOTA: Trasfettate le cellule ES-D3 con il plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP per sovraesprimere GM-CS. Cotrasfettere il plasmide pBabe-Neo in cellule ES-D3 per facilitare la selezione delle cellule stabilmente trasfettate^18,20.

1. Trasfettate i plasmidi nelle cellule ES-D3.
   1. Placcare le cellule ES-D3 (1,4 x 10⁶) in un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina (0,1%) di 10 cm con terreno di coltura (10 ml) per la trasfezione. Cellule ES-D3 placcate in coltura a 37 °C per 24 ore.
   2. Preparare due miscele di plasmidi in tubi microcentrifuga da 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, controllo vettoriale) con pBabe-Neo (4 μg) e (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, che esprimono GM-CSF) con pBabe-Neo (4 μg). Effettuare la trasfezione utilizzando un kit di trasfezione seguendo il protocollo del produttore.
   3. Aggiungere il mezzo di trasfezione (1 mL) e il reagente di trasfezione (64 μL) a ciascun tubo contenente le miscele di plasmidi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   4. Aggiungere le miscele di trasfezione alle rispettive stoviglie da 10 cm di cellule ES-D3. Incubare a 37 °C per 5 ore.
   5. Sostituire il mezzo in piatti da 10 cm con terreno di coltura fresco (10 ml). Incubare a 37 °C per 24 ore.
2. Generare popolazioni di massa di cellule ES-D3 stabilmente trasfettate.
   1. Rimuovere il mezzo dalle cellule ES-D3 trasfettate. Lavare le cellule con tripsina (2 ml; 0,05%). Aggiungere tripsina (2 mL) e incubare a 37 °C per 5 min. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 mL e aggiungere 2 mL di terreno di coltura fresco per neutralizzare la tripsina. Centrifuga a 390 x g per 5 min.
   2. Riconsosciare le cellule trasfettate in terreno di coltura fresco (10 ml). Valutare l'intensità di fluorescenza della GFP nelle cellule ES-D3 trasfettate utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), seguendo il protocollo del produttore.
   3. Trasferire le cellule trasfettate in due piatti da 10 cm contenenti terreno di coltura fresco (10 ml). Aggiungere neomicina (0,5 mg / mL) per eliminare le cellule non trasfettate.
   4. Continuare a coltivare le cellule trasfettate in terreno di coltura contenente neomicina (0,5 mg/ml). Quando l'ES-D3 trasfettato raggiunge il 90% di confluenza, trasferire nuovamente le cellule a piatti di coltura tissutale di 15 cm. Ripetere la procedura per 2 settimane.
3. Generare cloni di cellule ES-D3 trasfettate stabilmente.
   1. Una volta generate popolazioni di massa di cellule ES-D3 stabilmente trasfettate, raccogliere le cellule come prima. Determinare i numeri di cella utilizzando un emocitometro. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risuspenare le cellule (1 x 10⁷ cellule/ml) in terreno di coltura fresco.
   2. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare sterile da 40 μm. Purificare le celle ES-D3 GFP-positive utilizzando FACS, seguendo il protocollo del produttore.
   3. Placcare una singola cellula ES-D3 ordinata in un pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti rivestita di gelatina (0,1%) contenente cellule ES-D3 parentali (1 x^{10 3}) in mezzo privo di neomicina (200 μL). La co-coltura di cellule ES-D3 trasfettate con le loro controparti parentali non trasfettate assicura che le singole cellule ES-D3 trasfettate stabilmente sopravvivano e proliferano come un singolo clone.
   4. Colturare le cellule per 48 ore, quindi aggiungere neomicina (0,5 mg / mL) a piastre a 96 pozzi per eliminare le cellule ES-D3 parentali non trasfettate.
   5. Continuare a coltivare le cellule ES-D3 GFP-positive in piastre di coltura tissutale a 96 pozzi con terreno contenente neomicina (0,5 mg / mL) per 1 settimana. Trasferire le linee cellulari clonali ES-D3 a piatti di coltura tissutale rivestiti di gelatina (0,1%) 6 cm con terreno di coltura (5 ml) contenente neomicina (0,5 mg / mL) per 1 settimana.
   6. Determinare l'intensità della fluorescenza GFP in ciascuno dei cloni cellulari ES-D3 trasfettate utilizzando FACS, seguendo il protocollo del produttore. Selezionare i cloni ES-D3 che esprimono GM-CSF o il vettore vuoto con alti livelli di fluorescenza verde.
   7. Determinare le quantità di GM-CSF secrete dalle cellule ES-D3 utilizzando un kit ELISA GM-CSF murino, seguendo il protocollo del produttore.

4. Isolamento delle vescicole extracellulari arricchite con esosomi

1. Coltura delle cellule ES-D3 (1 x 10⁷) in piatti di coltura tissutale da 15 cm per 72 ore a 37 °C. Raccogliere il surnatante di coltura cellulare. Conservare il surnatante raccolto a 4 °C fino a 1 settimana per mantenere l'integrità esosomiale.
2. Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 5.000 x g per 60 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga per sedimentare grandi frammenti cellulari.
3. Raccogliere il surnatante e la centrifuga a 100.000 x g per 90 minuti a 4 °C utilizzando un ultracentrifuga.
4. Rimuovere il surnatante. Risciacquare delicatamente ogni pellet due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 1 mL) per rimuovere il surnatante residuo di coltura.
5. Ripresa di ogni pellet in PBS. Quantificare gli EV arricchiti con esosomi in modo che il loro contenuto proteico⁵.
   1. Misurare la concentrazione proteica di EV arricchiti di esosomi con un test di acido bicinchoninico (BCA). La resa attesa di EV arricchiti con esosomi da cellule ES-D3 è di circa 4 μg di proteina/mL di surnatante di coltura cellulare. Risospendare gli EV arricchiti di esosomi in PBS (concentrazione proteica: ~ 6 μg / μL). Conservare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi a -80 °C.

5. Caratterizzazione di vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione

NOTA: Studiare la composizione e la struttura degli EV arricchiti di esosomi isolati dalle ESC utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)⁵.

1. Fissare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi (3-5 μg/μL) con una concentrazione finale di paraformaldeide di grado EM al 2% a temperatura ambiente per 2 ore.
2. Caricare campioni fissi (10 μL) su griglie di rame con film di supporto al carbonio. Incubare i campioni con griglie di rame per 1 minuto, quindi scaricare le griglie con carta da filtro.
3. Macchiare le griglie con una soluzione colorante seguendo il protocollo del produttore.
4. Trasferire le griglie in un pezzo di carta da filtro utilizzando una pinzetta. Lasciare asciugare le griglie durante la notte a temperatura ambiente.
5. Acquisire immagini al microscopio elettronico utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (ingrandimento 50.000x), seguendo il protocollo del produttore.

6. Valutazione delle vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante analisi western blot

1. Preparare estratti di cellule intere.
   1. Rimuovere il mezzo dalle cellule ES-D3 coltivate in piatti da 15 cm. Lavare le cellule con tripsina (5 ml; 0,05%). Aggiungere tripsina (5 ml) alle cellule. Incubare a 37 °C per 5 min. Raccogliere le cellule e aggiungere terreno di coltura fresco (5 ml) per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le celle a 390 x g per 5 min. Risuspendare le celle in PBS.
   2. Determinare i numeri di cella utilizzando un emocitometro. Centrifugare nuovamente le celle a 390 x g per 5 min. Sospendare le celle nel buffer di caricamento SDS-PAGE contenente lo 0,5% di SDS (5.000 celle/μL).
   3. Sonicare i campioni per 10 s utilizzando un sonicatore con ampiezza del 10% (wattaggio: 500 W; frequenza ultrasonica: 20 kHz). Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 min.
2. Prepara i lisi dei veicoli elettrici arricchiti di esosomi.
   1. Riesemere i veicoli elettrici arricchiti di esosomi nel buffer di caricamento SDS-PAGE contenente lo 0,5% di SDS ad una concentrazione di 1,2 μg/μL.
   2. Sonicare i campioni per 10 s utilizzando un sonicatore con ampiezza del 10% (wattaggio: 500 W; frequenza ultrasonica: 20 kHz). Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 min.
3. Rileva le proteine da Western blot.
   1. Caricare estratti di cellule intere (10 μL; 5.000 cellule/μL) e losati EV arricchiti con esosomi (10 μL; 1,2 μg/μL) in ciascun pozzet di un gel Bis-Tris PAGE (4-20%). Trasferire le proteine sulle membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF).
   2. Incubare le membrane con anticorpi primari e secondari appropriati. Anticorpi diluiti (alle concentrazioni indicate di seguito) in tampone tampone contenente PBS, Tween-20 (0,2%) e latte secco non grasso (10% p/v).
      1. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromo c (100 ng/mL), anti-proteina disolfuro isomerasi (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) e anti-Oxphos COX IV-subunità IV (600 ng/mL).
      2. Utilizzare i seguenti anticorpi secondari: IgG di capra coniugata con perossidasi anti-coniglio (20 ng/mL) e IgG di capra coniugata con perossidasi (20 ng/mL).
   3. Rileva le proteine utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza avanzato.

7. Determinazione delle concentrazioni di GM-CSF nelle vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante ELISA

NOTA: Valutare le quantità di GM-CSF in veicoli elettrici arricchiti di esosomi mediante ELISA utilizzando un kit per GM-CSF murino, seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.

1. Rivestire la piastra ELISA con anticorpi di cattura. Trattare i veicoli elettrici arricchiti di esosomi (0,6 μg) in PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere i campioni trattati alla piastra ELISA rivestita e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20.
2. Aggiungere anticorpi di rilevamento ai campioni. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20. Aggiungere Avidin-HRP agli esempi. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Lavare la piastra con PBS da solo o PBS + 0,05% Tween-20.
3. Determinare le concentrazioni di GM-CSF in veicoli elettrici arricchiti di esosomi misurando l'assorbanza a 450 nm su un lettore di micropiasche.

Risultati

GM-CSF è sovraespresso nelle QCS murine.
Per sovraesprimere stabilmente GM-CSF nelle cellule ES-D3, il cDNA murino GM-CSF è stato clonato in un vettore di trasfezione per generare il vettore di espressione pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figura 1A). Il GM-CSF è stato sovraespresso nelle cellule ES-D3 per trasfezione e circa il 20% delle cellule ES-D3 trasfettate transitoriamente erano GFP-positive. I cloni cellulari che sovr...

Discussione

Questo studio mostra un metodo altamente efficiente per produrre EV arricchiti di esosomi che trasportano la proteina immunostimolante GM-CSF, che può essere impiegata per studiare gli effetti immunomodulanti dei veicoli elettrici arricchiti di esosomi. Diversi studi suggeriscono che gli esosomi esibiscono funzioni immuno-regolatorie e^{antitumorali 22}. Pertanto, gli esosomi delle ESC che esprimono GM-CSF potrebbero anche possedere attività biologiche che regolano la risposta immunitaria. In quest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline phosphate, Calf Intestinal	New England Biolabs	M0290S	Dephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone H-3, sc-74438	Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone B-11, sc-166029	Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone A-8, sc-13156	Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone C-2; sc-74566	Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAb	Rockland	600-401-A33S	Western blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated	Thermo Fisher	31430	Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb	Thermo Fisher	clone 20E8C12 A21348	Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb	Enzo	ADI-SPA-890	Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated	Thermo Fisher	31460	Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assay	Thermo Fisher	23223	Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%	Genscript	M42015	Western blot
Carbenicillin, Disodium Salt	Thermo Fisher	10177012	Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPI	Beckman Coulter		Low speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10	Beckman Coulter	09U1597	Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO	Thermo Fisher	3120-0500PK	Low speed centrifugation
Cu grids with carbon support film	Electron Microscopy Sciences	FF200-Cu	Acquiring electron microscopy images
EcoRI	New England Biolabs	R0101	Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection system	Thermo Fisher	32106	Western blot
FACScalibur flow cytometer	Becton Dickinson		Examining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serum	ATCC	SCRR-30-2020	Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm	Thermo Fisher	22-363-547	Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)	Thermo Fisher	ES006B	Culturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kit	Thermo Fisher	88733422	Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Thermo Fisher	10-829-018	Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory Factor	Thermo Fisher	ESG1106	Medium for ES-D3 cells
L-glutamine	VWR	VWRL0131-0100	Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668019	Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XS	BioTek		Determining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorter	Beckman Coulter		Isolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2988J	Generating GM-CSF expression plasmid
Neomycin	Thermo Fisher	10-131-035	Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acids	Thermo Fisher	SH3023801	Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milk	Thermo Fisher	NC9022655	Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062	Transfecting ES-D3 cells
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycin	VWR	sc45000-652	Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP	Addgene	37270	Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranes	Millipore EMD	IPVH00010	Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704	Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Generating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscope	Hitachi	HT7700	Acquiring electron microscopy images
Trypsin	VWR	45000-660	Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP	Beckman Coulter		High speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45Ti	Beckman Coulter	09U4454	High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottle	Beckman Coulter	355622	High speed centrifugation
UranyLess staining solution	Electron Microscopy Sciences	22409	Acquiring electron microscopy images