Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos

Resumo

Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.

Resumo

Os modelos animais são de suma importância na pesquisa do linfedema, a fim de compreender a fisiopatologia da doença, mas também para explorar potenciais opções de tratamento. Este modelo do rato permite que os investigadores induzam o linfedema significativo que dura pelo menos 8 semanas. O linfedema é induzido usando uma combinação de radioterapia fracionada e ablação cirúrgica de linfáticos. Este modelo exige que os ratos recebem uma dose de 10 cinza (Gy) radiação antes e depois da cirurgia. A parte cirúrgica do modelo envolve a ligadura de três vasos linfáticos e extração de dois gânglios linfáticos do membro posterior do rato. Ter acesso a ferramentas microcirúrgicas e um microscópio é essencial, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. A vantagem deste modelo é que ele resulta em linfedema estatisticamente significativo, o que fornece uma boa base para avaliar diferentes opções de tratamento. É também uma opção grande e facilmente disponível para o treinamento microcirúrgico. A limitação deste modelo é que o procedimento pode ser demorado, especialmente se não for praticado com antecedência. O modelo resulta em linfedema objetivamente quantificável em camundongos, sem causar morbidade grave e foi testado em três projetos separados.

Introdução

O linfedema é caracterizado por um acúmulo de líquido linfático que leva ao inchaço do tecido localizado, que ocorre principalmente devido ao fluxo prejudicado ou interrompido de fluido linfático nos vasos linfáticos¹. O fluxo linfático pode ser prejudicado ou interrompido por infecção, obstrução, lesão ou defeitos congênitos no sistema linfático^2. Essas etiologias resultam em acúmulo de líquido linfático, o que leva a um estado crônico de inflamação, resultando em fibrose subseqüente, bem como a deposição do tecido adiposo³. O linfedema pode ser categorizado como linfedema primário ou secundário. O linfedema primário é causado por anormalidades no desenvolvimento ou mutação genética^2,4. O linfedema secundário ocorre devido à doença sistêmica subjacente, cirurgia ou trauma^2,4. Linfedema secundário é a forma mais comum de linfedema no mundo². Nos países desenvolvidos, a causa mais comum do linfedema secundário é a terapia oncológica, como radioterapia adjuvante e dissecção do nóde linfático⁵. O linfedema é mais frequente entre os pacientes com câncer de mama, mas também pode se desenvolver em pacientes com câncer ginecológico, melanoma, genitourinário ou pescoço⁶. Tem sido sugerido que de todas as mulheres diagnosticadas com câncer de mama, 21% desenvolverão linfedema⁷.

Linfedema pode ser estressante para o paciente física e psicologicamente. Pacientes com linfedema têm um risco aumentado de infecção^5,8,9, má qualidade de vida e podem desenvolver ansiedade social e sintomas de depressão¹⁰. As complicações do linfedema crônico levam ao alto custo dos cuidados e ao aumento da carga da doença^9,11. Os resultados também sugeriram que o linfedema pode estar associado ao aumento do risco de morte após o tratamento do câncer de mama^12. A gerência conservadora tal como a compressão da área afetada, a drenagem manual do linfa e o skincare geral permanecem a primeira aproximação da linha. Atualmente não há tratamento curativo⁶. Embora o progresso foi feito no campo da terapia cirúrgica e médica, há ainda um quarto para a melhoria. Mais pesquisa, fornecendo a introspecção na fisiopatologia e progressão da doença, é necessário permitir clínicos de fornecer melhores opções do tratamento para os pacientes^5.

Modelos animais estão sendo usados em pesquisas pré-clínicas para entender a fisiopatologia de doenças e desenvolver opções potenciais de tratamento. Vários modelos animais linfedemos diferentes foram estabelecidos em caninos^13,14,coelhos^15,ovelhas^16,porcos^17,18 e roedores^{19,20, 21,22,23,24.} O modelo de roedores parece ser o modelo mais econômico, ao investigar a reconstrução da função linfática, devido a roedores serem facilmente acessíveis e relativamente de baixo preço²⁵. A maioria dos modelos de camundongos se concentraram em induzir linfedema na cauda dos camundongos^21,22,23. O modelo da cauda é muito de confiança mas a técnica cirúrgica exata para induzir o linfedema varia significativamente no material publicado precedente. Isso resulta em flutuações de duração e robustez do linfedema desenvolvido apresentado sapateado conhecido^25. Diferentes técnicas também estão sendo usadas para induzir linfedema no modelo de membros posteriores e também produzem resultados variados, mas o modelo de membros posteriores pode ser mais fácil de entender de uma perspectiva translacional. Modelos anteriores de linfedema foram prejudicados pela resolução espontânea do linfedema e, portanto, um modelo de linfedema reproduzível e permanente é necessário²⁵. Os investigadores têm tentado previamente aumentar a dose da radiação, para impedir a definição espontânea do linfedema, mas esta conduziu frequentemente à morbosidade severa subseqüente^25.

Este modelo resulta em linfedema estatisticamente significativo, sem causar morbidade grave, combinando microcirurgia com radiação. O modelo foi revisado a partir de um modelo cirúrgico anterior, adicionando uma dose de irradiação que induz o linfedema, sem causar morbidade grave²⁶. Ele também oferece uma grande oportunidade para o treinamento microcirúrgico. É necessário ter acesso a equipamentos microcirúrgicos e microscópio, devido às pequenas estruturas anatômicas dos camundongos. O procedimento cirúrgico pode ser realizado quando o usuário foi ensinado técnicas microcirúrgicas básicas, como a sutura com instrumentos microcirúrgicos. Os operadores que realizaram este procedimento assistiram a vídeos tutoriais de Acland sobre as pré-condições de habilidades microcirúrgicas (1981) e técnica de microssutura básica (1985). Recomendamos a prática do procedimento cirúrgico 8 a 10 vezes antes de usá-lo em pesquisa. A prática do procedimento garante que menos erros sejam cometidos e que o procedimento possa ser realizado de forma mais eficiente. Quando dominado, o procedimento cirúrgico pode ser realizado em 45 minutos.

Protocolo

Os animais foram alojados na Universidade do Sul da Dinamarca Animal Care Facility de acordo com as orientações institucionais. Todos os procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pela Inspecção de Experiências Animais, Ministério do Ambiente e Alimentação da Dinamarca.

1. Irradiação pré-cirurgia

NOTA: A irradiação pré-cirurgia ocorre 7 dias antes da cirurgia.

1. Induzir anestesia.
   1. Coloque o mouse em uma caixa de indução e coloque o vaporizador para 3% isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,8 a 1,2 L/min para induzir anestesia de inalação.
      NOTA: Alternativamente, anestésicos injetáveis podem ser usados, mas para a curta duração da inalação induzindo aanestesia foi suficiente. Para obter os resultados apresentados neste artigo, foram utilizados camundongos C57BL6 fêmeas de 9 semanas.
   2. Certifique-se que o rato está anestesiado inteiramente pelo teste da pitada da cauda ou da pata.
2. Posicione o mouse para irradiação.
   1. Se totalmente sedado, mova o mouse da caixa de indução e coloque-o a fonte de radiação em posição supina e fixar suavemente os membros traseiros com fita adesiva.
      NOTA: O rato permanecerá sedado para a curta duração da radiação.
   2. Coloque uma almofada de chumbo de 1,5 mm de espessura para garantir que apenas a área que passa por cirurgia (ou seja, a área circular com um diâmetro de 25 mm ao redor do joelho) seja irradiada.
3. Administrar uma dose de 10 radiação Gy a uma taxa de dose de 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
   CUIDADO: Precauções de segurança devem ser tomadas ao trabalhar com radiação. Durante este experimento, toda a irradiação foi realizada em uma sala isolada de radiação, e a fonte de radiação só foi ativada quando todo o pessoal saiu e selou a sala.
4. Coloque o rato de volta em sua gaiola.

2. Configuração de equipamento

NOTA: A cirurgia deve ser realizada em uma sala dedicada aos procedimentos cirúrgicos. A superfície operativa deve ser estéril.

1. Limpe completamente todas as superfícies operativas com 70% de etanol. Use rede de cabelo e coberturas. Use instrumentos cirúrgicos estéreis e luvas estéreis.
2. Prepare anestesia.
   1. Elabore 1 mL de fentanil (0,315 mg/mL), 1 mL de midazolam (5 mg/mL) e 2 mL de água estéril. Use diferentes seringas e agulhas para os diferentes componentes.
   2. Misture fentanil e água estéril esvaziando lentamente as seringas em um tubo de vidro estéril. Quando misturado, adicione midazolam para completar a solução de trabalho.
3. Prepare analgesia.
   1. Elabore 0,2 mL de buprenorfina (0,3 mg/mL) e 2 mL de soro.
   2. Misture os volumes esvaziando lentamente as seringas em um tubo de vidro estéril para completar a solução de trabalho.
4. Ligue o microscópio e certifique-se de que a iluminação é suficiente, e que o microscópio é bem ajustado para os olhos do operador.
   NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados um microscópio operacional. Uma faixa de ampliação de 4x-25x é suficiente.

3. Preparação

1. Pese o rato pré-cirurgia, colocando o mouse em um recipiente vazio em uma escala limpa.
2. Administrar anestésico.
   1. Elabore 0,1 mL de anestésico por 10 g de peso corporal do rato. Injete o anestésico subcutâneo como uma injeção de búso.
   2. Deixe o rato descansar em uma gaiola com muito fundamento e abrigo por aproximadamente 10 min até ficar totalmente sedado. Examine a profundidade anestésica avaliando o relaxamento muscular e realize o teste de compressão da pata ou da cauda.
3. Quando totalmente sedado, raspar o membro traseiro escolhido para o procedimento usando cortadores elétricos. Certifique-se de limpar o excesso de cabelo.
4. Ligue o dispositivo de aquecimento, como uma almofada de aquecimento e cubra-o com um pano cirúrgico.
5. Defina o fluxo de oxigênio para 0,8 L/min e conectá-lo com um nariz. Use 100% de oxigênio.
   NOTA: O nariz é apenas para entrega de oxigênio e não anestesia.
6. Aplique a pomada oftalmológica e injete 0,5 mL de salina subcutâneamente, de preferência na nuca do rato, para prevenir a hipovolemia durante a cirurgia.
7. Posicione o mouse para cirurgia.
   1. Coloque o rato no pano cirúrgico em posição supina. Coloque o nariz sobre o cnout.
   2. Fixe a extremidade dos membros posteriores suavemente com fita adesiva para evitar que o mouse mude durante a cirurgia.
   3. Esterilizar a pele usando álcool / clorexidina ou álcool / povidone iodo.

4. Cirurgia

NOTA: Neste exemplo, o membro traseiro esquerdo (quando o mouse é visto na posição supina), foi escolhido para o procedimento.

1. Faça uma incisão circular.
   1. Levante a pele com fórceps lisos e refide uma pequena abertura aproximadamente 5 mm proximal para a fossa popliteal.
   2. Deslize tesouraafiada na abertura e clipe em direção ao joelho para que a incisão termina logo acima do joelho. Certifique-se de não perfurar os vasos subjacentes, levantando a pele com fórceps durante o recorte.
   3. Mova o mouse para a posição propensa e continue a cortar do joelho em direção à fossa popliteal até que a incisão circunferente esteja completa.
2. Dissecar a pele abaixo do joelho.
   1. Delicadamente blunt dissecar a área abaixo do joelho para um par de milímetros acima do tornozelo, lentamente abrindo e fechando a microtesoura ao levantar a pele com fórceps.
   2. Corte cuidadosamente as adesões visíveis remanescentes usando microtesouras. Use soro salino estéril regularmente para manter o tecido úmido durante todo o procedimento.
3. Dissecar a pele na borda proximal da incisão circumferential para que ela possa ser retraída com um retrator elástico.
   NOTA: O retrator permite ao operador uma melhor visão do vaso linfático proximal e impede que a borda proximal de mudar durante a cirurgia.
4. Enquanto ainda em posição propensa, gire o membro traseiro suavemente e fixe-o com fita adesiva, de modo que a veia ischiatic seja visível do ponto mais proximal da área exposta ao ponto mais distal.
5. Injete aproximadamente 0,01 mL de Patente Azul V subcutâneamente entre o segundo e o terceiro dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dia usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 30 G. Pressione delicadamente a pata um par vezes para distribuir o V. azul da patente visualize as embarcações linfáticas e o nóde linfonodo através do microscópio enquanto o V azul da patente enche as embarcações do linfático.
   NOTA: Se a cor azul dos vasos linfáticos desaparece durante o procedimento, massageie suavemente a pata para promover a captação, em vez de injetar mais Patente Blue V. Uso excessivo de Patente Blue V pode levar ao vazamento e coloração do tecido em torno dos vasos linfáticos que podem comprometer o procedimento.
6. Localizar as estruturas importantes: o nólina linfática popliteal (PLN), as duas embarcações linfáticas distal para o nólina (DLV1 e DLV2), eo vaso linfa proximal para o nólino linfático (PLV).
   NOTA: Todos os vasos linfáticos podem ser encontrados ao lado da veia ischiatic. A embarcação de linffa proximal é geralmente encontrada medial na veia, os dois vasos linfáticos distais são encontrados medial e lateral para a veia. As abreviaturas das estruturas são usadas no vídeo que acompanha.
7. Amplie para visualizar claramente o PLV e liga-lo com uma sutura de nylon 10-0 usando suporte de micro-agulha e microfórios. Pressione a pata um par de vezes para garantir que nenhuma patente Blue V passa proximal para a sutura.
   NOTA: Aparar a gordura em torno do vaso linfático pode ser necessário.
8. Repita o passo 4.7 para ligar as duas embarcações linfáticas distal. Pressione a pata várias vezes para garantir que nenhuma Patente Blue V passe proximal para a ligadura. Se as embarcações linfáticas se encontram para fechar a veia ischiatic, tente dissecar ainda mais distally.
   NOTA: Neste exemplo, pode-se ver que uma das embarcações linfáticas estoura devido à ligadura que impede o fluxo linfático. As embarcações linfáticas, muitas vezes se separam da veia mais abaixo.
9. Retire o nólina linfático popliteal.
   1. Localizar o nólina linfática popliteal e cortar um pequeno buraco com microtesoura para acessá-lo e removê-lo com microfórios e microtesouras.
      NOTA: O nó de linfa tem uma superfície pérola-como lisa em contraste com o tecido gordo circunvizinho.
   2. Para testar se o tecido removido é um nóde linfático, coloque-o em um tubo de ensaio cheio de água.
      NOTA: Se o tecido é composto de gordura, o tecido vai flutuar. Se o tecido é um nódelina linfática, ele vai afundar até o fundo.
10. Retire a almofada de gordura inguinal e nóurico linfático.
    1. Antes de remover a almofada gorda inguinal, use um coagulator bipolar para cauterizar as embarcações que funcionam através da gordura.
    2. Reseque a almofada de gordura inguinal usando microfóricos e microtesouras. Delicadamente cortar os vasos cauterizados que atravessam a gordura. Em seguida, delicadamente reseque o tecido adiposo na área inguinal.
       NOTA: O nódelga linfática localizado na gordura raramente é colorido pela Patente Azul V e pode ser difícil de diferenciar da gordura. Remover a almofada gorda em uma parte é a melhor maneira de assegurar-se de que o nó de linfa esteja removido.
11. Lave a perna completamente com soro salino estéril e confirme através do microscópio que quaisquer pequenos pêlos e partículas foram completamente removidos da área cirúrgica para evitar a contaminação da ferida e infecção. Certifique-se de que não há sangramento ativo.
12. Sutura as bordas da pele até a facia muscular com uma sutura de nylon 6-0 usando fórceps e suporte de agulha, deixando uma lacuna de 2-3 mm para restringir o fluxo superficial de linfa.
    NOTA: O vídeo que acompanha mostra um exemplo de suturas acabadas.
13. Administrar analgesia. Elabore 0,1 mL de analgesia por 30 g de peso corporal do rato. Injetar a analgesia subcutâneamente como uma injeção de bósco.
14. Pese o mouse para comparação pós-cirurgia.
15. Coloque o rato em uma gaiola em um armário aquecido para recuperação.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Dê aos ratos gaiolas individuais para se recuperar após a cirurgia com água e alimentos ad libitum.
2. Administrar uma dose subcutânea bolus de 0,02 mL de buprenorfina 3x diariamente por 3 dias para analgesia.
3. Monitorar o animal diariamente para a cicatrização adequada da ferida, sinais de dor e infecção. Se os sinais de infecção estão presentes, use pomada antibiótica.

6. Irradiação pós-cirurgia

1. Três dias após a cirurgia, repita o procedimento para irradiação pré-cirurgia (passos 1,1-1,4).

Resultados

Este procedimento foi usado previamente em três experiências separadas. Todos os experimentos foram feitos por diferentes investigadores principais que todos são co-autores deste artigo. Em todos os três experimentos, foi tomado grande cuidado para aderir ao mesmo procedimento descrito neste protocolo. Em todos os três experimentos, o linfedema secundário foi induzido em um membro posterior, enquanto o outro membro posterior serviu como controle. Os volumes dos membros posteriores f...

Discussão

Há alguns passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, é importante que os pesquisadores tomem precauções de segurança ao trabalhar com radioatividade. Em segundo lugar, durante a parte cirúrgica deste protocolo, é importante iniciar o procedimento uma vez que o rato tenha sido anestesiado e terminá-lo sem pausas desnecessárias. Isso é importante para evitar um período cirúrgico excessivamente longo para o animal e evitar que a anestesia perca efeito durante a cirurgia. Recomenda-se administrar apenas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb