O uso de testes tradicionais de medo para avaliar diferentes circuitos emocionais em bovinos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar uma variedade de testes comportamentais em bovinos que foram projetados para avaliar emoções. Uma bateria de testes comportamentais (teste de campo aberto, teste de startle, labirinto bovino zero, velocidade de saída, pontuação de caneta e pontuação de pára-quedas) foram realizadas para avaliar diferentes componentes do temperamento animal.

Resumo

O temperamento animal é complexo e tem implicações para a produtividade e a rentabilidade econômica. Quantificar a resposta de um animal a diferentes estímulos pode facilitar a reprodução e identificar animais mais adequados a estratégias específicas de manejo. Vários testes foram desenvolvidos para avaliar o temperamento do gado (por exemplo, velocidade de saída, pontuação de pára-quedas, pontuação de caneta, teste de campo aberto, teste de assusto, labirinto zero bovino), mas cada um desses testes avalia a resposta do animal a diferentes estímulos (por exemplo, isolamento, ambiente novo, problema, indisposição para entrar em uma área fechada). O temperamento do gado tem sido observado como relativamente estável ao longo do tempo. No entanto, a avaliação do temperamento tem potencial para ser influenciada pelas condições atuais, experiências anteriores e viés observador. Muitos desses testes de temperamento foram categorizados indevidamente como testes de medo e também foram criticados por serem subjetivos. Este artigo fornece uma estrutura para padronizar testes comportamentais para bovinos e sugere que essas diferentes avaliações avaliem diferentes aspectos do temperamento geral do animal.

Introdução

O temperamento animal tem sido associado a características comportamentais como comportamento exploratório e ousadia^1,2 e pode apresentar consistênciaao longo do tempo e em todos os contextos^3,4. No entanto, o temperamento é composto de múltiplos sistemas emocionais trabalhando juntos. Os animais experimentam estressores físicos e psicológicos, e avaliar a resposta emocional para ambos os tipos é um desafio. O estado emocional pode influenciar a forma como os animais percebem estímulos (por exemplo, viés cognitivo), e é um componente crítico do bem-estar animal⁵. Entender como um indivíduo se comportará em resposta a estressores psicológicos (por exemplo, misturando, desmame, mudança no estoque) fornecerá aos gestores animais critérios adicionais de seleção ao identificar animais que tenham as habilidades para lidar com estressores psicológicos.

As emoções são controladas por sete sistemas afetivos centrais dentro do cérebro (Tabela 1)⁶. Esses sistemas incluem quatro que controlam emoções positivas: 1) BUSCA (exploração), 2) LUST (excitação sexual), 3) CUIDADO (nutrição) e 4) PLAY (alegria social). Três sistemas controlam emoções negativas 1) MEDO (ansiedade), 2) RAIVA (raiva) e 3) PÂNICO/LUTO (angústia de separação). Esses sistemas afetivos podem ser herdáveis⁷, impactar a rentabilidade, e são um componente crítico do bem-estar animal.

Uma bateria de testes foi desenvolvida para avaliar o temperamento do gado (por exemplo, velocidade de saída, pontuação de pára-quedas). No entanto, a avaliação do temperamento tem potencial para ser influenciada pelas condições atuais, experiências anteriores e viés observador. Embora muitas dessas avaliações comportamentais sejam comumente referidas como testes de medo, elas podem estar quantificando diferentes componentes emocionais do temperamento além do MEDO. Além disso, a variação na forma como esses testes têm sido realizados torna as comparações entre diferentes avaliações desafiadoras. Assim, é preciso compreender as relações entre essas avaliações comportamentais, bem como ter um protocolo padronizado para essas avaliações de temperamento.

O objetivo deste artigo é documentar visualmente os diferentes testes de medo utilizados para o gado; apresentar o tipo de dados gerados a partir desses diferentes testes; avaliar a repetibilidade, validade e confiabilidade desses testes; demonstrar como avaliar as relações entre os comportamentos capturados a partir desses testes; e sugerir qual circuito emocional poderia ser avaliado a cada teste.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Texas A&M University (IACUC2016-0356).

1. Animal e habitação

1. Casa ano 1/4 Bos indicus x 3/4 Bos taurus steers (n = 32) do mesmo rebanho em duas canetas drylot (n = 16 bois/caneta) durante 7 dias antes do início do teste. No início do estudo, os bois pesavam 270,9 ± 14,8 kg e foram alimentados com a mesma ração de crescimento padrão ao longo do estudo.
2. Avaliar visualmente os bois diariamente como parte das práticas rotineiras de criação. Nenhum boi recebeu tratamento médico durante toda a duração do estudo.

2. Descrição dos testes

1. Teste 1: Velocidade de saída
   1. Coloque os cronômetros eletrônicos na frente de um pára-quedas de manuseio para que a distância entre os pontos de partida e parada seja de 1,8 m. Estes temporizadores são projetados para iniciar o tempo quando o animal quebra o primeiro feixe eletrônico e param quando o animal quebra o segundo feixe eletrônico.
   2. Mova gado pela instalação de manejo.
   3. Pegue cada animal na cabeça do pára-quedas e mantenha-o contido por 10 s.
   4. Depois das 10, solte o animal da cabeceira.
   5. Com o temporizador eletrônico, registre o tempo que leva para o animal atravessar 1,8 m do paraquedas.
   6. Calcule a velocidade do animal ao sair do pára-quedas dividindo 1,8 m pelo tempo que levou para o animal atravessar os 1,8 m após a liberação do portão e do pára-quedas.
      NOTA: Outras publicações utilizaram essa estratégia de coleta de dados^8,,9,,10,,11.
2. Teste 2: Pontuação do pára-quedas
   1. Mova o gado através da instalação de manejo.
   2. Pegue cada animal na cabeça do pára-quedas por 10 s sem aplicar pressão ao seu corpo.
   3. Alguém observe o gado para os 10 s e atribua a cada animal uma pontuação de acordo com as Diretrizes da Federação de Melhoria da Carne 2019 para Programas uniformes de Melhoria da Carne 9ª Edição (Tabela 2) com base em seu comportamento enquanto é contido.
   4. Depois de 10 s, solte o animal do portão e do pára-quedas.
      NOTA: Outras publicações utilizaram essa estratégia de coleta de dados^12,,13,,14.
3. Teste 3: Pontuação da caneta
   1. Coloque um grupo de cinco bovinos em uma caneta (7,3 m W x 7,3 m L x 2,4 m H).
   2. Tenha um único observador humano que é desconhecido para o gado entrar na caneta a pé e fechar o portão depois de entrar na caneta.
   3. Faça o observador dar dois passos em direção ao grupo de gado.
   4. Observe visualmente o comportamento de cada animal em resposta ao observador.
   5. Dentro de 30 s de entrar na caneta, atribua a cada animal uma pontuação de acordo com as Diretrizes da Federação de Melhoria da Carne 2019 para Programas uniformes de Melhoria da Carne 9ª Edição (Tabela 3).
   6. Limpe a arena de testes de urina e fezes entre grupos de animais.
      NOTA: Outras publicações que utilizaram essa estratégia de coleta de dados^10,11.
4. Teste 4: Labirinto zero bovino
   1. Construa um Labirinto Zero Bovino (BZM).
      1. Use painéis de gado para criar uma faixa circular de 1,6 m de largura, com os diâmetros interno e externo medindo 6,6 m e 8,2 m, respectivamente(Figura 1).
      2. Divida o BZM em quatro quadrantes de igual comprimento com dois quadrantes abertos opostos e dois quadrantes fechados opostos onde os painéis são cobertos com pano de sombra e o pano de sombra é estendido através dos anéis internos e externos do labirinto para fazer um telhado sobre as partes fechadas do labirinto.
      3. Se o teste for realizado ao ar livre, para minimizar a variação devido às sombras, oriente o BZM de tal forma que as seções fechadas do labirinto encarem norte e sul e realize testes aproximadamente ao meio-dia de cada dia de teste.
   2. Monte uma câmera de vídeo para capturar toda a arena. Ligue a câmera e comece a gravar.
   3. Usando práticas de baixo estresse, mova um único animal para uma porção aberta do labirinto e permita que o animal explore a arena por 10 minutos.
   4. Ao final do período de observação de 10 min, devolva o animal para sua caneta.
   5. Limpe a arena de testes de urina e fezes entre animais.
   6. Decodificar as gravações de vídeo para frequência e latência de etapas, tentativas de fuga, chutes, urinações, defecações, vocalizações, lutas em pé, duração do tempo gasto em pé, tempo de caminhada, latência para entrar em áreas fechadas, número de vezes que o animal entra em áreas fechadas, quantidade de tempo em porções fechadas/abertas, número de transições entre braços abertos/fechados. As métricas foram identificadas com base no trabalho publicado anteriormente¹⁵.
5. Teste 5: Teste de Início Individual e O Teste de Início de Grupo
   1. Construa uma arena (7,3 m W x 7,3 m L x 2,4 m H) que tenha uma superfície terrestre sólida e uniforme, livre de vegetação ou estrume, e dois guarda-chuvas fechados nas extremidades opostas da arena(Figura 2). Os guarda-chuvas devem ser projetados para que se abram de repente ao apertar um botão.
      1. Certifique-se de que as laterais da arena estão sólidas ou cobertas com madeira compensada ou pano de sombra para garantir que o animal não possa ver fora da arena.
      2. Corte um buraco na altura da cabeça de gado em lados opostos da arena para o guarda-chuva penetrar.
   2. Monte uma câmera de vídeo para capturar toda a arena. Ligue a câmera de vídeo e comece a gravar.
   3. Usando práticas de baixo estresse, mova um único animal para a arena de testes. Para o teste de início de grupo, introduza um pequeno grupo de aproximadamente quatro animais.
   4. Depois que o animal esteve na arena por 60 s, abra os dois guarda-chuvas simultaneamente.
   5. Deixe os animais na arena por 4 min depois que os guarda-chuvas abrirem.
   6. Limpe a arena de testes de urina e fezes entre os testes.
   7. Decodificar as gravações de vídeo para a freqüência e latência das etapas, tentativas de fuga, tocar os guarda-chuvas, chutes, urinações, defecações, vocalizações, lutas em pé, duração do tempo gasto em pé, passos nos primeiros 60 s de testes, e passos na década de 60 após a abertura dos guarda-chuvas para cada animal. As métricas foram identificadas com base no trabalho publicado anteriormente¹⁶.
6. Teste 6: Teste de campo aberto
   1. Construa uma arena quadrada (7,3 m W x 7,3 m L x 2,4 m H) que tenha uma superfície terrestre sólida e uniforme livre de vegetação ou estrume. As laterais da arena devem ser sólidas ou cobertas com madeira compensada ou pano de sombra para garantir que o animal não possa ver fora da arena.
   2. Monte uma câmera de vídeo para capturar toda a arena. Ligue as câmeras de vídeo e comece a gravar.
   3. Usando práticas de manuseio de baixo estresse, mova um único animal para o centro de uma arena de testes de campo aberto de lado sólido.
   4. Deixe o animal na arena por 10 min.
   5. Depois de 10 min, devolva o animal para sua prisão.
   6. Limpe a arena de testes de urina e fezes entre animais.
   7. Decodificar as gravações de vídeo para a freqüência e latência para o primeiro passo, tentativas de fuga, chutes, urinação, defecação, vocalização, lutas em pé, duração do tempo gasto em pé, duração da caminhada, número de passos dados, número de passos dados durante os primeiros 60 s de teste. As métricas foram identificadas com base no trabalho publicado anteriormente^17,18,19.

3. Análise estatística

1. Avalie a repetibilidade inter e intra-teste utilizando corcorividade de Pearson (PROC CORR) e confiabilidade calculada usando o alfa de Cronbach (PROC CORR). Realizar uma validade de variáveis de resposta em relação ao ganho diário médio (ADG) utilizando uma análise de regressão (PROC REG).
2. Após a padronização das variáveis (PROC STANDARD), utilize uma Análise de Cluster (PROC VARCLUS) para identificar relações entre variáveis de dentro e entre diferentes testes. Muitas dessas variáveis podem ser regredidas contra métricas de produção para identificar relações relevantes entre o comportamento do gado durante esses testes e a produtividade.

Resultados

O uso desses resultados pode ajudar a caracterizar a responsabilidade comportamental do gado para diferentes tipos de estímulos, e essas informações podem influenciar as decisões individuais de retenção e seleção de reprodução. Em geral, esses testes devem ser realizados quando os animais são jovens para minimizar o impacto da experiência anterior em seu comportamento²⁰. As relações entre esses diferentes testes comportamentais podem ser preditivas de comportamentos em outros testes e com a produtividade do animal. A repetibilidade desses testes também varia, pois alguns testes são relativamente consistentes ao longo do tempo, enquanto outros não são.

Para cada teste, apresentaremos a repetibilidade, validade e confiabilidade para as métricas coletadas nesse teste específico. Vamos delinear os prós e contras de cada teste à medida que os vemos e discutir qual circuito emocional pode ser avaliado. Em seguida, apresentaremos uma análise de componente de princípio da amostra sobre o número de etapas realizadas em todos os testes.

Velocidade de saída (EV)
O EV pode diminuir ligeiramente à⁹medida que os animais envelhecem, mas permanecerá relativamente estável^9,10,,21. Houve alta repetibilidade (R = 0,72; p < 0,0001) e a validade em relação ao ADG dependia das circunstâncias (R² = 0,12, p = 0,03). A confiabilidade foi inaceitável (ICC = 0,41). O teste EV tem um curto tempo de teste, uma variável de resposta objetiva, é repetível e válido, mas requer investimento em equipamentos, pode ser influenciado pela instalação de manuseio e pela experiência anterior do avaliador, e tem baixa confiabilidade.
Circuito emocional: MEDO

Pontuação da caneta (PS)
O PS apresentou baixa repetibilidade (R = 0,35; p = 0,05) e sua validade em relação ao ADG dependia das circunstâncias (R² = 0,12, p = 0,03). A confiabilidade foi inaceitável (ICC = 0,33). O teste ps tem um curto tempo de teste e vários animais podem ser avaliados simultaneamente. No entanto, é subjetivo. Pode ser influenciado por experiências negativas anteriores a serem tratadas por humanos. Pode ser influenciada pela aparência e linguagem corporal do avaliador e é arriscada para o avaliador. Há baixa repetibilidade e confiabilidade.
Circuito emocional: PÂNICO

Pontuação de chute (CS)
A SC apresentou ligeira repetibilidade (R = 0,15, p = 0,42) e sua validade em relação ao ADG não foi útil (R² = -0,03, p = 0,67). A confiabilidade foi ruim (ICC = 0,60). CS tem um tempo de teste curto (10 s/animal), mas é uma variável de resposta subjetiva. Pode ser influenciado por equipamentos/infra-estrutura e pela experiência anterior do avaliador. Se a hidráulica estiver muito apertada, pode causar uma vocalização e alterar a quantidade de puxão de cabeça. Experiências negativas anteriores com a instalação podem inflar artificialmente as pontuações. À medida que os animais ficam mais velhos ou mais pesados, os escores diminuirão.
Circuito emocional: RAGE

Relações entre EV, PS, CS e ADG
A Figura 3 ilustra as relações entre essas quatro variáveis. À medida que o ADG aumentava, ev (FEAR; R = -0,41; p = 0,02) e PS (PÂNICO; R = -0,42; p = 0,02) diminuiu. Não foi observada relação entre ADG e CS (RAGE). Observou-se relação positiva (R = 0,45; p = 0,01) entre PS (PÂNICO) e EV (FEAR). Não foi observada relação entre CS (RAGE) e EV nem entre CS (RAGE) e PS (PANIC).

Labirinto Zero Bovino (BZM)
As respostas comportamentais enquanto no BZM (SEEKING, PANIC) são apresentadas na Tabela 4. Como este teste não é repetível²², o comportamento do gado durante testes repetidos pode não ser um indicador preciso da responsabilidade do gado para um estímulo imediato, mas pode ser mais indicativo de um estado afetivo central (por exemplo, ansiedade).

Uma série de etapas apresentou alta repetibilidade (R = 0,71, p = 0,005). O número de lutas em pé (R = -0,61) e a latência para a primeira luta em pé (R = 0,61) foram métricas válidas para EV durante apenas o teste inicial. O tempo total de pé durante o primeiro teste foi uma métrica válida para ADG. Várias etapas apresentaram confiabilidade inaceitável (ICC = 0,42). O BZM tem vários passos repetíveis. A duração do tempo gasto em pé é uma métrica válida para o ADG e o comportamento em pé pode ser um proxy para EV e ADG. Uma ampla gama de variáveis são avaliadas. O comportamento do gado é observado sem interferência humana. As métricas de resposta são objetivas. No entanto, é muito, tempo e trabalho intensivo para construir o labirinto e realizar o teste (10 min/animal apenas para testes), e requer decodificação de vídeo.
Circuito emocional: BUSCANDO, PÂNICO

Teste individual de remeto
Embora o teste de reincidente, o gado se comportará de forma diferente durante o teste de e-forma quando for avaliado individualmente em comparação com quando estiverem em um grupo²³. Durante o teste de relocomoção individual, o gado pode sofrer estresse de isolamento; portanto, a ativação dos sistemas PANIC e SEEKING pode substituir qualquer ativação do sistema FEAR. O número de passos (R = 0,62, p = 0,0008) e o número de passos dentro dos primeiros 60 s após a abertura do guarda-chuva (R = 0,60, p = 0,001) apresentaram repetibilidade moderada. A validade em relação ao ADG não foi um indicador útil (R² = 0,07) de ADG. Várias etapas (ICC = -0,06) durante todo o período de teste apresentaram confiabilidade inaceitável. No entanto, o número de etapas dentro dos primeiros 60 s após a abertura do guarda-chuva (ICC = 0,70) teve confiabilidade aceitável.

O teste de reincidente tem várias métricas que são repetíveis e confiáveis, e uma ampla gama de variáveis são avaliadas. O comportamento do gado é observado sem interferência humana. As métricas de resposta são objetivas. No entanto, é recurso, tempo e trabalho intensivo para construir o labirinto e realizar o teste (5 min/animal somente para testes). Requer decodificação de vídeo e pode ser confundido pelo estresse de isolamento.
Circuito emocional para teste de remeto individual: PÂNICO, BUSCA
Circuito emocional para teste de relocomoção em grupo: MEDO

Teste de campo aberto
O número de passos (R = 0,67, P = 0,0001) apresentou repetibilidade moderada. Sua validade em relação ao ADG está comprometida porque várias etapas (R² = 0,03) são pouco úteis. Uma série de etapas (ICC = 0,26) apresentaram confiabilidade inaceitável. O teste de campo aberto tem uma ampla gama de variáveis avaliadas. Algumas etapas durante o teste são repetíveis. O comportamento do gado é observado sem interferência humana. As métricas de resposta são objetivas. No entanto, é preciso, tempo e trabalho intensivo para construir o labirinto e realizar o teste (10 min/animal apenas para testes), e requer decodificação de vídeo.
Circuito emocional: PÂNICO, BUSCA

Análises multivariadas
As análises em cluster identificaram três clusters primários (FEAR, RAGE e PANIC/SEEKING) nos dados(Figura 4). O número de etapas no Teste de Início de Grupo (FEAR) agrupado com ADG e EV (FEAR). O número de etapas no Teste de Pânico/BUSCA (PÂNICO/BUSCA), OFT (PÂNICO/BUSCA) e Teste individual de pânico (PÂNICO/BUSCA) agrupados. CS (RAGE) não se agruparam com nenhuma das outras variáveis.

Sistema Emocional	Teste comportamental proposto para detectar ativação do sistema
Procurando	teste de campo aberto, teste de objeto novo, labirinto bovino zero, pontuação da caneta
Luxúria	avaliação da libido
Cuidado	comportamento materno, angústia em torno do desmame
Jogar	Tbd
Medo	teste de pega-pega, velocidade de saída
Raiva	pontuação de pára-quedas, proteção de prole
PÂNICO/LUTO	teste de isolamento social, labirinto zero bovino, pontuação da caneta

Tabela 1: Avaliações comportamentais que podem identificar a ativação de diferentes sistemas emocionais dentro do cérebro.

Pontuação	Rótulo	Descrição
1	Dócil	Disposição leve. Gentil e fácil de manusear. Fica e se move lentamente durante o processamento. Imperturbável, resolvido, um pouco maçante. Não puxa a cabeça quando no pára-quedas. Sai para queda de pára-quedas calmamente
2	Inquieto	Mais silencioso que a média, mas pode ser teimoso durante o processamento. Pode tentar sair do pára-quedas ou puxar para trás no porta-malas. Alguns movimentos de cauda. Sai do pára-quedas prontamente.
3	Nervoso	Temperamento típico é controlável, mas nervoso e impaciente. Uma quantidade moderada de luta, movimento e movimento da cauda. Repetido empurrando e puxando a cabeça. Sai do pára-quedas rapidamente.
4	Flighty (selvagem)	Nervoso e fora de controle, treme e luta violentamente. Que suiça e espuma pela boca. Freneticamente corre a linha da cerca e pode saltar quando escrito individualmente. Exibe longa distância de vôo e sai do pára-quedas descontroladamente.
5	Agressivo	Pode ser semelhante ao Score 4, mas com comportamento agressivo adicionado, medo, agitação extrema e movimento contínuo que pode incluir salto e berração enquanto no pára-quedas. Sai do pára-quedas freneticamente e pode exibir comportamento de ataque quando manuseado sozinho.
6	Muito agressivo	Temperamento extremamente agressivo. Desatona ou ataca descontroladamente quando confinado em lugares pequenos e apertados. Comportamento de ataque pronunciado.

Tabela 2: Descrição do comportamento do gado conforme avaliado para A Escores de Chute (Federação de Melhoria da Carne).

Pontuação	Rótulo	Descrição
1	Não agressivo (dócil)	Caminha lentamente, pode ser abordado de perto por humanos, não animado por humanos ou instalações
2	Ligeiramente agressivo	Corre ao longo de cercas, vai ficar no canto se os humanos ficar longe, pode andar cerca
3	Moderadamente agressivo	Corre ao longo de cercas, cabeça para cima e correrá se os humanos se aproximarem, parar antes de bater em portões e cercas, evitar os humanos
4	Agressivo	Corridas, fica na parte de trás do grupo, cabeça erguida e muito consciente dos humanos, pode correr em cercas e portões mesmo com alguma distância, provavelmente vai correr em cercas se sozinho em caneta
5	Muito agressivo	Animado, esbarra em cercas, atropela humanos e qualquer outra coisa no caminho, "louco"

Tabela 3: Descrição do comportamento do gado conforme avaliado para O Escore da Caneta (Federação de Melhoria da Carne).

Frequência do desempenho comportamental	Média ± SEM	Max-Min
Passos (contagem)	244,11 ± 29,19	594 - 34
Tentativas de fuga (contagem)	9 ± 1,48	29 - 0
Chutes (contagem)	8,67 ± 1,17	25 - 1
Uronsia (contagem)	0,32 ± 0,13	3 - 0
Defecações (contagem)	1 ± 0,29	6 - 0
Vocalizações (contagem)	0,96 ± 0,3	6 - 0
Lutas em pé (contagem)	10,61 ± 1,06	25 - 0
Duração do tempo gasto em pé (s)	200,23 ± 22,59	456.32 - 0
Passos (contagem) durante os primeiros 60 segundos de teste	32,18 ± 5,31	106 - 0
Latência para realizar o comportamento depois de entrar no Labirinto Zero Bovino	Média ± SEM	Max-Min
Latência ao primeiro passo (s)	18,32 ± 8,36	228.7 - 0.03
Latência à primeira tentativa de fuga (s)	165,67 ± 38,31	600 - 1.6
Latnecy para primeira mudança de direção (s)	76,05 ± 14,43	290.96 - 2.87
Latência à primeira urinação (s)	520,31 ± 31,64	600 - 42.3
Latência à primeira defecação (s)	325,63 ± 52,13	600 - 0
Latência à primeira vocalização (s)	437,03 ± 45,69	600 - 1.7
Latência para a primeira luta em pé (s)	68,72 ± 23,6	600 - 0.54

Tabela 4: Frequência e latência para realizar comportamentos observados enquanto o gado estiver no Labirinto Zero Bovino.

	Teste individual de remeto		Teste de startle de grupo
Frequência de comportamento durante o teste	Média ± SEM	Max-Min	Média ± SEM	Max-Min
Tempo em que guarda-chuvas se abrem	63,27 ± 0,35	68.34 - 60.09	61,2 ± 0,08	62.16 - 60.33
Passos (contagem)	318,5 ± 37,52	948 - 65	126,72 ± 12,68	312 - 25
Tentativa de fuga (contagem)	0 ± 0	0 - 0	0 ± 0	0 - 0
Toca guarda-chuva (contagem)	2,27 ± 0,53	11 - 0	0,03 ± 0,03	1 - 0
Chutes (contagem)	0,16 ± 0,09	3 - 0	0 ± 0	0 - 0
Uronsia (contagem)	0,19 ± 0,07	1 - 0	0,13 ± 0,07	2 - 0
Defecações (contagem)	0,72 ± 0,12	3 - 0	0,72 ± 0,15	3 - 0
Vocalizações (contagem)	0,44 ± 0,29	10 - 0	0,03 ± 0,03	1 - 0
Lutas em pé (contagem)	7,91 ± 0,56	15 - 0	8,66 ± 0,52	14 - 3
Duração em pé (sonds)	140,87 ± 13,77	316.25 - 0	188,94 ± 9,91	299 - 64.74
Passos nos primeiros 60 segundos de teste (contagem)	62,44 ± 8,92	248 - 6	33,84 ± 3,11	81 - 6
Passos nos 60 segundos após a abertura dos guarda-chuvas (contagem)	72,52 ± 10,1	295 - 6	27,09 ± 3,76	92 - 0
	Teste individual de remeto		Teste de startle de grupo
Latência para realizar comportamentos	Média ± SEM	Max-Min	Média ± SEM	Max-Min
Latência ao primeiro passo (s)	4,14 ± 1,46	36.98 - 0.11	2,61 ± 0,88	28.65 - 0.11
Latência à primeira tentativa de fuga (s)	-	-	-	-
Latência ao primeiro toque de guarda-chuva (s)	94,79 ± 14,74	282.84 - 11.64	157,76 ± 157,76	157.76 - 157.755
Latência ao primeiro chute (s)	137,29 ± 16,78	167.2 - 93.47	-	-
Latência à primeira urinação (s)	135,47 ± 38,38	293.79 - 29.74	52,87 ± 9,39	69.66 - 37.17
Latência à primeira defecação (s)	104,18 ± 23	271.98 - 3.35	62,44 ± 13,74	196.76 - 15.11
Latência à primeira vocalização (s)	67,32 ± 41,27	226.89 - 3.83	68,15 ± 0,00	68.15 - 68.15
Latência para a primeira luta em pé (s)	26,52 ± 7,1	193.48 - 0.44	11,43 ± 1,76	45.4 - 1.12
Latência para o primeiro passo após a abertura do guarda-chuva (s)	63,2 ± 1,77	84.19 - 6.36	65,94 ± 5,09	167.34 - 6.96
Latência à primeira tentativa de fuga após guarda-chuva aberto (s)	-	-	-	-
Latência aos primeiros toques do guarda-chuva após a abertura dos guarda-chuvas (s)	110,2 ± 16,38	282.84 - 11.64	-	157.76 – 0
Latência para o primeiro chute após a abertura do guarda-chuva (s)	137,29 ± 16,78	167.2 - 93.47	-	-
Latência à primeira urinação após a abertura do guarda-chuva (s)	152,34 ± 40,79	293.79 - 29.74	67,94 ± 1,72	69.66 - 66.21
Latência à primeira defecação após abertura de guarda-chuva (s)	160,57 ± 26,49	271.98 – 1	90,03 ± 21,26	196.76 - 17.39
Latência à primeira vocalização após a abertura do guarda-chuva (s)	100,91 ± 44,77	226.89 - 11.47	-	68.15 – 0
Latência para a primeira luta em pé após a abertura do guarda-chuva (s)	85,59 ± 10,32	297.33 - 1.27	76,91 ± 5,33	182.69 - 15.47

Tabela 5: Frequência e latência para realizar comportamentos observados enquanto o gado estiver no Teste de Início Individual e no Teste de Início de Grupo.

Frequência de comportamentos durante o teste	Média ± SEM	Max-Min
Passos (contagem)	464,28 ± 42,65	1607 - 91
Tentativas de fuga (contagem)	0,06 ± 0,04	2 - 0
Chutes (contagem)	0,16 ± 0,06	2 - 0
Uronsia (contagem)	0,14 ± 0,04	1 - 0
Defecações (contagem)	0,44 ± 0,08	2 - 0
Vocalizações (contagem)	1,91 ± 0,7	32 - 0
Lutas em pé (contagem)	13,75 ± 0,84	40 - 4
Duração do tempo gasto em pé (s)	294,94 ± 17,85	562.98 - 48.72
Passos (contagem) durante os primeiros 60 segundos de teste	69,36 ± 7,72	297 - 0
Latência para realizar comportamento	Média ± SEM	Max-Min
Latência ao primeiro passo (s)	5,9 ± 2,42	148.18 - 0.11
Latência à primeira tentativa de fuga (s)	357,81 ± 158,26	563.23 - 45.56
Latência ao primeiro chute (s)	355,95 ± 53,7	584.58 - 66.51
Latência à primeira defecação (s)	135,38 ± 31,51	486.29 - 1.98
Latência à primeira vocalização (s)	162,67 ± 49,87	742 - 8.8
Latência para a primeira luta em pé (s)	28,11 ± 6,06	255.97 - 0.35

Tabela 6: Frequência e latência para realizar comportamentos observados enquanto o gado estiver no Teste de Campo Aberto.

Figura 1: Representação tridimensional do Labirinto Zero Bovino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação tridimensional da arena para teste de campo aberto, pontuação de caneta e teste de startle. Círculos marrons indicam colocação de guarda-chuvas apenas para o Teste de Startle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Relações entre velocidade de saída, pontuação da caneta, escore de pára-quedas e produtividade em Bos indicus influenciaram os bois (n = 32). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise representativa de agrupamentos de respostas comportamentais de bovinos a uma variedade de testes de medo. Neste número, foram avaliados o número de etapas realizadas durante o Labirinto Zero Bovino (BZM), o Teste individual de Startle, o Teste de Campo Aberto (OFT) e o Teste de Início de Grupo (Teste de Início de Partida) com o Chute Score, Pen Score, Exit Velocity e Average Daily Gain. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material Suplementar 1: Animais que se comportam nas diferentes pontuações descritas no manuscrito. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Material Suplementar 2: Vídeo time-lapse da construção do labirinto zero. Clique aqui para ver este arquivo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Discussão

Velocidade de saída e pontuação de chute
O EV e o CS são ambos avaliados enquanto o animal está sendo processado através de um pára-quedas de manuseio. Embora o comportamento do gado tanto para o EV quanto para o CS seja quantificado durante o mesmo cenário, as respostas comportamentais a esses dois testes não estão relacionadas²⁴. Isso sugere que o cenário em que o EV (por exemplo, escapando da contenção) e o CS (por exemplo, contenção duradoura) são avaliados de forma diferente pelo gado, e posteriormente avaliar diferentes sistemas emocionais. O EV avalia o comportamento do gado como eles estão fugindo da contenção e, portanto, pensa-se em avaliar o sistema FEAR enquanto o CS pode avaliar rage. A SC avalia o comportamento do gado enquanto é contido no paraquedas de manuseio(Tabela 2),podendo, portanto, ser um bom proxy para o sistema emocional RAGE.

Pesquisas substanciais têm sido conduzidas sobre a relação entre EV e produção, saúde e traços comportamentais. Embora o EV possa ser influenciado pela experiência anterior de um animal, essa métrica objetiva pode ser eficaz na quantificação do sistema FEAR, uma vez que foram identificadas relações substanciais entre EV e saúde, produtividade, reprodução e comportamento. Bovinos com EV mais rápido têm taxas de crescimento reduzidas¹⁴, má qualidade da carcaça^11,25, função imunológica reduzida²⁰, e níveis mais altos de cortisol durante o manuseio¹⁰. Esta medida pode fornecer informações sobre o comportamento na caneta doméstica, pois o EV está positivamente correlacionado com a contagem de passos na caneta¹³. Do ponto de vista da gestão animal, o gado com EV mais rápido é mais difícil de manusear, apresentam maior risco para os manejos dos animais e podem influenciar o comportamento dos companheiros de rebanho. Embora o EV possa ser uma boa métrica para avaliar o FEAR, ele não mede todos os sistemas emocionais. Portanto, são necessários testes adicionais para avaliar todos os sistemas emocionais que influenciam a produção e o bem-estar.

Pontuação da caneta
O PS avalia subjetivamente a disposição do gado de ser abordado por um humano (Tabela 3) e pode ser útil na avaliação do sistema PÂNICO. No entanto, o PS tem sido criticado pela falta de objetividade, pois diferentes avaliadores podem ter interpretações diferentes de comportamento, e várias avaliações subjetivas têm sofrido com a baixa confiabilidade inter-rater²⁶.

Teste de ereção de arrancada
A ansiedade é altamente evoluída em todas as espécies de presas. Altos níveis de MEDO ajudam a proteger o animal da dor e ativa os eixos simpatismo-adrenal e hipotalâmico-hipófise-adrenal como parte da luta ou fuga e resposta ao estresse a um perigo percebido. O teste de choque avalia a resposta de um animal a estímulos súbitos e novos, e foi identificado como uma medida eficaz na identificação de diferenças comportamentais entre diferentes cepas genéticas de suínos²⁷. O teste de recomeço pode ser eficaz na avaliação da sensibilidade e reatividade do sistema simpatista- adrenal, que tem consequências relevantes para a produção quando ativado e pode fornecer uma visão sobre o sistema FEAR.

Teste de campo aberto
O OFT é o teste mais usado. O OFT foi originalmente projetado para avaliar a ousadia individual dos animais, ou a vontade de entrar em uma arena aberta, um ambiente que pode ser percebido como perigoso e arriscado para a sobrevivência do animal. O OFT foi validado para espécies que instintivamente buscam abrigo e evitam espaços abertos, como roedores, galinhas e perus¹⁶.

O gado evoluiu para viver em campos abertos, portanto, o OFT pode não induzir as respostas comportamentais e fisiológicas associadas ao MEDO e pode ser mais adequado para avaliar o isolamento social (PÂNICO/LUTO) ou exploração (SEEKING). Além disso, o OFT avalia animais individuais, e como o gado é animal de rebanho gregário, a experiência do OFT pode estar provocando uma resposta emocional diferente do FEAR. O OFT não tem uma forte correlação com outros testes de MEDO e os resultados são difíceis de interpretar (ou seja, muitos fatores podem levar à mesma atividade). Portanto, o OFT não é recomendado como um teste de MEDO geral para o gado¹⁶ e pode não fornecer uma compreensão abrangente dos sistemas FEAR em bovinos. O OFT pode, no entanto, ser uma ferramenta útil para quantificar o PANIC ou os sistemas SEEKING em bovinos.

O sistema SEEKING é essencial para que os animais adquiram os recursos necessários para a sobrevivência. Altos níveis de BUSCA provocam intensa, persistente exploração entusiasmada, excitação apetitosa e antecipatória, e aprendizado. Este sistema pode resultar em locomoção para a frente, pois o animal é motivado a explorar seu entorno. A BUSCA pode desempenhar um papel em emoções positivas e negativas; BUSCA positiva pode gerar um senso de propósito, enquanto a BUSCA negativa pode resultar em comportamentos associados à segurança²⁸. Vacas que passaram mais tempo explorando e explorando uma porção maior da gama (por exemplo, ativação mais forte de SEEKING) comeram mais rápido enquanto estavam em confinamento, tinham bezerros com pesos mais pesados de desmame, maiores concentrações de cortisol durante o confinamento e intervalos pós-parto mais curtos para estrus²⁹. Portanto, o sistema SEEKING pode ter implicações de produção e bem-estar. Identificar animais com alta ativação do sistema SEEKING pode ser mais bem sucedido em ambientes extensos onde a aptidão individual e reprodutiva depende da capacidade do animal de encontrar recursos e abrigo. No entanto, animais com alta ativação do sistema SEEKING podem experimentar níveis mais elevados de estresse e frustração durante o confinamento.

Labirinto Zero Bovino
Os testes comumente utilizados em pesquisas biomédicas que são projetados para avaliar a eficácia do desenvolvimento de medicamentos antidepressivos e antidepressivos em roedores são o labirinto elevado mais (EPM) e o labirinto zero elevado (EZM)³⁰. Esses testes exploram o comportamento instintivo do roedor e sua propensão natural a lugares escuros e fechados para quantificar sua vontade de explorar ambientes que seriam inerentemente temerosos ou induziriam ansiedade. As métricas desses testes podem incluir a latência de deixar o braço escurecido do labirinto, a duração do tempo nos braços abertos e fechados do labirinto e o número de transições entre os dois ambientes durante o período de teste, bem como o comportamento do animal (por exemplo, vocalização, urinação, defecação, tentativas de fuga) durante o teste³¹.

O EPM e o EZM são ambos testes bem validados para quantificar medo/ansiedade em roedores^15,31. Um EPM modificado tem sido usado para quantificar a resposta fear em suínos^32, mas não foi utilizado em ruminantes. No entanto, o PME tem sido criticado por sua ambiguidade de interpretação sobre o comportamento na praça central do labirinto. Portanto, o EZM foi projetado para avaliar as mesmas métricas do EPM, mas permite exploração ininterrupta sem ambiguidade. Ao identificar um teste para avaliar o MEDO/ANSIEDADE e a BUSCA no gado, o EZM foi um modelo lógico. O EZM é propício ao comportamento natural do gado, pois eles instintivamente se movem em padrões circulares e têm uma propensão para retornar às áreas de onde vieram.

Aplicando princípios semelhantes ao EZM com um inverso de interpretação, um Labirinto Zero Bovino³³ foi desenvolvido para avaliar os sistemas FEAR, PANIC/GRIEF e SEEKING no gado. O gado evoluiu para viver em espaços abertos; portanto, o gado com ativação reduzida dos sistemas FEAR e PANIC/GRIEF estará mais disposto a passar tempo nas porções abertas do BZM do que as porções escureciadas do labirinto, será menos propenso a entrar nas porções fechadas do labirinto, e realizará mais tentativas de fuga.

Quantificar o comportamento do gado em múltiplas avaliações pode identificar relações emocionais complexas que podem ter significância econômica, são facilmente medidas e podem ser incluídas nos esforços de seleção de reprodução. Os circuitos emocionais de PLAY, LUST e CARE não foram avaliados neste estudo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electronic timers	FarmTek, Wylie, TX
Priefert Cattle Panels	Priefert Rodeo & Ranch Equipment, Mount Pleasant, TX, USA
Shade Cloth	Windscreen4less, San Bernardino, CA, USA	Heavy Duty Privacy Screen Fence in Color Solid Black
SILENCER Commerical Pro	Silencer Hydraulic Chutes, Stapleton, NE
Umbrella	WinCraft	Model# A04852, Winona, Minnesota
Video Camera	Canon	Canon VIXIA HF R800 HD, Mellville, NY, USA