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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Resumo

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Introdução

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em umaforma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos importantes, tais como iniciação do ciclo de vida do vírus (ligação e fusão), patogênese viral, imunogenicidade, apoptose celular hospedeira e tropismo celular, a via endocítica celular, bem como a transmissão e reassortmentinterespécies 1,3,4,5,6,7. Pesquisa sobre glicoproteínas envelope viral nos ajudará a entender muitos aspectos do processo de infecção viral. Partículas virais pseudodigitadas (pp), também denominadas pseudovirions ou pseudopartículas, podem ser geradas através de uma técnica de pseudotipagem8,9,10. Esta tecnologia tem sido utilizada para desenvolver partículas pseudodigitadas de muitos vírus, incluindo hepatite C11,12,hepatite B13,vírus da estomatite vesicular (VSV)14,15,e vírus da gripe16,17,18,19. Esta tecnologia é baseada na proteína Gag-Pol de lentivírus ou outros retrovírus.

Partículas virais pseudodigitadas podem ser obtidas usando um sistema de três plasmídeos cotransfecting um plasmid de expressão de glicoproteína envelope viral, uma embalagem retroviral plasmid faltando o gene env envelope, e um plasmid repórter separado em células produtores pp. O retrovírus é montado por sua proteína Gag, e buds de uma membrana celular infectada que expressa o vírus envelope proteína1. Portanto, é possível obter pps de gripe de alto titer usando a proteína gag retrovírus para produzir botões em uma membrana celular expressando influenza HA e NA. Em nossos estudos anteriores, has/nas em todas as combinações foram funcionais e capazes de executar suas funções correspondentes no ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estes pps são usados para investigar características biológicas da gripe, incluindo a hemaglutinação, a atividade da neuraminidase, o tropismo obrigatório do HA-receptor, e a infectividade. Como ha e NA são proteínas funcionais de superfície importantes no ciclo de vida viral, HAs e NAs incompatíveis derivados de diferentes cepas de gripe podem demonstrar parcialmente a ressortição entre eles. Aqui, geramos oito tipos de influenza pps, combinando dois HAs e dois NAs (derivados da cepa HPAI H5N1 e da mancha H7N9), usando um sistema de pseudotipagem de três plasmídeos. Estes oito tipos de pps incluem dois pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dois pps incompatíveis, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; e quatro pps que abrigam apenas uma única glicoproteína (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Estudos sobre o vírus influenza, como H5N1 e H7N9, são limitados por requisitos de biossegurança. Todos os estudos das cepas do vírus da gripe selvagem devem ser realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança (BSL-3). A tecnologia de partículas virais pseudodigitadas pode ser usada para empacotar um virion artificial em um ambiente de nível 2 de biossegurança (BSL-2). Portanto, pps representam uma ferramenta mais segura e útil para estudar os processos do vírus da gripe, dependendo de suas duas principais glicoproteínas: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).

Este protocolo descreve a geração desses pps com uma estratégia de cotransfecção de três plasmid (vista geral na Figura 1),como quantificar pps e detecção de infectividade. A produção pp envolve três tipos de plasmídeos (Figura 1). O gene gag-pol, que codifica a proteína Gag-Pol retrovírus, foi clonado de um kit de embalagem retrovírus e inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-Gag-Pol. O gene de proteína fluorescente verde melhorada (eGFP), que codifica a Proteína Fluorescente Verde, foi clonado do vetor pTRE-EGFP, inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-GFP. Durante a clonagem, uma seqüência de sinal de embalagem () foi adicionada através de uma cartilha. Os genes HA e NA foram clonados em um plasmid pVRC, chamado pVRC-HA e pVRC-NA, respectivamente. O último plasmídeo codifica a proteína de fusão e pode ser substituído por qualquer outra proteína de fusão de interesse. Nossa plataforma de pseudotipagem inclui dois plasmídeos de expressão glicoproteína: pVRC-HA e pVRC-NA. Isso pode simplificar a pesquisa sobre a revariedadeção entre diferentes cepas de vírus em uma configuração BSL-2.

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Protocolo

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura

  1. Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2)até cerca de 80% de confluentes.
    NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas.
  2. Lave cuidadosamente as células com 5 mL de sosteilo tampão de fosfato (PBS) 1x.
    NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.
  3. Remover PBS e dissociar as células com 1 mL de 0,25% trypsin-etileno diamina tetâtica solução (EDTA) solução. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por não mais de 5 min até que as células sejam dissociadas.
  4. Desativar a trypsin adicionando 5 mL de DCM. Disperse as células em uma suspensão unicelular por pipetting cima e para baixo várias vezes.
  5. Transfira as suspensões celulares para um tubo de centrífuga pré-refrigerado de 15 mL. Colete as células por centrífuga a 250 x g por 5 min a 4 °C.
  6. Decantar o máximo possível do supernatant. Resuspenda a pelota celular com 6 mL de dcm médio e contar as células. Diluir as células para 1 x 106 células/mL com dcm médio.
  7. Semeie as células em uma placa de 6 poços com 1 mL de suspensão celular por poço. Gentilmente pat a placa para distribuir uniformemente as células. Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.

2. Dia 2: Cotransfecção de quatro plasmídeos mediada por Lipofection

  1. Verifique a morfologia celular e densidade um microscópio de luz invertida. Idealmente, as células devem ser aproximadamente 85% confluent na transfecção. Substitua o meio com 1 mL de dmem sem soro médio por poço, e depois coloque a placa de volta para a incubadora.
    NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.
  2. Para que cada poço de células cultivadas seja transinfectado, diluir 8 μL do reagente de transfecção a um volume de 150 μL com soro médio reduzido (tubo 1). Misture suavemente e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT, aproximadamente 20 °C).
    NOTA: Para cada amostra de transfecção, prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, numerados 1 e 2.
  3. No tubo 2, diluir 2,5 μg de DNA plasmídeo em 150 μL de médio soro reduzido.
    NOTA: No tubo 2, diluir cada DNA plasmídeo, como mostrado na Tabela 1. Um plasmid codificando o vírus da estomatite vesicular (VSV) G glicoproteína (plasmídeo pLP-VSVG) foi usado como um controle positivo, porque VSV é capaz de infectar uma ampla gama de células. Partículas de controle negativo que não possuem glicoproteínas de envelope de gripe (Δenv pps) foram geradas usando plasmídeos pcDNA-Gag-Pol e pcDNA-GFP.
  4. Após uma incubação de 5 min, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído. Misture suavemente e incubar por mais 15 min em RT.
  5. Adicione o complexo dna-lipídio ao poço correspondente contendo as células e o meio livre de soro. Misture suavemente balançando a placa para frente e para trás.
  6. Após a incubação de 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2, remover o meio e substituir por 2 mL de DMEM. Incubada por mais 36-48 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: Substitua o DMEM sem soro e sem anticorpos. Neste protocolo, dois HAs e dois NAs podem ser usados para gerar oito tipos de pps (mostrado na Tabela 1).

3. Dia 3: Semeadura de células suscetíveis

  1. Para o ensaio da infectividade, semente cada tipo de células suscetíveis em 1 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços.
    NOTA: Use dois tipos de célula-alvo para realizar o ensaio da infectividade neste artigo: uma linha de células humanas derivada de alveolar (células A549) e as células do Rim Canino Madin-Darby (MDCK). As células MDCK são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe e podem ser um bom controle. Este passo é flexível. Quaisquer outras linhas de células-alvo podem ser usadas de acordo com os requisitos de pesquisa.
  2. Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.

4. Dia 4: Pseudodigitado Coleção de Partículas Virais, Quantificação e Ensaio de Infectividade

  1. Coleção de partículas virais pseudodigitadas
    1. Verifique a cor do meio. Idealmente, deve ser rosa claro ou ligeiramente laranja. Examine as células com um microscópio biológico fluorescente invertido 440-460 nm.
    2. Em 36-48 h pós-transfecção, colher os pps passando por um 0,45 μm policinadeno fluoreto (PVDF) filtro de membrana para eliminar detritos celulares.
    3. Divida os pps em alíquotas de pequeno volume.
    4. Armazenar os pps em -80 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. No entanto, isso não é incentivado, porque a infectividade dos pps vai diminuir drasticamente após o congelamento e descongelamento.
  2. Quantificação de partículas virais pseudodigitadas
    1. Transfira 20 μL de pps purificados para um tubo de microcentrífuga livre de 1,5 mL (RNase).
    2. Adicione 1 μL de 0,24 U/mL nuclease benzonase. Incubar a 37 °C para 1 h para eliminar qualquer contaminação por DNA e RNA.
      NOTA: O RNA alvo, citomegalovírus comumente downregulated (CMV)-GFP RNA, é embalado nos pps e pode evitar ser degradado por nuclease benzonase.
    3. Congele a amostra a -70 °C para inativar a nuclease benzonase.
    4. Adicione 2 μL de proteinase K. Incubate em 50 °C para 30 min para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Inativar o proteinase K a 100 °C por 3 min.
    5. Quantificar os pps por transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT)-PCR com uma sonda universal um passo RT-qPCR Kit, usando a cartilha para a frente 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTAA-3', a cartilha reversa 5'-GT GGCTCCTCATGAGTGAGGACTAC-3', e a sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAGACCCCCGAG-TAM-3', em um termociclor PCR em tempo real. Normalize os pps para o número da cópia do RNA antes da infectividade.
  3. Ensaio da infectividade
    1. Diluir cada tipo de pps em termos dos dados qRT-PCR para 4 x 105 cópias/mL (normalização pp).
    2. Adicione tosyl-fenilalanina clorometila-cetona (TPCK) trippsina a uma concentração final de 40 μg/mL em pps que abrigam H7N9 HA. Incubar a 37 °C para 1 h para formar suas subunidades funcionais HA1 e HA2.
      NOTA: Não há necessidade de tratar os pps que abrigam H5 com TPCK-trippsina, porque eles têm vários resíduos de arginina e lysina no local de clivagem HA1-HA2. Este local de clivagem multi-básico pode ser cloado por proteases celulares onipresentes.
    3. Misture pps normalizados com médio DMEM (livre de soro) em uma proporção de 1:1 (volume/volume).
    4. Traga a placa contendo células suscetíveis para o armário de biossegurança.
    5. Ascutu o supernatant e lave as pilhas uma vez com 0.1 mL de PBS prewarmed.
    6. Adicione 0,1 mL de mistura pps-DMEM a um poço. Triplica os testes de infectividade de cada tipo de pps para uma linha celular suscetível (visualizada na Figura 2).
    7. Incubar a placa de 96 poços para 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
    8. Aspirar o supernatant e substituir por 0,1 mL de DCM.
    9. Incubar a placa de 96 poços para mais 24-36 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.

5. Dia 5 ou 6: Detecção de infectividade

  1. Traga a placa de 96 poços para o armário de biossegurança.
  2. Ascutu o supernatant e lave as pilhas 1x com 0.2 mL de PBS prewarmed.
  3. Remover PBS e dissociar as células com 0,1 mL de 0,25% solução trypsin-EDTA.
  4. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 3 min até que as células sejam dissociadas.
    NOTA: Evite incubar por mais de 5 min, porque isso levará à aglomeração celular.
  5. Desativar a trypsin adicionando 0.4 mL de DCM.
  6. Disperse as células em suspensão unicelular por tubulação para cima e para baixo várias vezes.
  7. Transfira as suspensões celulares para um tubo de microcentrífuga refrigerados de 1,5 mL.
  8. Determine as células positivas para repórter sgfp com triagem de células ativadas por fluorescência (FACS).
    NOTA: Para determinar a proporção de células-alvo positivas para repórters da GFP, defina portões de citometros de fluxo usando as amostras de controle (células A549 não tratadas ou células MDCK não tratadas) e, em seguida, conte as células positivas do repórter gfp de 10.000 células por amostra.

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Resultados

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) s?...

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Plano Provincial de Medicina e Ciência e Tecnologia da Saúde de Zhejiang (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Projeto chave de tecnologia (Grant Numbers, 2014Z11) e Hangzhou projeto municipal de aplicação autônoma de desenvolvimento social e pesquisa científica (Grant Numbers, 20191203B134).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Benzonase NucleaseMillipore70664Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)Corning3599Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)Costar3516Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)Gibco11965092A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serumExcellFND500fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)Beckman coultercytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cellsATCCCRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cellsATCCCRL-11268A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscopeOlympusBX51-32P01-FLB3
Inverted light microscopeOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitNEBE3006LWill withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellsATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDFMilliporeSLHV033RSan improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycinGibco15140122Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)Corning430791a stable and highly reactive serine protease
Proteinase KBeyotimeST532Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)Corning430166Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsinSigmaT1426This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056

Referências

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