Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

Resumo

Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.

Resumo

Durante o processo de bioimpressão tridimensional baseado em extrusão, bioinks semelhantes a líquidos com baixa viscosidade podem proteger as células contra danos na membrana induzidos pelo estresse da tesoura e melhorar a sobrevivência das células encapsuladas. No entanto, a rápida sedimentação celular movida pela gravidade no reservatório poderia levar a uma distribuição celular inhomogênea em estruturas bioimpressoras e, portanto, dificultar a aplicação de bioinks semelhantes a líquidos. Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (por exemplo, methacryloyl de gelatina com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas. Várias interfaces líquidas foram manipuladas no bioink multicamadas para fornecer retenção interfacial. Consequentemente, a ação de sedimentação celular que atravessa camadas adjacentes no sistema multicamadas foi retardada no reservatório de bioink. Verificou-se que a retenção interfacial era muito maior do que a atração sedimental das células, demonstrando um papel crítico da retenção interfacial na prevenção da sedimentação celular e promovendo uma dispersão mais homogênea das células no bioink multicamadas.

Introdução

A bioimpressão tridimensional (3D) tem sido um método promissor para a fabricação de réplicas arquitetônicas e funcionais complexas de tecidos nativos em biofabbricação e medicina regenerativa^1,,2,3. As estratégias comuns de bioimpressão, incluindo jato de tinta, extrusão e impressão estereotipada, têm prós e contras de diferentes perspectivas⁴. Entre essas técnicas, o procedimento de extrusão é mais comumente utilizado devido ao seu custo-efetividade. A Bioink desempenha um papel fundamental na estabilidade do processo da bioimpressão de extrusão. O bioink ideal carregado de células não deve ser apenas biocompatível, mas também ser adequado para propriedades mecânicas⁵. Bioinks com baixa viscosidade são tipicamente apresentados como um estado líquido. Essas bioinks podem ser facilmente e rapidamente depositadas e evitar danos na membrana celular induzidos pelo alto estresse da tesoura durante a extrusão. No entanto, em casos complexos que requerem períodos de impressão de longo prazo, a baixa viscosidade muitas vezes dá origem à inevitável sedimentação das células encapsuladas no reservatório bioink, que geralmente é impulsionado pela gravidade e leva a uma dispersão celular inhomogênea no bioink^6,7. Consequentemente, um bioink com dispersão celular inhomogênea dificulta a bioimpressão in vitro de uma construção de tecido funcional.

Vários estudos recentes com foco em bioinks relataram a promoção da dispersão homogênea das células encapsuladas. Um bioink alginato modificado baseado em crosslinking de dois estágios foi usado para a bioimpressão de extrusão⁸. Um polímero alginato foi modificado com peptídeos e proteínas neste estudo. As células apresentaram uma distribuição mais homogênea neste alginato modificado do que no alginato comumente utilizado devido aos locais de fixação fornecidos pelos peptídeos e proteínas. Alternativamente, bioinks misturados têm sido utilizados para resolver a sedimentação de células em bioink. Um bioink misturado contendo polietileno glicol (PEG) e gelatina ou gelatina methacryloyl (GelMA) com robustez mecânica melhorada foi utilizado em outro estudo⁹. As células encapsuladas apresentaram uma distribuição homogênea principalmente porque a viscosidade do bioink misturado foi melhorada. Em geral, há vários fatores que influenciam a dispersão das células encapsuladas no bioink, como a viscosidade do bioink, a gravidade das células, a densidade das células e a duração do período de trabalho. Entre esses fatores, a gravidade das células desempenha um papel fundamental na promoção da sedimentação. A flutuação e o atrito fornecidos pelo bioink viscoso foram investigados como as principais forças contra a gravidade até o momento¹⁰.

Nesse meio tempo, desenvolvemos uma nova estratégia para promover a dispersão homogênea das células encapsuladas em bioink manipulando múltiplas interfaces líquidas no reservatório de bioink. Essas interfaces líquidas criadas pela modificação multicamadas do bioink podem não apenas fornecer retenção interfacial, que retarda a sedimentação das células, mas também manter uma biocompatibilidade adequada e comportamento reológico do bioink. Na prática, modificamos a solução aquosa gelma (5%, w/v) com fibroine de seda (SF) de forma multicamadas para produzir longitudinalmente quatro interfaces, proporcionando tensões interfaciais no bioink misturado. Como resultado, o carregamento de gravidade nas células foi compensado pela tensão interfacial feita pelo homem, e uma dispersão quase homogênea das células encapsuladas no bioink foi obtida devido à menor sedimentação através das camadas adjacentes das células. Nenhum protocolo semelhante para retardar a sedimentação de células encapsuladas manipulando a retenção interfacial em bioinks líquidos foi relatado até o momento. Apresentamos nosso protocolo aqui para demonstrar uma nova maneira de resolver a sedimentação celular na bioimpressão.

Protocolo

1. Preparação do SF-GelMA carregado de células

1. Esterilize todos os materiais utilizando unidades de filtro de seringa de 0,22 μm. Realize todas as etapas em um armário de segurança biológica.
2. Aqueça 1x PBS a 50 °C, e dissolva a gelatina no 1x PBS aquecido com agitação. A concentração final de gelatina na PBS deve ser de 10% (w/v).
3. Adicione o anidrido de metáclico na solução de gelatina (razão de peso do anidrido de acrílico à gelatina de 0,6 a 1) lentamente com agitação, e misture o complexo por pelo menos 1 h (50 °C). Normalmente, prepare 200 mL de solução de gelatina de 10% com 12 g de anidrido metacrílico; o volume depende das necessidades do estudo.
4. Transfira a solução mista contendo gelatina e anidrido de metacrílico para um tubo estéril de 50 mL.
5. Centrifugar a solução mista a 3.500 x g. Geralmente leva de 3 a 5 minutos para obter duas camadas. Colete a camada superior (GelMA) e descarte a camada inferior (anidrido de metacrílico não redigido).
6. Diluir a solução de camada superior obtida na etapa 1.5 com dois volumes de água deionizada (40-50 °C).
7. Dialise a solução obtida na etapa 1.6 com uma membrana de diálise de corte de peso molecular de 12-14 kDa contra água desionizada por 5-7 dias (40-50 °C). Troque a água duas vezes por dia.
8. Colete e congele a solução GelMA a −80 °C durante a noite.
9. Lyophilize a solução GelMA por 3-5 dias em um secador congelado com a temperatura definida para -45 °C e a pressão definida para 0,2 mbar.
10. Dissolver o GelMA liofilizado (grau de substituição de aproximadamente 75%) em 1x PBS contendo 10% FBS (soro bovino fetal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N-etano-ácido sulfônico) e fotoinitiador (0,5%, w/v) para obter a preparação do bioink GelMA.
    NOTA: O grau de substituição do GelMA pode ser calculado por um ensaio de ninidrina³.
11. Misture a solução GelMA (10%, w/v) com diferentes volumes de solução SF inicial (5%, w/v) e diferentes volumes de 1x PBS para obter bioinks SF-GelMA com diferentes concentrações de SF. A proporção por 1 mL de solução de GelMA e SF nos diferentes bioinks é apresentada na Tabela 1.
    NOTA: Todos os bioinks devem conter uma concentração final de 5% (p/v) GelMA, mas a concentração de SF varia: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5% (w/v) nos diferentes bioinks SF-GelMA. Use SF-M-Layered-GelMA para denominar o bioink GelMA modificado com SF de forma camada por camada. Use SF-X-GelMA para denominar aqueles GelMA modificados com SF de forma homogênea (por exemplo, GelMA com modificação de 1% de SF foi denominado SF-1-GelMA).
12. Sonicate todas as bioinks por 10-20 min.
13. Cultivar células NIH3T3 utilizando DMEM (meio Águia modificada de Dulbecco) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora (37 °C com 5% de CO₂). Passagem das células a uma razão de 1:3 quando a densidade atinge 80%.
14. Centrifugar a suspensão das células NIH3T3 a 1500 rpm por 5 min. Remova o supernasal com sucção e resuspenque a pelota celular com solução de bioink fresco em um tubo estéril de 15 mL.
    NOTA: A concentração das células encapsuladas no bioink deve ser de 1 x 10⁶ células/mL, e a concentração precisa ser calculada com um citômetro.
15. Use 2 mL de diferentes bioinks SF-GelMA para suspender as pelotas celulares para obter várias bioinks carregadas de células.

2. Carregamento, reaquecimento e bioimpressão do SF-M-Layered-GelMA

1. Carregue 0,4 mL de SF-0,5-GelMA carregado de células na camada inferior da seringa.
   NOTA: Utilize uma seringa de 2 mL como reservatório de bioink neste estudo. Carregue diferentes bioinks SF-GelMA na seringa de forma camada por camada.
2. Coloque a seringa no banho de água gelada (0 °C) por 5 minutos para fazer com que o bioink de camada inferior se transforme em um estado de gel.
3. Carregar 0,4 mL de bioink SF-0,75-GelMA carregado de células acima da camada inferior.
4. Coloque a seringa com as duas camadas de bioinks em um banho de água gelada (0 °C) por 5 minutos para fazer com que as duas camadas de bioinks se transformem em um estado de gel.
5. Pedale as etapas de carga e resfriamento mais 3 vezes com os 3 tipos restantes de bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) para obter um sistema de bioink multicamadas com diferentes concentrações de SF nas diferentes camadas. O volume utilizado para o carregamento de todas as bioinks deve ser de 0,4 mL.
6. Reaqueça o bioink multicamadas colocando a seringa em uma incubadora (37 °C) por 30 minutos antes da bioimpressão.
7. Use uma seringa de 2 mL como reservatório de bioink com um bocal de impressão de 27 G. Ajuste a velocidade de fluxo em 50 μL/min, a velocidade de movimento do bocal a 2 mm/s e a altura do bocal a 1 mm. Realize o procedimento de bioimpressão à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C).
   1. Imprima a construção do tecido de forma extrusiva usando uma bioimpressora personalizada sob os parâmetros adaptados de nossos estudos anteriores^11,12.
8. Use luz ultravioleta (365 nm, 800 mW) para 40 s para cruzar a construção de tecido bioimpresso.
9. Cultura o tecido cruzado construído em DMEM (meio Águia modificada de Dulbecco) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora (37 °C com 5% de CO₂). O meio foi trocado a cada 8h durante os primeiros 2 dias e a cada 2-3 dias depois.

Resultados

Um esquema da preparação de bioinks carregados de células é mostrado na Figura 1. Após a preparação dos diferentes bioinks, foram realizados carregamentos, reaquecimentos e bioimpressões(Figura 2). Para avaliar a distribuição das células encapsuladas no reservatório bioink, foi realizado um procedimento de bioimpressão utilizando três bioinks carregados de células diferentes em três placas de 96 poços(Figura 3A). Do...

Discussão

A estabilidade do sistema multicamadas é um ponto-chave para executar este protocolo com sucesso. Teoricamente calculamos a difusão de moléculas de SF na solução GelMA baseada no estudo de Nauman¹³. Verificou-se que a difusão de proteínas em solução estava relacionada ao seu peso molecular. O peso molecular médio (MW) da albumina de soro bovino (BSA) é de 66,5 kDa, e seu coeficiente de difusão é de 64-72 μm²/s. O MW médio de fibrinogênio é de 339,7 kDa, e seu coeficient...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154