Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Resumo

O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.

Resumo

Neurônios motores (MNs) são células altamente polarizadas com axônios muito longos. O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde da MN, contribuindo para o crescimento neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Descrevemos um método detalhado para o uso de câmaras microfluidas (MFCs) para o rastreamento do transporte axonal de organelas fluorescentemente rotuladas em axônios MN. Este método é rápido, relativamente barato, e permite o monitoramento de pistas intracelulares no espaço e no tempo. Descrevemos um protocolo passo a passo para: 1) Fabricação de MFCs polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimento de explantas medulares ventral e cultura dissociada de MN em MFCs; 3) Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos seguidos de imaginação confocal viva; 4) Análise manual e semiautomatizada do transporte axonal. Por último, demonstramos uma diferença no transporte de mitocôndrias e compartimentos ácidos da medula espinhal bcólmila HB9::GFP da medula espinhal explante axôns como prova da validade do sistema. Ao todo, este protocolo fornece uma ferramenta eficiente para estudar o transporte axonal de vários componentes axonais, bem como um manual simplificado para o uso de MFC para ajudar a descobrir possibilidades experimentais espaciais.

Introdução

As Esms são células altamente polarizadas com axônios longos, alcançando até um metro de comprimento em humanos adultos. Esse fenômeno cria um desafio crítico para a manutenção da conectividade e função MN. Consequentemente, as MNs dependem do transporte adequado de informações, organelas e materiais ao longo dos axônios do corpo celular para a sinapse e para trás. Vários componentes celulares, como proteínas, RNA e organelas são transportados regularmente através dos axônses. Mitocôndrias são organelas importantes que são rotineiramente transportadas em MNs. Mitocôndrias são essenciais para a atividade e função adequada das Ems, responsáveis pelo fornecimento de ATP, tampão de cálcio e processos de sinalização^1,2. O transporte axonal das mitocôndrias é um processo bem estudado^3,4. Curiosamente, foram relatados defeitos no transporte mitocondrial envolvidos em diversas doenças neurodegenerativas e especificamente em doenças de MN⁵. Compartimentos ácidos servem como outro exemplo para organelas intrínsecas que se movem ao longo de axônios MN. Compartimentos ácidos incluem lisôsôssomos, endóssomos, aparelhos trans-Golgi e certas vesículas secretas⁶. Defeitos no transporte axonal de compartimentos ácidos foram encontrados em diversas doenças neurodegenerativas^{também 7}, e artigos recentes destacam sua importância nas doenças de MN⁸.

Para estudar com eficiência o transporte axonal, são utilizadas câmaras microfluidas que separam compartimentos somáticos e axonais^9,,10. As duas vantagens significativas do sistema microfluido, e a compartimentação e o isolamento dos axônios, tornam-no ideal para o estudo dos processos subcelulares¹¹. A separação espacial entre os corpos das células neuronais e os axôonos pode ser usada para manipular os ambientes extracelulares de diferentes compartimentos neuronais (por exemplo, axôns vs. soma). Ensaios bioquímicos, de crescimento/degeneração neuronais e imunofluorescência todos se beneficiam desta plataforma. Os MFCs também podem auxiliar no estudo da comunicação celular-célula, codificando neurônios com outros tipos de células, como músculos esqueléticos^12,,13,14.

Aqui, descrevemos um protocolo simples, mas preciso, para monitorar mitocôndrias e o transporte de compartimentos ácidos em neurônios motores. Mostramos ainda o uso deste método comparando a porcentagem relativa de organelas móveis retrógradas e anterogradas, bem como a distribuição da velocidade de transporte.

Protocolo

O cuidado e tratamento dos animais neste protocolo foram realizados sob a supervisão e aprovação do Comitê de Ética Animal da Universidade de Tel Aviv.

1. Preparação do MFC

1. Fundição PDMS em moldes primários (Figura 1)
   1. Comprar ou criar moldes primários (wafers) seguindo um protocolo detalhado⁹.
   2. Use ar pressurizado para remover qualquer tipo de sujeira da plataforma de wafer antes de seguir para a etapa de revestimento. A superfície dos wafers deve parecer lisa e clara.
   3. Encha um recipiente com 50 mL de nitrogênio líquido. Prepare uma seringa de 10 mL e 23 G de agulha.
      NOTA: Todos os procedimentos a partir deste passo em frente devem ser realizados em uma coifa química.
   4. Na capa química, use a seringa e a agulha para agrupar 2 mL de nitrogênio líquido. Embora possa parecer que o ar foi desenhado, a seringa é preenchida com nitrogênio(Figura 1A). Coloque a placa contendo wafer em um recipiente vedado.
   5. Abra uma garrafa de clorotrimelana, fure a tampa de borracha usando a seringa cheia de nitrogênio e injete todo o conteúdo da seringa no frasco. Sem puxar a agulha, vire a garrafa de cabeça para baixo e recue 2 mL de clorotrimelana.
      NOTA: Devido à pressão da seringa, uma pequena quantidade de clorotrimetilsilano é pulverizada para fora da agulha. Para evitar riscos, aponte a agulha para a parede interna do capô(Figura 1B).
   6. Espalhe clorotrimetilsilano uniformemente no recipiente (a partir do passo 1.1.4), mas não diretamente na wafer ou placa contendo wafer. Feche o recipiente e incuba por 5 min por wafer.
      NOTA: Se esta for a primeira vez que o wafer é revestido com clorotrimetilsilano, uma incubação de 1 h deve ser permitida para cada wafer.
   7. Não tire os wafers e o recipiente da capa química por 30 min.
      ATENÇÃO: A clorotrimelaéna é altamente volátil.
   8. Pesar a base PDMS (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 50 mL e adicionar agente de cura PDMS a uma razão de 16:1, respectivamente (por exemplo, 47,05 g de base e 2,95 g de agente de cura). Misture por 10 min usando um rotador de baixa velocidade.
   9. Despeje PDMS em cada placa contendo wafer até a altura desejada(Figura 1C).
      NOTA: O uso de câmaras microfluidas finas (até 3-4 mm) melhora a aderência ao prato de cultura e evita vazamentos.
   10. Coloque todas as placas juntas dentro de um dessecador a vácuo por 2 h(Figura 1E). Este processo remove o ar preso dentro do PDMS, eliminando assim bolhas de ar e formando um molde claro e uniforme.
   11. Coloque as placas dentro de um forno por 3 h (ou durante a noite) a 70 °C(Figura 1E).
       NOTA: As placas devem estar niveladas quando colocadas no forno.
2. Fundição pdms em moldes epóxi
   NOTA: Como a preparação de wafers é cara, requer equipamentos especiais e pode danificar os frágeis wafers, é possível gerar réplicas epóxi de wafers. As réplicas são mais baratas, mais duráveis e podem ser usadas para a produção em massa de câmaras microfluidas.
   1. Lançar e curar PDMS (conforme descrito em 1.1.8-1.1.11) no wafer original.
   2. Remova e corte partes excedentes de PDMS deixando apenas os elementos microfluidos e a área funcional necessária para processá-los em câmaras microfluidas.
   3. Enrole imediatamente o PDMS com fita adesiva grossa para evitar que ele acumule poeira.
   4. Escolha um prato de plástico de grau de cultura de tecido que se encaixe em todo o PDMS dentro e deixe espaço para epóxi ao seu redor. A distância entre o PDMS e o prato de plástico deve ser inferior a 5 mm.
   5. Prepare uma pequena quantidade de PDMS misturado em uma razão de 10:1 (base:agente de cura). O PDMS líquido fresco será usado para colar o PDMS sólido na parte inferior da placa de plástico.
   6. Aplique uma quantidade mínima do PDMS líquido no fundo central da placa de plástico e, em seguida, remova a fita adesiva do PDMS e adere ao fundo da placa de plástico. Certifique-se de que os elementos microfluidos estão voltados para cima.
   7. Deixe o PDMS curar por 30 min em um forno de 70 °C.
   8. Prepare a resina epóxi misturando a base e o agente de cura em uma razão de 100:45, respectivamente, em um tubo de ensaio. Diferentes resinas epóxi podem ter diferentes proporções de mistura. O volume necessário para uma placa regular de 100 mm é de aproximadamente 40 mL.
   9. Deixe o epóxi misturar bem por 10 min em um rotor até que a mistura se torne visivelmente homogênea (ou seja, não há artefatos visíveis semelhantes a fibras no líquido).
   10. Centrifugar a mistura epóxi a 400 x g por 5 min para remover bolhas de ar presas dentro.
   11. Durante a centrifugação, espalhe uma fina camada de graxa de silicone ao redor das paredes e todas as outras partes plásticas expostas do prato de cultura. Isso evitará que o epóxi polimerizar á saturação com o plástico do prato e permitirá a remoção do epóxi curado facilmente no final do protocolo.
   12. Despeje o epóxi lentamente no prato até que ele cubra completamente o PDMS e vá além dele por pelo menos 5 mm. Evite a formação de quaisquer bolhas dentro do epóxi mantendo distância zero entre o tubo e a placa. Coloque a placa em um local seguro para que não seja movida durante as próximas 48 horas.
   13. Depois de 48 h, o epóxi deve estar completamente curado. Insira a placa em um forno pré-aquecido a 80 °C por 3 h para a cura final.
   14. Remova o epóxi curado da placa e o molde original do PDMS puxando suavemente a parede de plástico da placa até que ela quebre. Em seguida, deve facilmente separar-se do epóxi e descascar.
   15. Uma vez extraído, limpe a graxa restante da nova réplica epóxi e inseri-la de cabeça para baixo (ou seja, com os elementos microfluidos replicados voltados para cima) em um novo prato de cultura. A réplica epóxi está agora pronta para o casting do PDMS.
   16. Use ar pressurizado ou N₂ para soprar quaisquer restos de PDMS ou sujeira do molde epóxi e enxágüe-o 2x com isopropanol. Preencha-o uma terceira vez e incubar por 10 min em uma placa de agitador orbital. Enxágüe o molde novamente 3x com isopropanol e descarte o líquido restante. Seque com ar ou N₂ ou coloque em forno de 70 °C até secar.
       NOTA: Siga os procedimentos de segurança ao trabalhar e descartar isopropanol.
   17. Mantenha as placas de molde fechadas até o casting. Siga os passos 1.1.8.-1.1.11.
3. Socando e esculpindo o PDMS em um MFC (Figura 2)
   1. Corte e remova o molde pdms da placa seguindo as marcas (+) nos wafers usando um bisturi. Não use força, pois os moldes são frágeis(Figura 2A).
   2. Siga as instruções desenhadas no esboço para perfurar e cortar as câmaras dependendo da configuração experimental (Figura 2B-F).
      1. Para a cultura de explante da medula espinhal(Figura 2C,E),soque dois poços de 7 mm no lado distal de um MFC grande. Localize os poços de uma forma que eles se sobreponham com as bordas do canal. No lado proximal, soque um poço de 7 mm bem no meio do canal, com sobreposição mínima para que espaço suficiente seja deixado para as explantas. Faça dois furos adicionais de 1 mm nas duas bordas do canal proximal. Gire o MFC com os elementos microfluidos voltados para cima, e usando uma agulha de 20 G, esqueça três pequenas cavernas explantem no poço perfurado de 7 mm.
      2. Para a cultura MN dissociada(Figura 2D,F),soque quatro poços de 6 mm nas bordas dos dois canais de um Pequeno MFC.
4. Esterilização do MFC para uso de cultura de tecidos
   1. Espalhe 50 cm de fita adesiva no banco. Pressione e puxe a câmara para enfrentar a fita adesiva (tanto as faces superior e inferior) e remova a sujeira bruta. Coloque as câmaras limpas em uma nova placa de 15 cm.
      NOTA: Não pressione diretamente sobre os elementos microfluidos quando estes estiverem voltados para cima.
   2. Incubar as câmaras em grau analítico 70% de etanol por 10 min em um agitador orbital.
   3. Descarte o etanol e seque as câmaras em uma capa de cultura de tecido ou em um forno a 70 °C.
5. Colocando o MFC em um prato de fundo de vidro
   1. Coloque a câmara no centro de uma placa de fundo de vidro de 35 mm/50 mm e aplique uma pequena força nas bordas para fazer o PDMS e o fundo do prato se ligarem. Para evitar quebrar o fundo de vidro, aplique sempre força em cima de uma superfície sólida.
   2. Incubar 10 min em 70 °C. Pressione as câmaras para reforçar a adesão à placa.
   3. Incubar sob luz UV por 10 min.
6. Revestimento e cultivo
   1. Adicione 1,5 ng/mL poli-L-ornithine (PLO) aos dois compartimentos. Certifique-se de que a OLP está passando pelos canais, pipetando a mídia de revestimento algumas vezes diretamente na entrada do canal.
   2. Examine a câmara microfluida sob um microscópio leve com ampliação de 10x para verificar a presença de bolhas de ar. Se as bolhas de ar estiverem bloqueando as microranhuras, coloque o MFC em um dessecador a vácuo por 2 min. Mais tarde, remova o excesso de ar que ficou preso nos canais através deles. Incubar durante a noite.
   3. Substitua a OLP por lamina (3 μg/mL em DDW) para incubação durante a noite da mesma forma.
   4. Antes de emplacar, lave a lamina com meio de cultura neuronal.

2. Revestimento da cultura neuronal

1. Cultura de neurônios motores dissocida
   1. Usando uma tesoura reta e fórceps finos, disseque uma medula espinhal de um embrião do mouse E12.5 ICR-HB9::GFP. Trabalhe em uma solução 1X HBSS com 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) (Figura 3A-C).
   2. Usando uma tesoura de microdissecção, remova as meninges e os chifres dorsais(Figura 3D).
   3. Coletar as peças da medula espinhal e transferir para o tubo(#1)com 1 mL HBSS + 1% P/S.
   4. Corte as medulas espinhais em pequenos pedaços usando uma tesoura curva e espere as peças se fixarem.
   5. Adicione 10 μL de tripsina 2,5% e coloque em um banho de água de 37 °C por 10 min. Depois de 5 min, misture batendo no tubo. As peças devem formar uma moita em forma de hélice.
   6. Transfira a moita para um novo tubo(#2)contendo 800 μL de L-15 pré-aquecido, 100 μL de BSA 4%, e 100 μL de 10 mg/mL DNase. Moa 2x e espere 2 min para deixar as peças não dissociantes se instalarem. Transfira o sobrenadante para um novo tubo(#3).
   7. Adicione 100 μL de BSA 4%, 20 μL de 10 mg/mL DNase e 900 μL de meio neurobasal completo (CNB, ver Tabela de Materiais e Tabela 1). Moa 8x e espere 2 min. Colete sobrenadante para tubo #3.
   8. Repita o passo 2.1.7 e moa 10x. Coletar sobrenadante para tubo #3. Uma pequena quantidade de tecido deve ser deixada na parte inferior do tubo.
      NOTA: Se uma grande aglomeração ainda permanecer na parte inferior do tubo #2,repita o passo 2.1.8.
   9. Adicione 1 mL de almofada BSA 4% ao fundo do tubo #3.
   10. Centrífuga a 400 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
   11. Ressuspensa a pelota celular tocando suavemente no tubo e adicione 1 mL de meio CNB. Pipeta 6x e adicione 20 μL de 10 mg/mL DNase.
   12. Suplemento com um adicional de 5 mL de meio CNB e transferência de 3 mL para um novo tubo(#4).
   13. Adicione 1 mL de 10,4% de meio de gradiente de densidade (ver Tabela 2) ao fundo de cada tubo(#3 e #4). Uma separação de fase acentuada entre as duas interfaces deve aparecer.
   14. Centrífuga a 775 x g por 20 min à temperatura ambiente (RT). A desaceleração da centrífuga deve ser definida a um nível baixo para evitar a quebra da separação de fase.
   15. As células devem estar flutuando, aparecendo como uma interfase nublada entre a mídia. Coletar as células de ambos os tubos em um novo tubo(#5)já contendo meio CNB pré-aquecido de 1 mL.
   16. Adicione um adicional de 4-6 mL de meio CNB.
   17. Adicione 1 mL de almofada BSA de 4% na parte inferior do tubo.
   18. Centrifugação a 400 x g por 5 min em RT. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota suavemente com 1 mL de meio CNB.
   19. Conte as células. Espera-se um rendimento de 0,75-1 x¹⁰⁶ MN por medula espinhal.
       NOTA: A medula espinhal ventral também contém outros subtipos neuronais além dos neurônios motores (por exemplo, interneurônios). A pureza mn depende principalmente da remoção de áreas dorsais durante a dissecção e da capacidade de alcançar áreas rostrais enriquecidas em MN. Para garantir que os neurônios imagemdos sejam MNs, recomenda-se o uso de uma cepa de camundongos com um marcador de MN endógeno, como os ratos HB9::GFP. Para alcançar a cultura mn pura (mas com diminuição do rendimento celular), o uso de purificação FACS¹⁵ é possível.
   20. O revestimento dissociado da cultura MN no MFC
       1. Concentre 150.000 MNs por câmara por centrifugação a 400 x g por 5 min.
       2. Aspirar o sobrenadante e resuspender suavemente as células em meio neurobasal rico (RNB) a 4 μL por MFC. RNB é CNB complementada com adicional de 2% B27 e 25 ng/mL BDNF.
       3. Remova o meio de ambos os compartimentos, deixando um volume baixo equivalente a ~10 μL nos poços do compartimento distal. Aparece como um anel fino de meio no perímetro do poço.
       4. Carregue lentamente 4 μL de células no canal. Retire 4 μL do poço do outro lado do canal e carregue-os lentamente de volta diretamente para o canal para reverter o fluxo de corrente e maximizar a densidade celular no canal.
       5. Verifique se as células entraram no canal usando um microscópio de luz de 10x e coloque a câmara na incubadora por 30 min sem adicionar mais mídia.
       6. Adicione lentamente ~10-15 μL de RNB nos poços proximais e distais e coloque as câmaras na incubadora por mais 15 min.
       7. Após esta incubação, adicione lentamente ~75-80 μL de RNB em cada poço.
   21. Manutenção da cultura MN dissociada
       1. Um dia após o revestimento (DIV1), substitua o meio por RNB complementado com 1 μM de citosina arabinoside (Ara-C) para inibir o crescimento glial.
       2. Dois dias após a aplicação de Ara-C (DIV3) substituir o meio por meio CNB fresco no compartimento proximal (sem Ara-C).
       3. A fim de melhorar o cruzamento de axônses através dos microsules, aplique RNB suplementado com 25 ng/mL de fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF) e 25 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) apenas para o compartimento distal. Mantenha um gradiente de volume de pelo menos 10 μL por poço entre os poços distais axonais (maior volume) e os poços proximais.
       4. Atualize o meio a cada 2 dias. Os axônses podem levar até 4-6 dias para atravessar distalmente.
2. Cultura de explante medula espinhal
   1. Usando uma tesoura reta e fórceps finos, disseque uma medula espinhal de um embrião do mouse E12.5 ICR-HB9::GFP. Trabalhe em uma solução 1X HBSS com 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) (Figura 3A-C).
   2. Usando uma tesoura de microdissecção, remova as meninges e os chifres dorsais(Figura 3D).
   3. Corte a medula espinhal em seções transversais de 1 mm de espessura(Figura 3E). Descarte todos os meios do compartimento proximal do MFC.
   4. Pegue uma única explante medula espinhal com uma pipeta em um volume total de 4 μL. Injete a explante o mais próximo possível da caverna e retire qualquer líquido excessivo do poço proximal através das saídas laterais (1 mm de socos). As explantas devem ser sugadas para dentro do canal proximal.
   5. Adicione lentamente 150 μL de meio explante medular (SCEX, ver Tabela de Materiais e Tabela 3) ao poço proximal.
   6. Manutenção da cultura de explante medula espinhal
      1. Adicione o meio SCEX no compartimento proximal e o meio SCEX rico (SCEX com 50 ng/mL de BDNF e GDNF) no compartimento distal. Mantenha um gradiente de volume de pelo menos 15 μL por poço entre os poços distais (maior volume) e o poço proximal.
      2. Atualize o meio a cada 2 dias. Os axônses podem levar até 3-5 dias para atravessar distalmente.

3. Transporte axonal(Figura 4A)

1. Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos
   1. Prepare o meio SCEX fresco (ou CNB para MN dissociado) contendo 100 nM Mitotracker Deep Red FM e 100 nM LysoTracker Red. Incubar por 30-60 min a 37 °C. Outras cores podem ser usadas desde que seus fluoróforos não se sobreponham.
   2. Lave 3x com meio CNB/SCEX quente. As placas estão prontas para imagens.
2. Imagem ao vivo
   1. Adquira 100 séries de imagem de lapso de tempo de transporte axonal em intervalos de 3 s, com um total de 5 minutos por filme.
      NOTA: O sistema de imagem utilizado neste estudo incluiu um microscópio invertido equipado com disco giratório confocal, controlado via software de imagem celular de propriedade, lente de óleo 60x, NA = 1,4 e uma câmera EMCCD. Os filmes foram adquiridos em ambiente controlado a 37 °C e 5% de CO₂.
      NOTA: Filmes com lapso de tempo mais longos ou mais curtos podem ser imagem, dependendo do experimento. Mesmo filmes da noite para o dia podem ser gravados se necessário. No entanto, é fundamental tentar reduzir o tempo de exposição e o poder do laser, bem como o número de imagens totais, para diminuir a fototoxicidade e o branqueamento durante a aquisição do filme.

4. Análise de imagem (Figuras 4-5)

1. Análise da distribuição e densidade do transporte de partículas utilizando análise de kymógrafo
   1. Abra o arquivo em FIJI. Canais separados pressionando Imagem | Pilhas | Ferramentas | Deinterleave.
   2. Defina propriedades de imagem pressionando Imagem | Propriedades.
   3. Escolha a Ferramenta de Linha Segmentada clicando com o botão direito do mouse no ícone de linha. Defina largura para 8-10 clicando duas vezes no ícone de linha. Seja consistente com a mesma largura de linha durante toda a análise.
   4. Marque uma linha segmentada seguindo o caminho do axôrio de distal para proximal. Clique duas vezes para parar a marcação da linha.
   5. Clique em t para adicionar uma nova linha de interesse (ROI) ao ROI Manager. Adicione isso a uma tabela de análise de planilhas.
   6. Clique em m para medir a área e o comprimento do axôono. Adicione isso à tabela de análise.
   7. Gere um caquiógrafo clicando em Plugins | KymoToolBox | Desenhe Kymo. Alternativamente, outros plugins de geração de kymógrafos disponíveis podem ser usados.
   8. Conte manualmente partículas móveis (retrógradas ou anterogradas) e não-móveis e adicione-as à tabela na coluna correta.
      NOTA: As partículas são classificadas como anterogrado móvel (ou seja, movendo-se para a esquerda no kymógrafo) ou retrógrada (ou seja, movendo-se para a direita) se seu deslocamento for superior a 10 μm na direção específica. É possível medir o deslocamento simplesmente marcando uma linha horizontal com o ícone de linha e pressionando m. Partículas imóveis ou aquelas que não atendem aos critérios de deslocamento são definidas como não-móveis (Figura 4B).
2. Rastreamento de partículas simples: rastreamento manual
   1. Baixe o plugin de rastreamento manual para o software FIJI (desenvolvido por Fabrice P. Cordelière) de http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
   2. Abra o arquivo em FIJI/ImageJ. Use a opção Girar para alinhar as ranhuras MFC horizontalmente.
   3. Para melhorar a relação sinal-ruído, se necessário, clique em Processar | Subtrair fundo.
   4. Abra o plugin de rastreamento manual. Defina os parâmetros (por exemplo, tamanho do pixel, intervalo de tempo, etc.) de acordo com o microscópio específico usado para a imagem. Para os resultados aqui apresentados, o microscópio e a lente a razão foi de 0,239 μm/pixel e o intervalo de quadro s foi de 3 s.
   5. Obtenha as coordenadas X e Y das faixas e salve os resultados copiando o texto para planilha.
   6. Analisar filmes de vários canais clicando em Imagem | Cor | Mesclar canais para mesclar os canais e, em seguida, rastrear apenas pontuação colocalizada.
3. Rastreamento de partículas simples: rastreamento semi-automatizado (Figura 5)
   1. Abra o software de análise. Este estudo utilizou o software Bitplane Imaris versão 8.4.1.
   2. Mude para Superar no menu superior.
   3. Clique em Processamento de Imagens | Tempo de Troca e Z | Ok,
   4. Clique em Editar | Propriedades de imagem (Ctrl+I) | Geometria | Linha de tamanho voxel. Defina propriedades de imagem de acordo com a configuração de microscopia usada.
      NOTA: Para os dados aqui apresentados, a relação microscópio e lente foi de 0,239 μm/pixel.
   5. Clique em All Equidistant e altere o intervalo de tempo. Por exemplo, use 3 s como intervalo. Clique no botão Redefinir na parte inferior direita ou clique em Ctrl+B.
   6. Adicione uma camada de pontos no canto superior esquerdo clicando em um ícone de pequenas manchas amarelas. No canto inferior esquerdo, um novo menu para edição dos pontos é aberto.
   7. Pressione a seta azul direita até que a detecção do ponto seja iniciada.
      NOTA: É importante filtrar alguns dos pontos usando o filtro no canto inferior esquerdo da janela. Verifique o filme algumas vezes para ver se um número suficiente de pontos é selecionado.
   8. Verifique ou configure os parâmetros para atender às necessidades experimentais. Por exemplo, Distância Máxima = 12 μm (A distância máxima permitiu que entre dois pontos distintos ainda os incluíssem na mesma faixa); Max Gap Size = 1 (O número de quadros que uma faixa pode perder e ainda considerado uma faixa).
   9. Clique em Configurações e, em seguida, estilo de faixa = desligado, pontos = esfera.
   10. Usando a barra de filtro,escolha diferentes filtros para o ajuste. Por exemplo, nos dados aqui fornecidos, A Duração da Faixa = 9 removeu todas as faixas com menos de 3 quadros. Quando todos os parâmetros estiverem definidos, clique no Arqueiro Verde Direito. A edição adicional não é possível após esta etapa.
   11. Clique no Pequeno Lápis com Os Apontados para editar manualmente todas as faixas.
   12. Ver o filme(Figura 5B). Se ocorrer um erro, existem várias opções possíveis:
       1. Para desconectar uma faixa, clique na opção Objeto e escolha os dois pontos que precisam ser desconectados segurando Ctrle escolha Desconectar.
       2. Para conectar uma faixa, clique na opção Objeto, escolha os dois pontos que precisam estar conectados segurando Ctrl e escolha Conectar.
       3. Para excluir uma faixa ou ponto, com a opção certa(Faixa/Objeto),mude para a tela com o ícone lápis normale escolha Excluir.
       4. Para adicionar pontos manualmente, mude para a tela de ícone de lápis regular. Na parte inferior da tela há uma marca de rastreamento manual. Certifique-se de que a caixa de seleção de conexão automática é V. No próprio filme, para adicionar um ponto, segure o botão Shift e Left-Click.
   13. Para adicionar um ponto a uma faixa existente, escolha uma faixa desejada (amarela) e quadro, mude para a tela de ícone de lápis regular e adicione um ponto manualmente. Quando o filme inteiro estiver concluído, mude para o ícone que parece um gráfico vermelho (Estatísticas). É possível editar os parâmetros analisados posteriormente. Para editar, no canto inferior esquerdo da tela, pressione o ícone de tecla sueco. Por exemplo: Posição X, Posição Y.
   14. Pressione o ícone que parece com vários disquetes, exporte todas as estatísticas.
       NOTA: A saída da planilha pode ser tratada diretamente ou posteriormente analisada usando o código publicado⁹ utilizado para esta análise, que será compartilhado sob demanda. Os seguintes parâmetros são extraídos da análise: Velocidade, Deslocamento de Pista, Comprimento de Execução, Velocidade (incluindo Direcionalidade), Contagem de paradas, Duração média da parada, Alfa, Mudanças de direção e Velocidade Instantânea. Uma explicação detalhada de cada parâmetro é descrita em Gluska et al.⁹.

Resultados

Seguindo o protocolo descrito, as explantas da medula espinhal do rato foram cultivadas em MFC (Figura 4A). Explantas foram cultivadas por 7 dias, quando os axônses se cruzaram totalmente para o compartimento distal. Os corantes vermelhos profundos mitotracker e lisotracker foram adicionados aos compartimentos distal e proximal, a fim de rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos(Figura 4C).

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um sistema para rastrear o transporte axonal de mitocôndrias e compartimentos ácidos nos neurônios motores. Esta plataforma in vitro simplificada permite o controle, o monitoramento e a manipulação precisas de compartimentos neuronais subcelulares, permitindo a análise experimental das funções locais dos neurônios motores. Este protocolo pode ser útil para o estudo de doenças de MN, como a ELA, para focar na compreensão do mecanismo subjacente da disfunção do transporte axonal n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera	Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)	Sigma-Aldrich	C1768	stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)	Thermo Fisher	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm	World Precision Instruments WPI	504530	For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm	World Precision Instruments WPI	504533	For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm	World Precision Instruments WPI	504534	For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1	Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN-25	stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	For epoxy mold preperation
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
Epoxy Hardener	Trias Chem S.R.L	IPE 743	For epoxy mold preperation
Epoxy Resin	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	For epoxy mold preperation
FIJI software	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X	Thermo Fisher	#35050-038
HB9:GFP mice strain	Jackson Laboratories	005029
HBSS 10X	Thermo Fisher	#14185-045	Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software	Andor
Iris scissors, curved, 10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
Laminin	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Red	Thermo Fisher	L7528
Mitotracker Deep-Red FM	Thermo Fisher	M22426
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope	Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution	Biological Industries	03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	#P8638	Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	T1426	stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade	F.S.T	15000-00
Yokogawa CSU X-1	Yokogawa