АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья моторных нейронов. В этом протоколе мы предоставляем подробный метод отслеживания аксональной транспортировки кислых отсеков и митохондрий в моторных нейронных аксонах с помощью микрофлюидных камер.

Аннотация

Моторные нейроны (Инн) являются сильно поляризованными клетками с очень длинными аксонами. Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья MN, способствуя росту нейронов, развитию и выживанию. Мы описываем подробный метод использования микрофлюидных камер (МФУ) для отслеживания аксональной транспортировки флуоресцентно маркированных органелл в аксонах MN. Этот метод является быстрым, относительно недорогим, и позволяет для мониторинга внутриклеточных сигналов в пространстве и времени. Мы описываем пошаговый протокол для: 1) Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) МФЦ; 2) Покрытие брюшной спинной мозг explants и MN диссоциированной культуры в МФЦ; 3) Маркировка митохондрий и кислых отсеков с последующим живым конфокальным воображением; 4) Ручной и полуавтоматизированный аксональный анализ транспорта. Наконец, мы демонстрируем разницу в транспортировке митохондрий и кислых отсеков HB9::GFP вентральный спинной мозг explant аксоны как доказательство действия системы. В целом, этот протокол обеспечивает эффективный инструмент для изучения аксонального переноса различных аксональных компонентов, а также упрощенное руководство по использованию MFC, чтобы помочь обнаружить пространственные экспериментальные возможности.

Введение

MNs являются сильно поляризованными клетками с длинными аксонами, достигающими до одного метра в длину у взрослых людей. Это явление создает критическую проблему для поддержания подключения и функции MN. Следовательно, MNs зависит от надлежащей транспортировки информации, органелл ы и материалов вдоль аксонов от их клеточного тела к синапсу и спине. Различные клеточные компоненты, такие как белки, РНК и органеллы регулярно переносятся через аксоны. Митохондрии являются важными органеллами, которые регулярно транспортируются в MNs. Митохондрии имеют важное значение для надлежащей деятельности и функции MNs, ответственных за предоставление АТФ, буферизации кальция, и сигнализации процессов1,2. Аксональный транспорт митохондрий является хорошо изученным процессом3,,4. Интересно, что дефекты в митохондриальной транспортировки, как сообщается, участвуют в нескольких нейродегенеративных заболеваний и, в частности, в MN заболеваний5. Кислотные отсеки служат еще одним примером для внутренних органелл, которые движутся вдоль аксонов MN. Кислые отсеки включают в себя лисосомы, эндосомы, транс-голги аппарат, и некоторые секреторные пузырьки6. Дефекты в аксональной транспортировки кислых отсеков были обнаружены в нескольких нейродегенеративных заболеваний, а также7, и последние документы подчеркивают их важность в MN заболеваний8.

Для эффективного изучения аксонального транспорта часто используются микрофлюидные камеры, разделяющие соматические и аксональные,10отсеки. Два существенных преимущества микрофлюидной системы, а также разобщенности и изоляции аксонов, делают его идеальным для изучения субклеточных процессов11. Пространственное разделение между нейрональными клетками и аксонами может быть использовано для манипулирования внеклеточной средой различных нейрональных отсеков (например, аксонов против сомы). Биохимические, нейрональный рост / дегенерация, и иммунофлуоресценции анализы все выгоды от этой платформы. МФУ могут также помочь в изучении связи от клетки к клетке путем coculturing нейронов с другими типами клеток, таких как скелетные мышцы12,13,14.

Здесь мы описываем простой, но точный протокол для мониторинга митохондрий и кислого отсека транспорта в моторных нейронов. Мы также показываем использование этого метода, сравнивая относительный процент ретроградных и антероградных движущихся органелл, а также распределение транспортной скорости.

протокол

Уход и обращение с животными в этом протоколе осуществлялись под наблюдением и одобрением Комитета по этике животных Тель-Авивского университета.

1. Подготовка МФЦ

  1. PDMS литья в первичных форм(Рисунок 1)
    1. Покупка или создание первичных форм (вафель) после подробного протокола9.
    2. Используйте воздух под давлением, чтобы удалить любой тип грязи с вафельной платформы, прежде чем приступить к покрытию шаг. Поверхность вафель должна выглядеть гладкой и прозрачной.
    3. Заполните контейнер с 50 мл жидкого азота. Приготовьте 10 мл шприца и 23 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с этого шага вперед должны быть выполнены в химическом капюшоне.
    4. В химическом капоте используйте шприц и иглу для бассейна 2 мл жидкого азота. Хотя может показаться, что воздух был нарисован, шприц наполнен азотом(рисунок 1А). Поместите пластину в герметичном контейнере.
    5. Винт открыть хлоротриметилсилан бутылку, проколоть резиновую крышку с помощью азота заполненные шприц, и вводить все содержимое шприца в бутылку. Не вытягивая иглу, переверните бутылку вверх дном и оттяните 2 мл хлоротриметилсилана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за давления шприца, небольшое количество хлоротримметилсиланана распыляется из иглы. Чтобы избежать опасности, укажите иглу на внутреннюю стену капота(рисунок 1B).
    6. Равномерно распределите хлоротриметилсилан в контейнере (от шага 1.1.4), но не непосредственно на пластине или пластиносодержащей пластине. Закройте контейнер и инкубировать в течение 5 минут на вафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это первый раз, когда вафля покрыта хлоротриметилсиллан, 1 ч инкубации должны быть разрешены для каждой пластины.
    7. Не вынимайте и контейнер из химического капота в течение 30 мин.
      ВНИМАНИЕ: Хлоротриметилсилан очень волатильный.
    8. Взвесьте базу PDMS (см. Таблицу Материалов)в трубке 50 мл и добавьте отcurание PDMS в соотношении 16:1 соответственно (например, 47,05 г основания и 2,95 г лечебного средства). Смешайте в течение 10 минут с помощью поворота низкой скорости.
    9. Налейте PDMS в каждую пластину-содержащую пластину на нужную высоту(рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тонких микрофлюидных камер (до 3-4 мм) улучшает соблюдение блюда культуры и предотвращает утечку.
    10. Поместите все пластины вместе внутри вакуумного высыхателя в течение 2 ч(Рисунок 1E). Этот процесс удаляет воздух, захваченный в PDMS, тем самым устраняя пузырьки воздуха и образуя четкую, однородную форму.
    11. Поместите тарелки в духовку на 3 ч (или на ночь) при температуре 70 градусов по Цельсию(рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть ровными при размещении в духовке.
  2. Литье PDMS в эпоксидных формах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что подготовка дорого, требует специального оборудования, и может повредить хрупкие пластины, можно генерировать эпоксидные реплики вафель. Реплики дешевле, долговечнее, и могут быть использованы для массового производства микрофлюидных камер.
    1. В ролях и лечения PDMS (как описано в 1.1.8-1.1.11) в оригинальной пластины.
    2. Удалить и отрезать избыточные части PDMS оставляя только микрофлюидные элементы и функциональную область, необходимую для их обработки в микрофлюидные камеры.
    3. Немедленно оберните PDMS с толщиной, липкой лентой для того чтобы предотвратить его от аккумулировать пыль.
    4. Выберите пластиковую тарелку класса культуры ткани, которая соответствует всему PDMS внутри и оставить место для эпоксидной смолы вокруг него. Расстояние от PDMS до пластиковой тарелки должно быть менее 5 мм.
    5. Подготовьте небольшое количество PDMS, смешанного в соотношении 10:1 (базовый: лечебный агент). Свежая жидкость PDMS будет использоваться для приклеивания твердых PDMS на дно пластиковой пластины.
    6. Нанесите минимальное количество жидкости PDMS на центральное дно пластиковой пластины, а затем снимите липкую ленту из PDMS и привяжете ее к нижней пластиковой тарелке. Убедитесь, что микрофлюидные элементы обращены вверх.
    7. Пусть PDMS вылечить в течение 30 минут в духовке 70 градусов по Цельсию.
    8. Подготовка эпоксидной смолы путем смешивания базы и лечения агента в соотношении 100:45 соответственно в пробирке. Различные эпоксидные смолы могут иметь различные соотношения смешивания. Необходимый объем для обычной 100-мм пластины составляет около 40 мл.
    9. Пусть эпоксидная смесь хорошо в течение 10 минут в ротаторе, пока смесь не станет заметно однородной (т.е. в жидкости нет видимых волоконно-подобных артефактов).
    10. Centrifuge эпоксидной смеси на 400 х г в течение 5 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха, оказавшихся внутри.
    11. Во время центрифугации, распространение тонким слоем силиконовой смазки вокруг стен и всех других открытых пластиковых частей культуры блюдо. Это предотвратит полимеризацию эпоксидной смолы с помощью пластика тарелки и позволит легко удалить вылеченную эпоксидную кислоту в конце протокола.
    12. Налейте эпоксидную кислоту медленно в блюдо, пока он полностью покрывает PDMS и выходит за его пределы, по крайней мере 5 мм. Предотвратить образование любых пузырьков в эпоксидной смолы, сохраняя нулевое расстояние между трубкой и пластиной. Поместите тарелку в безопасное место, чтобы она не была перемещена в течение следующих 48 ч.
    13. После 48 ч эпоксидная кислота должна быть полностью вылечена. Вставьте тарелку в разогретую духовку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 3 ч для окончательного лечения.
    14. Удалите вылеченную эпоксидку из пластины и оригинальную плесень PDMS, осторожно дергая пластиковую стенку пластины, пока она не сломается. Затем он должен легко отделиться от эпоксидной смолы и отслаиваться.
    15. После извлечения, стереть оставшуюся смазку с новой эпоксидной реплики и ввести его с ног на голову (т.е., с реплицированными микрофлюидными элементами вверх) в новое блюдо культуры. Эпоксидная копия теперь готова для литья PDMS.
    16. Используйте под давлением воздуха или N2, чтобы взорвать любые остатки PDMS или грязи от эпоксидной формы и промыть его 2x с изопропанол. Заполните его в третий раз и инкубировать в течение 10 минут на орбитальной пластине шейкера. Промыть плесень снова 3x с изопропанол и отбросить оставшуюся жидкость. Удар сухой с воздухом или N2 или поместите в духовке 70 градусов до высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте процедурам безопасности при работе с изопропанол и отбрасывайте его.
    17. Держите плесень пластины закрыты до литья. Выполните шаги 1.1.8.-1.1.11.
  3. Пробивание и скульптура PDMS в МФЦ(Рисунок 2)
    1. Вырезать и удалить форму PDMS из пластины, следуя (к) знаки на с помощью скальпеля. Не используйте силу, так как формы хрупкие(рисунок 2А).
    2. Следуйте инструкциям, нарисованным на эскизе, чтобы пробить и вырезать камеры в зависимости от экспериментальной установки(рисунок 2B-F).
      1. Для спинного мозга explant культуры(Рисунок 2C, E), удар два 7 мм скважин в дистальной стороне большой MFC. Найдите скважины таким образом, чтобы они пересекались с краями канала. На проксимальной стороне, удар один 7 мм хорошо в середине канала, с минимальным перекрытием, так что достаточно места будет оставлено для explants. Пробить еще два отверстия 1 мм в двух краях проксимального канала. Поверните MFC с микрофлюидными элементами, обращенными вверх, и, используя 20 G иглы, вырезать три небольших пещеры explant на пробитой 7 мм хорошо.
      2. Для разобщенных культур ы MN(рисунок 2D,F),пробить четыре 6-мм колодца по краям двух каналов небольшого МФЦ.
  4. Стерилизация МФЦ для использования культуры тканей
    1. Распространение 50 см длинные липкие ленты полосы на скамейке. Нажмите и отодвите камеру, чтобы столкнуться с липкой лентой (как верхние, так и нижние грани) и удалите сырую грязь. Поместите чистые камеры в новую 15-сантиметровую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимаете непосредственно на микрофлюидные элементы, когда они обращены вверх.
    2. Инкубировать камеры в аналитическом классе 70% этанола в течение 10 минут на орбитальной шейкер.
    3. Утилизировать этанол и высушить камеры в капюшоне культуры ткани или в духовке при температуре 70 градусов по Цельсию.
  5. Размещение МФЦ на стеклянном донистом блюде
    1. Поместите камеру в центре ткани культуры класса 35 мм / 50 мм стекла нижней блюдо и применить незначительную силу по краям, чтобы сделать PDMS и блюдо нижней связать. Чтобы не разбить стеклянное дно, всегда нанося силу поверх твердой поверхности.
    2. Инкубировать 10 мин в 70 градусах По Цельсию. Пресс-камеры, чтобы укрепить присоединение к пластине.
    3. Инкубировать под ультрафиолетовым светом в течение 10 мин.
  6. Покрытие и культивирование
    1. Добавьте 1,5 нг/мл поли-L-орнитина (ООП) в оба отсека. Убедитесь, что ООП проходит через каналы, pipetting покрытия средств массовой информации несколько раз непосредственно в входе канала.
    2. Изучите микрофлюидную камеру под легким микроскопом с 10-разным увеличением, чтобы проверить наличие пузырьков воздуха. Если пузырьки воздуха блокируют микрогры, поместите MFC в вакуумный дезикатор на 2 мин. Позже, удалить избыток воздуха, который попал в каналы, пиптинг покрытия средств через них. Инкубировать на ночь.
    3. Замените ООП ламинином (3 мкг/мл в DDW) для ночной инкубации таким же образом.
    4. Перед покрытием, мыть ламинин с нейрональной среды культуры.

2. Нейронная культура покрытие

  1. Диссоциированная культура моторных нейронов
    1. Используя прямые ножницы и тонкие щипцы, вскрыть спинной мозг из E12.5 ICR-HB9::GFP мыши эмбриона. Работа в 1X HBSS решение с 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)(рисунок 3A-C).
    2. Используя ножницы микродиссекции, удалите оленя и рога доза(рисунок 3D).
    3. Соберите части спинного мозга и перенесите на трубку(#1)с 1 мл HBSS 1% P/S.
    4. Разрежьте спинной мозг на мелкие кусочки с помощью изогнутых ножниц и ждать, пока куски, чтобы решить.
    5. Добавьте 10 кл. трипсина 2,5% и поместите в водную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После 5 минут, смешать, нажав трубку. Части должны образовывать суглюк-как комок.
    6. Перенесите комок в новую трубку(#2),содержащую 800 л предварительно разогретого L-15, 100 л BSA 4%, и 100 л 10 мг/мл DNase. Измельчить 2x, затем ждать 2 мин, чтобы неотделимые части оседают. Перенесите супернатант в новую трубку(#3).
    7. Добавьте 100 л BSA 4%, 20 л 10 мг/мл DNase, и 900 л полной нейробазальной среды (CNB, см. Таблица материалов и Таблица 1). Измельчить 8x и ждать 2 мин. Соберите супернатант в трубку #3.
    8. Повторите шаг 2.1.7 и измельчите 10x. Соберите супернатант в трубку #3. Небольшое количество ткани должно быть оставлено в нижней части трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если большой комок все еще остается в нижней части трубки #2,повторите шаг 2.1.8.
    9. Добавьте 1 мл подушки BSA 4% на дно трубки #3.
    10. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
    11. Приостановите действие клеточной гранулы, осторожно нажав трубку, а затем добавьте 1 мл среды CNB. Пипетка 6x и добавить 20 л 10 мг/мл DNase.
    12. Дополнить дополнительно 5 мл среды CNB и передать 3 мл на новую трубку(#4).
    13. Добавьте 1 мл из 10,4% градиентной среды плотности (см. таблицу 2)в нижней части каждой трубки(#3 и #4). Должно появиться резкое поэтапное разделение между двумя интерфейсами.
    14. Центрифуга при температуре 775 х г в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). Замедление центрифуг должно быть установлено на низком уровне, чтобы избежать распада фазового разделения.
    15. Клетки должны плавать, появляясь как пасмурная межфаза между носителями. Соберите клетки из обеих труб в новую трубку(#5),уже содержащую предварительно разогретую 1 мл CNB среды.
    16. Добавьте еще 4-6 мл среды CNB.
    17. Добавьте 1 мл подушки BSA 4% на дно трубки.
    18. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и аккуратно отбросите гранулы с 1 мл среды CNB.
    19. Посчитайте клетки. Ожидается выход 0,75-1 х 106 МН на спинной мозг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вентральный спинной мозг также содержит другие нейрональные подтипы, кроме моторных нейронов (например, интернейронов). Чистота MN зависит главным образом от удаления торсальных участков во время вскрытия и способности достигать обогащенных РН ростовских участков. Для обеспечения изображения нейронов MNs, использование штамма мышей с эндогенным маркером MN, таких как HB9::GFP мышей, рекомендуется. Для достижения чистой культуры MN (но с пониженной урожайностью клеток), возможно использование очистки FACS15.
    20. Покрытие разобщенных Культуры MN в МФЦ
      1. Концентрируйте 150 000 МН на камеру, центрифугиваясь при 400 х г в течение 5 мин.
      2. Аспирируй супернатант и осторожно resuspend клетки в богатой нейробазальной среде (RNB) на 4 Зл на МФЦ. РНБ дополняется дополнительными 2% B27 и 25 нг/мл BDNF.
      3. Удалите средство из обоих отсеков, оставляя низкий объем, эквивалентный 10 зл в колодцах дистального отсека. Он выглядит как тонкое кольцо медиума в периметре колодца.
      4. Медленно загружайте 4 qL клеток в канал. Выняйте 4 qL скважины в другой стороне канала, и медленно загрузите их обратно прямо в канал, чтобы обратить вспять текущий поток и максимизировать плотность клеток в канале.
      5. Убедитесь, что клетки вошли в канал с помощью 10-x светового микроскопа и поместите камеру в инкубатор в течение 30 минут, не добавляя больше носителей.
      6. Медленно добавляйте 10-15 евро зЛ РНБ в проксимальные и дистальные колодцы и помещайте камеры в инкубатор еще на 15 минут.
      7. После этой инкубации, медленно добавляйте 75-80 евро ЛЛ РНБ в каждую скважину.
    21. Диссоциированное обслуживание культуры MN
      1. На следующий день после покрытия (DIV1), заменить среду с RNB дополнен 1 мкм цитозин арабиносид (Ara-C) для ингибирования роста глиального.
      2. Через два дня после применения Ara-C (DIV3) заменить среду со свежей средой CNB в проксимальном отсеке (без Ara-C).
      3. Для повышения скрещивания аксонов через микрогры, применять RNB дополнен ы 25 нг/мл глиальных клеток, полученных нейротрофический фактор (GDNF) и 25 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF) только в дистальном отсеке. Поддержание градиента объема не менее 10 л на скважину между аксональными дистальными скважинами (более высокий объем) и проксимальными скважинами.
      4. Освежать среду каждые 2 дня. Это может занять аксоны до 4-6 дней, чтобы пересечь distally.
  2. Спинной мозг explant культуры
    1. Используя прямые ножницы и тонкие щипцы, вскрыть спинной мозг из E12.5 ICR-HB9::GFP мыши эмбриона. Работа в 1X HBSS решение с 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)(рисунок 3A-C).
    2. Используя ножницы микродиссекции, удалите оленя и рога доза(рисунок 3D).
    3. Разрежьте спинной мозг на 1 мм толщиной поперечных секций(рисунок 3E). Утилизировать все средство от проксимального отсека МФЦ.
    4. Возьмите один спинной мозг explant с пипеткой в общей сумме 4 ЗЛ. Введите explant как можно ближе к пещере и вытянуть любой чрезмерной жидкости из проксимальной хорошо через боковые розетки (1 мм ударов). Экспланты должны быть всасывается в проксимальный канал.
    5. Медленно добавьте 150 л спинного мозга explant среды (SCEX, см. Таблица материалов и Таблица 3) к проксимальной хорошо.
    6. Спинной мозг explant культуры обслуживания
      1. Добавьте среду SCEX в проксимальный отсек и богатую среду SCEX (SCEX с 50 нг/мл BDNF и GDNF) в дистальном отсеке. Поддерживайте градиент объема не менее 15 л на скважину между дистальными скважинами (более высокий объем) и проксимальной скважиной.
      2. Освежать среду каждые 2 дня. Это может занять аксоны до 3-5 дней, чтобы пересечь distally.

3. Аксональный транспорт(рисунок 4А)

  1. Маркировка митохондрий и кислых отсеков
    1. Подготовьте свежий средний SCEX (или CNB для разъединенных MN), содержащий 100 нм Mitotracker Deep Red FM и 100 нм LysoTracker Red. Инкубировать в течение 30-60 мин при 37 градусах Цельсия. Другие цвета могут быть использованы до тех пор, пока их фторфоры не пересекаются.
    2. Вымойте 3x с теплой средой CNB/SCEX. Пластины готовы к визуализации.
  2. Изображения в реальном маштабе времени
    1. Приобретите 100 покадровой серии изображений аксонального транспорта с интервалом в 3 с интервалами, в общей сложности 5 минут на фильм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации, используемая в этом исследовании, включала перевернутый микроскоп, оснащенный вращающимся диском confocal, управляемый с помощью программного обеспечения визуализации клеток, 60-x масляный объектив, NA No 1.4 и камеру EMCCD. Фильмы были приобретены в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинные или более короткие покадровые фильмы могут быть изображены, в зависимости от эксперимента. Даже ночные фильмы могут быть записаны, если это необходимо. Тем не менее, очень важно, чтобы попытаться уменьшить время экспозиции и лазерной мощности, а также количество общих изображений, чтобы уменьшить фототоксичность и отбеливание во время приобретения фильма.

4. Анализ изображений (рисунки 4-5)

  1. Анализ распределения и плотности переноса частиц с помощью анализа кимографа
    1. Откройте файл в FIJI. Отдельные каналы нажатия Изображения Стеки Инструменты Deinterleave.
    2. Установите свойства изображения, нажав изображение Свойства.
    3. Выберите инструмент сегментированной строки, нажав на значок строки. Установите ширину до 8-10, дважды нажав на значок строки. Соответствие той же ширине линии на протяжении всего анализа.
    4. Отметьте сегментированную линию, следуя по аксонному пути от дистальной к проксимальной. Дважды щелкните, чтобы остановить разметку линии.
    5. Нажмите t, чтобы добавить новую область линии, представляющий интерес (ROI) для менеджера roI. Добавьте это в таблицу анализа таблицы таблицы таблицы электронных таблиц.
    6. Нажмите м, чтобы измерить площадь и длину аксона. Добавьте это в таблицу анализа.
    7. Создайте kymograph, нажав на плагины KymoToolBox Нарисуйте Kymo. Кроме того, другие плагины поколения kymograph доступны могут быть использованы.
    8. Вручную подсчитайте движущиеся (ретроградные или антероградские) и неподвижные частицы и добавляйте их в таблицу в правильной колонке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы классифицируются как движущиеся антерограды (т.е. перемещение влево в kymograph) или ретроградные (т.е. движение вправо), если их смещение превышает 10 мкм в определенном направлении. Измерить смещение можно, просто пометив горизонтальную линию иконкой line и нажав м. Иммобильные частицы или те, которые не отвечают критериям смещения определяются как неподвижные(рисунок 4B).
  2. Отслеживание отдельных частиц: Ручное отслеживание
    1. Скачать ручной плагин отслеживания для программного обеспечения FIJI (разработан Фабрис. Кордельер) с http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. Откройте файл в FIJI/ImageJ. Используйте опцию «Поворот», чтобы выровнять канавки MFC горизонтально.
    3. Чтобы улучшить соотношение сигнала к шуму, если это необходимо, нажмите Процесс Вычесть фон.
    4. Откройте плагин ручного слежения. Установите параметры (например, размер пикселя, временной интервал и т.д.) в соответствии с конкретным микроскопом, используемым для визуализации. Для результатов, показанных здесь, микроскоп и объектив соотношение было 0,239 мкм / пиксель и интервал кадра был 3 с.
    5. Получите координаты X и Y треков и сохраните результаты, копируя текст в электронную таблицу.
    6. Анализ многоканальных фильмов, нажав изображение Цветовая гамма Слияние каналов для слияния каналов, а затем отслеживать только colocalized puncta.
  3. Отслеживание отдельных частиц: Полуавтоматическое отслеживание (Рисунок 5)
    1. Откройте программное обеспечение для анализа. В этом исследовании использовалась версия программного обеспечения Bitplane Imaris 8.4.1.
    2. Переключитесь на Surpass в верхнем меню.
    3. Нажмите обработка изображений (ru) Время свопов и й Ok.
    4. Нажмите На кнопку «Отмету» (ru) Свойства изображений (Ctrl'I) Геометрия Voxel Размер строки. Установите свойства изображения в соответствии с используемой установкой микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных, отображаемых здесь, соотношение микроскопа и объектива составило 0,239 мкм/пиксель.
    5. Нажмите Все equidistant и изменить интервал времени. Например, используйте 3 с в качестве интервала. Нажмите кнопку сброс в правом нижнем углу или нажмите ctrl'B.
    6. Добавьте слой пятен в левом верхнем цвете, нажав на иконку малых желтых пятен. В левом нижнем углу открывается новое меню для редактирования пятен.
    7. Нажмите на правую голубую стрелку до тех пор, пока не начнется обнаружение места.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отфильтровать некоторые точки с помощью фильтра в левом нижнем углу окна. Проверьте фильм несколько раз, чтобы увидеть, что достаточное количество точек выбрано.
    8. Проверить или настроить параметры в соответствии с экспериментальными потребностями. Например, Max Distance 12 мкм (максимальное допустимое расстояние между двумя различными точками, чтобы все еще включить их в один и тот же трек); Max Gap Размер No 1 (количество кадров, что трек разрешено пропустить и по-прежнему считается одной дорожке).
    9. Нажмите Настройки, а затем отслеживать стиль - Off, Очки и Сфера.
    10. Используя панель фильтров,выберите различные фильтры для регулировки. Например, в данных, представленных здесь, Track Duration 9 удалены все треки с менее чем 3 кадрами. Когда все параметры установлены, нажмите правозеленую стрелку. Дальнейшее редактирование не представляется возможным после этого шага.
    11. Нажмите малый карандаш с точками, чтобы вручную отсечить все треки.
    12. Посмотреть фильм(рисунок 5B). При возникновении ошибки существует несколько возможных вариантов:
      1. Чтобы отключить трек, щелкните опцион «Объект» и выберите два места, которые необходимо отключить, удерживая Ctrl,и выберите Отключените.
      2. Чтобы подключить трек, щелкните опцион «Объект», выберите два места, которые необходимо подключить, удерживая Ctrl, и выберите Connect.
      3. Чтобы удалить трек или пятно, с правильным вариантом (Трек / Объект), переключиться на экран с обычной иконки карандаша, и выбрать Удалить.
      4. Чтобы добавить пятна вручную, переключитесь на обычный экран иконки карандаша. В нижней части экрана есть ручной знак слежения. Убедитесь, что чекбокс Auto-Connect является V. На самом фильме, для того, чтобы добавить пятно, удерживайте кнопку Shift и лево-нажмитекнопку .
    13. Чтобы добавить место в существующий трек, выберите желаемый трек (желтый) и кадр, переключитесь на обычный экран карандашной иконки и добавьте пятно вручную. Когда весь фильм будет закончен, переключитесь на значок, который выглядит как красный график (Статистика). Отойти от проанализированных параметров можно позже. Чтобы отослать, в левом нижнем углу экрана нажмите на шведскую иконку Key . Например: Позиция X, Позиция Y.
    14. Нажмите на значок, который выглядит как несколько дисков floppy, Экспорт Все статистические данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход электронной таблицы может быть обработан непосредственно или дополнительно проанализирован с помощью опубликованного кода9, используемого для этого анализа, который будет использоваться по запросу. Следующие параметры извлекаются из анализа: скорость, перемещение треков, длина выполнения, скорость (включая направленность), Стоп-граф, Средняя продолжительность остановки, Альфа, Изменение направления и Мгновенная скорость. Подробное объяснение каждого параметра описано в Gluska et al.9.

Результаты

После описанного протокола, мышь эмбриональной HB9::GFP спинного мозга explants были культивированы в MFC(Рисунок 4A). Выращенные растения выращивались в течение 7 дней, когда аксоны полностью пересекались в дистальном отсеке. Mitotracker Deep Red и Lysotracker Red крас...

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем систему отслеживания аксонального переноса митохондрий и кислых отсеков в моторных нейронах. Эта упрощенная платформа in vitro позволяет точно контролировать, контролировать и манипулировать субклеточными нейронными отсеками, позволяя экспериментальный а...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (ISF, 561/11) и Европейского исследовательского совета (ERC, 309377).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD cameraAndor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC1768stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mmWorld Precision Instruments WPI504533For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mmWorld Precision Instruments WPI504534For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v in ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreasSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone greaseSigma-AldrichZ273554-1EAFor epoxy mold preperation
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
Epoxy HardenerTrias Chem S.R.LIPE 743For epoxy mold preperation
Epoxy ResinTrias Chem S.R.LRP 026UVFor epoxy mold preperation
FIJI softwareImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP mice strainJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ softwareAndor
Iris scissors, curved, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal mediumThermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) SolutionBiological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreasSigma-AldrichT1426stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm bladeF.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa

Ссылки

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены