Propagação do Parasita Microsporidiano Edhazardia aedis em Mosquitos Aedes aegypti

Resumo

Um protocolo para cultivar o parasita microsporíduo Edhazardia aedis. O parasita é passagem de uma geração de mosquitos Aedes aegypti para a próxima via transferência horizontal na fase larval seguida de transmissão vertical na fase adulta. Os sporoplasmos vivos sobrevivem a longo prazo em ovos infectados.

Resumo

Edhazardia aedis é um parasita microsporíduo dos mosquitos Aedes aegypti, um vetor da doença que transmite múltiplas arboviroses que causam milhões de casos da doença a cada ano. E. aedis causa mortalidade e redução da aptidão reprodutiva no vetor do mosquito e tem sido explorada por seu potencial como agente de biocontrole. O protocolo que apresentamos para a realização de E. aedis baseia-se em seu ciclo de infecção natural, que envolve transmissão horizontal e vertical em diferentes estágios de vida do hospedeiro do mosquito. Mosquitos Ae. aegypti são expostos a esporos no estágio larval. Essas larvas infectadas então amadurecem em adultos e transmitem o parasita verticalmente para seus descendentes. Os descendentes infectados são então usados como fonte de esporos para futura transmissão horizontal. A culização de E. aedis pode ser desafiadora para os não iniciados dadas as complexidades do ciclo de vida do parasita, e este protocolo fornece orientação detalhada e auxiliares visuais para esclarecimento.

Introdução

O Aedes aegypti é o vetor do mosquito de múltiplas arboviroses (por exemplo, dengue, Zika, febre amarela) que, juntas, são estimadas para contabilizar centenas de milhões de casos da doença a cada ano e mais de 30.000 mortes^1,2. O tratamento para doenças causadas por esses patógenos limita-se ao cuidado de suporte e é provável que outras arboviroses surjam no futuro³. O controle do mosquito vetor é, portanto, de importância primária, pois efetivamente impede a transmissão de patógenos atuais e emergentes⁴. Tradicionalmente, as estratégias de controle vetorial utilizam principalmente inseticidas químicos, mas a resistência a muitos inseticidas comumente usados tem impulsionado a demanda por novos métodos de controle vetorial. Um agente potencial que tem sido explorado por suas propriedades de biocontrole contra a Ae. aegypti é o parasita Edhazardia aedis^5,6.

E. aedis, identificado pela primeira vez como Nosema aedis por Kudo em 1930, é um parasita microsporíduo dos mosquitos Ae. aegypti ⁷. O desenvolvimento e a reprodução de E. aedis é relativamente complexo e seu ciclo de vida pode prosseguir de múltiplas maneiras^7,8,9. Um ciclo de desenvolvimento comum é descrito em profundidade em Becnel et al., 1989⁷ e é utilizado para propagação laboratorial (Figura 1)⁸. Resumidamente, o ciclo começa quando os ovos Ae. aegypti infectados verticalmente com E. aedis eclodem em larvas infectadas que desenvolvem esporos uninucleados no corpo de gordura, e geralmente morrem como larvas ou pupas. Esporos uninucleados liberados de larvas mortas contaminam o habitat e são ingeridos por larvas saudáveis de Ae. aegypti. Esses esporos germinam principalmente no trato digestivo, infectando tecido digestivo das larvas expostas, resultando em transmissão horizontal. Larvas infectadas horizontalmente se desenvolvem em adultos (geração parental) onde esporos binucleados são formados. No feminino, esses esporos binucleados invadem o trato reprodutivo e seu esporoplasma associado infecta células óvulos em desenvolvimento. Esses ovos então eclodem em larvas infectadas (geração filial), resultando em transmissão vertical do parasita e continuação do ciclo conforme descrito acima.

Vários estudos investigaram o potencial de E. aedis para biocontrole. A infecção por E. aedis tem sido demonstrada para resultar na diminuição da capacidade reprodutiva das fêmeas Ae. aegypti ¹⁰. Além disso, em um experimento semi-campo, a liberação inundativa de E. aedis resultou na erradicação total de um teste da população de Ae. aegypti mantida dentro de um recinto telado⁶. Embora seja capaz de submeter-se a algumas etapas de desenvolvimento em um conjunto diversificado de espécies de mosquitos, o E. aedis é transmitido verticalmente apenas verticalmente no Ae. aegypti,indicando um alto grau de especificidade hospedeira^11,12. Da mesma forma, em uma avaliação laboratorial do potencial risco ambiental associado ao E. aedis, o parasita microsporíduo não conseguiu infectar fauna aquática não-alvo, incluindo predadores que ingeriram larvas de Ae. aegypti infectadas com E. aedis¹³. Esses resultados destacam o potencial para que o E. aedis seja utilizado em estratégias de controle biológico voltadas para populações naturais de Ae. aegypti.

Apesar do fato de que e. aedis mostra promessa de uso no controle de vetores, há desafios para culminar e implantá-lo em larga escala. E. os esporos de aedis perdem a infectividade em menos de um dia a temperaturas frias (ou seja, 5 °C). Mesmo com temperaturas mais quentes (ou seja, 25 °C), os esporos rapidamente perdem a infectividade ao longo de três semanas¹⁴. Além disso, o E. aedis deve ser cultivado em mosquitos Ae. aegypti vivos e a dosagem controlada de mosquitos larvais saudáveis é necessária para garantir a conclusão do ciclo de vida e evitar o colapso da população utilizada para a cultura⁸. A exigência de cultivo in vivo apresenta um desafio; no entanto, os recentes avanços na criação de massa de mosquitos e robótica (por exemplo, Massaro et al.¹⁵) poderiam permitir a geração em larga escala de esporos de E. aedis. Prevemos que a visualização dessa metodologia aumentará a acessibilidade ao protocolo de criação do E. aedis e permitirá que mais pesquisadores investiguem a biologia básica e o potencial aplicado desse sistema. Também antecipamos que facilitará o aumento das colaborações com engenheiros, roboticistas e o setor de tecnologia mais amplo, o que pode servir para melhorar a criação em massa do E. aedis.

Figura 1: Propagação de E. aedis em Ae. aegypti. A propagação de E. aedis começa com a eclosão de ovos infectados por E. aedis. Larvas infectadas são criadas até 4^º instar, esporos de Aedis são isolados dessas larvas, e os esporos são usados para infectar oralmente 2^nd/3^rd instar larvas criadas a partir de uma embreagem não infectada de ovos (transmissão horizontal). Essas larvas infectadas oralmente são então criadas até a idade adulta (geração parental) e colocam ovos infectados com E. aedis (transmissão vertical). Os ovos infectados (geração filial) são então eclodidos para continuar o ciclo de infecção e a cultura dos parasitas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Dia 0

1. Eclosão de ovos Ae. aegypti infectados com E. aedis colocando na bandeja de criação larval com 1 L de água deionizada (DI). Adicione 50 mg de comida de peixe.
   NOTA: No momento da publicação, uma cepa laboratorial de E. aedis só está disponível em laboratórios que pesquisam ativamente o parasita, já que o E. aedis não é favorável ao armazenamento a longo prazo e os ovos infectados não são armazenados atualmente em repositórios. Os pesquisadores interessados em trabalhar com E. aedis podem entrar em contato com o autor correspondente para solicitar ovos infectados.
   NOTA: Chocar um grande número de ovos infectados geralmente não é necessário; dez larvas Ae. aegypti infectadas por E. aedis são suficientes para dosar ≥ 1000 larvas saudáveis.
   NOTA: Para todas as partes deste protocolo, abrigamos mosquitos nas seguintes condições: ciclo claro/escuro de 14h/10h, temperatura de 27 °C e 80% de umidade relativa.

2. Dia 1

1. Após a eclosão, reduza a densidade de larvas para ~100 larvas por bandeja, fazendo novas bandejas conforme necessário (também com 1 L d'água DI).
2. Adicione um pedaço de comida seca de gato em cada bandeja. Reponha os alimentos quando esgotados, mas não forneça um excesso de alimentos. Um pedaço de comida de gato (~200 mgs) a cada três dias é suficiente.
   NOTA: Ajuste a quantidade de alimentos dependendo das condições específicas de criação (ou seja, reduza os alimentos se a água ficar turva ou as larvas estiverem morrendo, aumente os alimentos se as larvas estiverem severamente atrasadas no desenvolvimento). Outros regimes de alimentação e/ou condições de criação do que os sugeridos aqui podem ser usados, mas ajustes no tempo deste protocolo padrão podem ser necessários.

3. Dias 4\u20125

1. Quando as larvas infectadas são^3º a 4^º instars, chocam ovos Ae. aegypti saudáveis/não infectados em uma nova bandeja.
2. Traseira em densidades como que o Ae. aegypti saudável atinge 2º^{– 3º} instar em 48-72 h. Em nossas mãos, isso pode ser alcançado usando densidades de 200\u2012300 larvas por 1 L de água com acesso ad libitum aos alimentos. A eclosão de ovos saudáveis durante vários dias pode garantir que as larvas estejam na fase correta quando necessário.

4. Dias 7\u20128: Transmissão horizontal

NOTA: A dosagem de larvas saudáveis com E. aedis não pode ser realizada até que os esporos uninucleados estejam em alto número de larvas infectadas (1 x 10⁴ – 1 x 10⁶ por larva). Isso ocorre no final da^4ª fase instar(Figura 2).

1. Colher e quantificar esporos uninucleados.
   1. Use uma pipeta de transferência (pode-se ter que cortar a ponta para um diâmetro maior) para mover 10 larvas infectadas para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
   2. Remova a água de reprodução com uma tubulação de transferência e lave uma vez adicionando ~1 mL de água DI limpa. Retire a água de lavagem com uma tubulação, adicione 500 μL de água DI limpa às 10 larvas e homogeneize usando um pilão e homogeneizador mecânico.
   3. Quantifique os esporos usando um hemócito na ampliação de 400x.
      NOTA: Os esporos uninucleados podem ser identificados por sua forma piriforme distinta (ou seja, forma de pera; Figura 2A).
2. Dose saudável Larvas Ae. aegypti com E. aedis.
   1. Faça magens frescas de larvas misturando 1,2 g de pó de fígado, 0,8 g de levedura cervejeira e 100 mL de água.
      NOTA: Os alimentos não precisam ser frescos se forem autoclavados e armazenados a 4 °C até o uso.
   2. Transfira 100 2^– 3^º instar larvas saudáveis Ae. aegypti em 150 mL de béquers ou copos de espécimes.
   3. Dose cada béquer de 100 larvas com 5 x 10⁴ – 1 x 10⁵ esporos.
   4. Adicione 2 mL de chorume de alimentos larvais e água DI a um volume final de 100 mL.
3. Após 12-24h de exposição, transfira larvas expostas para bandejas de criação e traseira para a idade adulta seguindo um protocolo de criação padrão¹⁶.

5. Monitoramento e transmissão vertical

1. Monitore as larvas dosadas para pupação e transfira pupas à medida que se desenvolvem para um copo de emergência em uma gaiola. Alimentos de açúcar adultos ad libitum (por^16,17). Adultos de encerramento serão infectados por E. aedis.
2. Adultos de alimentação sanguínea (por^16,17) e coletam ovos. A transmissão vertical de E. aedis ocorre nesta etapa.
   NOTA: Se forem fornecidas refeições sanguíneas adicionais assim que a oviposition estiver completa, as fêmeas podem colocar pelo menos uma embreagem adicional de ovos antes que os adultos sofram (muitas vezes súbitas) altos níveis de mortalidade.
3. Use estes ovos Ae. aegypti infectados com E. aedis para continuar a propagação começando com o passo 1 deste protocolo.
   NOTA: Os ovos podem ser armazenados por 2 a 3 meses sob as condições adequadas¹⁶.
4. Limpe todos os materiais que entraram em contato com e. aedis com alvejante 10% e autoclaving (se possível) para evitar contaminação.

Resultados

Os ovos de E. aedis infectados Ae. aegypti Liverpool (LVP^1b12) foram eclodidos conforme descrito no protocolo acima. No estágio 4^instar, foram observados sinais visuais de infecção, incluindo cistos de esporos brancos em todos os corpos de gordura de larvas infectadas (um exemplo deste fenótipo é mostrado na Figura 2B). Os esporos uninucleados foram colhidos a partir de 4^ª larvas instar pela homogeneização de 10 larvas em 500 μL d'água DI. Estes esporos eram piriformes (em forma de pera) e facilmente visíveis em 400x (Figura 2A). Utilizando um hemótmetro, calculou-se uma contagem de esporos de 4,05 x 10³ esporos/μL. Cem larvas saudáveis de Ae. aegypti foram então infectadas horizontalmente com ~50.000 esporos em água de 100 mL para uma dose final de ~500 esporos/larva. Larvas foram criadas até a idade adulta (geração parental) e alimentadas com sangue desfibriado mais 1% (v/v) 100 mM triphosfato de adenosina. Ovos infectados verticalmente foram coletados (geração filial) e eclodidos para continuar a propagação de E. aedis e quantificar o sucesso da infecção.

Em sete dias após a eclosão, 25 larvas de geração filial foram transferidas para tubos individuais de microcentrifuuge de 1,5 mL e lavadas uma vez com água DI. As larvas individuais foram homogeneizadas em 250 μL de água dI e estado de infecção e as cargas de Aedis foram avaliadas por meio de hemótmetro. A taxa de infecção vertical de E. aedis na geração filial foi de 96% e a carga média de esporos de indivíduos infectados em sete dias após a eclosão foi de 3,31 x 10⁵ (Faixa: 3,25 x 10⁴ – 1,47 x 10⁶; Figura 3).

Figura 2: Visualização da infecção por E. aedis em mosquitos Ae. aegypti.  (A) Esporos piríbios uninucleados e aedis. Dez e. aedis infectado 4^vi larvas instar foram homogeneizados em 500 μL de água DI aproximadamente sete dias após a eclosão. 10 μL do homogeneado foi carregado em um hemótmetro e visto a 400X. Setas vermelhas indicam esporos representativos uninucleados E. aedis. (B) E. aedis infectado 4^vi larvas instar desenvolvem cistos esporos brancos distintos em todo o seu corpo gordo¹⁸. Eles também geralmente têm segmentos abdominais malformados e distendidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O protocolo cultural leva à eficaz infecção por E. aedis na geração filial. As larvas ae. aegypti (n = 25) da geração filial foram homogeneizadas individualmente em 250 μL de água DI e 10 μL do homogeneizado foi carregada em um hemócito. A presença de esporos uninucleados indicou infecção positiva e esporos foram quantificados para todas as amostras positivas. (A) Prevalência de infecção entre larvas filiais. Cinza corresponde a larvas não infectadas, e preto para infectado. Os números apresentados em cada segmento dão a contagem absoluta de indivíduos em cada grupo. (B) Carga de esporos para cada indivíduo infectado. Os pontos pretos representam a contagem de esporos uninucleados transformados_para cada larva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Apresentamos aqui o método originalmente descrito em Hembree e Ryan, 1982⁸ para a criação de microsporidia E. aedis em mosquitos Ae. aegypti. A cepa de E. aedis utilizada neste estudo foi derivada da coleção de campo original de Stephen Hembree na Tailândia em 1979¹⁹. O método capitaliza a transmissão horizontal, que ocorre naturalmente no ciclo de transmissão de E. aedis^7, para propagar o parasita de forma controlada. Este método pode ser desafiador para os recém-chegados que não estão familiarizados com a aparência de esporos, sintomas de infecção em larvas ou a coordenação necessária para completar com sucesso o protocolo de criação/dosagem em vários estágios. Nossa esperança é que os auxílios visuais que acompanham esse protocolo reduzam as barreiras à entrada de pesquisadores que desejam cultivar e. aedis.

Propagamos E. aedis em Ae. aegypti como descrito acima e quantificamos o sucesso do parasitismo na geração filial. Resumidamente, eclodimos ovos Ae. aegypti infectados, criamos-os para a^4ª instar, e coletamos esporos uninucleados E. aedis das larvas infectadas. Em seguida, infectamos horizontalmente larvas saudáveis com esses esporos através da ingestão oral, e criamos as larvas infectadas horizontalmente até a idade adulta. Alimentamos os adultos infectados (geração parental) e coletamos ovos (geração filial), que supumos que seriam verticalmente infectados com o parasita E. aedis. Eclodimos ovos da geração filial e coletamos e homogeneizamos um subconjunto das larvas quando eram 4^estrelas. Quantificamos a porcentagem de larvas infectadas com E. aedis e a contagem total de esporos em todos os indivíduos infectados. Descobrimos que a grande maioria (96%) dos indivíduos foram infectados e a carga média de esporos de larvas infectadas foi ~10⁵. Concluímos que nosso protocolo de criação resultou em uma propagação altamente bem sucedida do E. aedis em mosquitos Ae. aegypti.

Existem vários aspectos deste protocolo que podem ser particularmente desafiadores para o usuário não iniciado. Oferecemos abaixo algumas informações adicionais que podem ser de assistência. Para dúvidas sobre a criação geral do mosquito, um guia completo para a manutenção da colônia Ae. aegypti está além do escopo deste protocolo. No entanto, muitas questões comuns podem ser abordadas por recursos do Repositório de Recursos de Pesquisa de Biodefesa e Infecções Emergentes¹⁶,^17, incluindo eclosão de ovos, necessidades alimentares gerais, condições habitacionais e ambientais e alimentação sanguínea. Em relação à linha do tempo da infecção, as larvas eclodidas a partir de ovos infectados não apresentam sinais de infecção até o final do^4º estágio instar. Esporos uninucleados aparecem rapidamente, ao longo de 1-2 dias. Larvas podem parecer virtualmente não infectadas aos 6 dias após a eclosão, mas altamente infectadas até o dia 7 ou 8 pós-eclosão. Além disso, pode ser desafiador visualizar esporos em amostras homogeneizadas porque existem muitos outros micróbios presentes em homogeneizados de mosquitos inteiros, incluindo outros organismos eucarióticos unicelulares (por exemplo, levedura) de tamanho semelhante ao dos esporos uninucleados E. aedis. A forma distinta dos esporos de E. aedis (Figura 2A) é um método altamente confiável para identificação e ajudará a diferenciar e. aedis de outros micróbios na homogeneização. Embora não seja necessário para identificação ou quantificação, se a purificação do esporo for desejada, ela pode ser alcançada através da centrifugação gradiente de densidade de sílica coloidal que permitirá a separação dos esporos de E. aedis de outros elementos contaminantes no homogene. Este processo é descrito em detalhes em Solter et al.²⁰.

A temperatura e a dieta utilizadas nas práticas de criação geralmente diferem entre laboratórios, mas as variações provavelmente ainda produzirão uma propagação de parasitas bem sucedida. Pequenas diferenças no tipo de alimentos larvais não interferem com a infecção bem sucedida, embora não tenhamos testado explicitamente diferentes tipos de alimentos neste protocolo. O efeito da temperatura sobre a infecção foi testado e a infecção por E. aedis foi encontrada robusta a uma ampla faixa de temperaturas²¹. A produção máxima de esporos ocorreu a 30,8 °C, mas ainda era robusta na criação de temperaturas tão baixas quanto 20 °C. A contagem de esporos foi reduzida drasticamente em temperaturas de criação mais altas (36 °C), portanto essas temperaturas devem ser evitadas para este protocolo.

A contaminação é sempre uma preocupação quando se trabalha com parasitas. E. aedis é um parasita bem sucedido do Ae. aegypti e, portanto, deve ser mantido separado de colônias laboratoriais não infectadas para evitar contaminação. Recomendamos o armazenamento de mosquitos infectados em uma incubadora separada, se possível. Também recomendamos que os materiais utilizados para o trabalho de microsporidia (por exemplo, bandejas larvais, tubos de transferência, gaiolas, copos de coleta de ovos) sejam designados para trabalhos de microsporidia e não utilizados de forma mais ampla em todo o inseticário. Todos os materiais de criação devem ser esterilizados com alvejante de 10% após o uso e autoclaving pode ser usado para complementar a esterilização alvejante.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mL Specimen cup	McKesson	911759	Inexpensive alternative to beaker
150 mL beakers	VWR	10754-950	For larval dosing
2 oz round glass bottle	VWR	10862-502	Bottle for 10% sucrose in adult cages
3 oz. emergence cup	Henry-Schein	1201502	For transfer of pupae to cage
Adult mosquito cages	Bioquip	1462 or 1450ASV	For adult housing
Autoclave			For sterilization
Bleach			For sterilization
Brewer’s yeast	Solgar		For feeding larvae during dosing
Controlled rearing chamber	Tritech	DT2-MP-47L	Inexpensive small rearing chamber
Cotton roll	VWR	470161-446	Wick for sugar bottles
Defibrinated rabbit blood	Fisher	50863762	For blood feeding adults
Disodium ATP, crystalline	Sigma-Aldrich	A26209-5G	For blood feeding adults
Dry cat food	9Lives	Indoor Complete	For general larval rearing
Fish food flakes	TetraMin		For general larval rearing
Hemocytometer	Fisher	267110	For counting spores
Homogenizer/mixer motor	VWR	47747-370	For homogenizing infected larvae
Larval rearing trays	Sterillite	1961	Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4"
Liver powder	NOW foods	2450	For feeding larvae during dosing
Pipette 1 - 10µL	VWR	89079-962	For larval dosing
Pipette 100 - 1000µL	VWR	89079-974	For food during larval dosing
Pipette tips 1 - 10µL	VWR	10017-042	For larval dosing
Pipette tips 100 - 1000µL	VWR	10017-048	For food during larval dosing
Plastic pestles	VWR	89093-446	For homogenizing infected larvae
Sucrose, crystalline	Life Technologies	15503022	For adult feeding
Transfer pipet	VWR	414004-033	For larval transfer, must trim ends