Распространение микроспоридского паразита Edhazardia aedis у комаров Aedes aegypti

Резюме

Протокол к культуре микроспоридского паразита Edhazardia aedis. Паразит перешел от одного поколения комаров Aedes aegypti к следующему через горизонтальную передачу на этапе личинки с последующим вертикальной передачей на взрослой стадии. Live sporoplasms выжить в долгосрочной перспективе в инфицированных яиц.

Аннотация

Edhazardia aedis является микроспоридным паразитом комаров Aedes aegypti, переносчиком болезни, который передает несколько арбовирусов, которые вызывают миллионы случаев заболевания каждый год. E. aedis вызывает смертность и снижение репродуктивной пригодности в переносчике комаров и был исследован на его потенциал в качестве агента биоконтроля. Протокол, который мы представляем для культивирования E. aedis, основан на его естественном цикле инфекции, который включает как горизонтальную, так и вертикальную передачу на разных стадиях жизни хозяина комаров. Комары Ae. aegypti подвергаются воздействию спор на личиночинок. Эти инфицированные личинки затем созревают во взрослых и передают паразита вертикально их потомству. Зараженное потомство затем используется в качестве источника спор для будущей горизонтальной передачи. Культивирование E. aedis может быть сложным для непосвященных, учитывая сложности жизненного цикла паразита, и этот протокол содержит подробные рекомендации и визуальные пособия для уточнения.

Введение

Aedes aegypti является переносчиком комаров нескольких арбовирусов (например, денге, Зика, желтой лихорадки), которые вместе, по оценкам, составляют сотни миллионов случаев заболевания каждый год и более 30000 смертей^1,2. Лечение заболеваний, вызванных этими патогенами ограничивается поддерживающей помощи и вполне вероятно, что дополнительные арбовирусы появятся в^{будущем 3}. Поэтому борьба с переносчиком комаров имеет первостепенное значение, поскольку она эффективно предотвращает передачу современных и возникающих патогенов^4. Традиционно в стратегиях борьбы с переносчиками в основном используются химические инсектициды, однако устойчивость к многим широко используемым инсектицидам обуголит спрос на новые методы борьбы с переносчиками. Одним из потенциальных агентов, которые были изучены для его биоконтроля свойства против Ae. aegypti является паразит Edhazardia aedis^5,6.

E. aedis, впервые идентифицирован как Nosema aedis Кудо в 1930 году, является микроспоридским паразитом комаров Ae aegypti ⁷. Разработка и воспроизведение E. aedis является относительно сложным и его жизненный цикл может продолжаться^{несколькими способами 7,8,9}. Один общий цикл развития подробно описан в Becnel et al., 1989⁷ и используется для лабораторного распространения(рисунок 1)⁸. Короче говоря, цикл начинается, когда Ae. aegypti яйца вертикально инфицированных E. aedis люк в инфицированных личинок, которые развиваются споры унинуклеата в жировом теле, и, как правило, умирают, как личинки или куколки. Унинуклеатные споры, высвобождаемые из мертвых личинок, загрязняют среду обитания и попадают в организм здоровых личинок Ae. aegypti. Эти споры прорастают в основном в пищеварительном тракте, заражая пищеварительную ткань открытых личинок, что приводит к горизонтальной передаче. Горизонтально инфицированные личинки превращаются во взрослых (родительское поколение), где образуются споры бинуклеата. У женщин, эти споры бинуклеата вторгнуться в репродуктивный тракт и связанных с ними sporoplasm заражает развивающихся яйцеклеток. Затем эти яйца вылупляются в инфицированные личинки (семейное поколение), что приводит к вертикальной передаче паразита и продолжению цикла, как описано выше.

Многочисленные исследования исследовали потенциал E. aedis для биоконтроля. Инфекция E. aedis было продемонстрировано, чтобы привести к снижению репродуктивной способности женщин Ae. aegypti ¹⁰. Кроме того, в полу-полевой эксперимент, затопления релиз E. aedis привело к полной ликвидации испытания Ae. aegypti населения хранится в пределах экранированных^{корпус 6}. Хотя в состоянии пройти некоторые этапы развития в разнообразный набор видов комаров, E. aedis только вертикально передается в Ae. aegypti, что свидетельствует о высокой степени специфичности хозяина^11,12. Аналогичным образом, в лабораторной оценке потенциального экологического риска, связанного с E. aedis, микроспоридный паразит не смог заразить нецелевую водную фауну, в том числе хищников, которые проглотили личинки Ae aegypti, инфицированные E. aedis¹³. Эти результаты подчеркивают потенциал использования E. aedis в стратегиях биологического контроля, ориентированных на естественные популяции Ae. aegypti.

Несмотря на то, что E. aedis демонстрирует перспективу использования в борьбе с переносчиками, существуют проблемы с культивированием и развертыванием его в широком масштабе. Споры E. aedis теряют инфекционность менее чем за один день при низких температурах (т.е. 5 градусов по Цельсию). Даже при более высоких температурах (т.е. 25 градусов по Цельсию) споры быстро теряют инфекционность в течение трех недель¹⁴. Кроме того, E. aedis должны быть культурны в живых комаров Ae. aegypti и контролируемого досирования здоровых личинок комаров необходимо для обеспечения завершения жизненного цикла и предотвращения коллапса населения, используемого для^{культуры 8}. Требование о культивировании in vivo представляет собой проблему; однако недавние достижения в области выращивания массы комаров и робототехники (например, Massaro et al.^{15) могут}позволить крупномасштабное поколение спор E. aedis. Мы ожидаем, что визуализация этой методологии повысит доступность протокола воспитания E. aedis и позволит большему число исследователей исследовать основную биологию и прикладной потенциал этой системы. Мы также ожидаем, что это будет способствовать более тесному сотрудничеству с инженерами, робототехниками и более широким технологическим сектором, который может служить для улучшения массового воспитания E. aedis.

Рисунок 1: E. aedis распространение в Ae. aegypti. Распространение E. aedis начинается с вылупления инфицированных яйцеклеток E. aedis. Зараженные личинки вырастили до^4-й instar, споры E. aedis изолированы от этих личинок, и споры используются для устного заражения здоровых 2-й /3^rd личинки instar, вырастили из неинфицированного сцепления яиц (горизонтальная передача). Эти устно инфицированные личинки затем вырастили до совершеннолетия (родительское поколение) и откладывают яйца, инфицированные E. aedis (вертикальная передача). Зараженные яйца (семейное поколение) затем вылупляются, чтобы продолжить цикл инфекции и паразитов культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

протокол

1. День 0

1. Hatch Ae. aegypti яйца, инфицированные E. aedis путем размещения в личинки выращивания лоток с 1 L деионизированных (DI) воды. Добавьте 50 мг рыбной пищи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На момент публикации лабораторный штамм E. aedis доступен только в лабораториях, активно исследующих паразита, так как E. aedis не поспособен для длительного хранения, а инфицированные яйца в настоящее время не хранятся в хранилищах. Исследователи, заинтересованные в работе с E. aedis, могут связаться с соответствующим автором, чтобы запросить инфицированные яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вылупление большого количества инфицированных яиц, как правило, не является необходимым; десять E. aedis инфицированных личинок Ae. aegypti достаточно, чтобы доза ≥ 1000 здоровых личинок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех частей этого протокола, мы размещали комаров в следующих условиях: 14 ч/10 ч светло-темный цикл, температура 27 градусов по Цельсию и 80% относительная влажность.

2. День 1

1. После вылупления уменьшите плотность личинок до 100 личинок на лоток, сделав новые лотки по мере необходимости (также с 1 L DI воды).
2. Добавьте кусок сухого кошачьего еды к каждому подносу. Пополнить пищу при истощении, но не обеспечивают избыток пищи. Одного куска кошачьего еды (200 мг) каждые три дня достаточно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество пищи в зависимости от конкретных условий выращивания (т.е. уменьшите пищу, если вода станет мутной или личинки умирают, увеличьте пищу, если личинки сильно задерживаются в развитии). Можно использовать другие схемы кормления и/или условия выращивания, чем те, которые предлагается здесь, однако могут потребоваться корректировки сроков действия этого стандартного протокола.

3. Дни 4'u20125

1. Когда инфицированные личинки^3-й -^4-й instars, люк здоровых / неинфицированных Ae. aegypti яйца в новом лотке.
2. Задняя при плотности такова, что здоровый Ae. aegypti достигает^2-го - 3-го дюйма в 48-72 ч. В наших руках, это может быть достигнуто с помощью плотности 200-u2012300 личинок на 1 л воды с ad libitum доступ к пище. Hatching партии здоровых яиц в течение нескольких дней может гарантировать, что личинки находятся на правильной стадии, когда это необходимо.

4. Дни 7'u20128: Горизонтальная передача

ПРИМЕЧАНИЕ: Досинг здоровых личинок с E. aedis не может быть выполнен до тех пор, пока одноядерные споры не будут в большом количестве в инфицированных личинках (1 x 10⁴ - 1 x 10⁶ на личинку). Это происходит в конце^{4-й стадии} instar(рисунок 2).

1. Урожай и количественная оценка спор унинуклеата.
   1. Используйте перенесите пипетку (возможно, придется сократить кончик до более широкого диаметра), чтобы переместить 10 инфицированных личинок в микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
   2. Удалите селекционную воду с помощью пересадочной трубы и промойте один раз, добавив 1 мл чистой воды DI. Удалите промывку водой с помощью пипетки, добавьте 500 йл чистой воды DI в 10 личинок и гомогенизируйте с помощью пестика и механического гомогенизатора.
   3. Количественная оценка спор с использованием гемоцитометра при увеличении в 400 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Унинуклеатные споры могут быть идентифицированы по их четкой пириформной форме (т.е. форме груши; Рисунок 2A).
2. Доза здоровых личинок Ae. aegypti с E. aedis.
   1. Сделать свежие личинки пищевой суспензии, смешивая 1,2 г порошка печени, 0,8 г пивных дрожжей и 100 мл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пища не должна быть свежей, если она автоматически и хранится при 4 градусов по Цельсию до использования.
   2. Передача 100^2-й - 3^rd instar здоровых личинок Ae. aegypti в 150 мл стаканов или образца чашки.
   3. Доза каждого стакана 100 личинок с 5 х 10⁴ - 1 х^{10 5} спор.
   4. Добавьте 2 мл лиственницы пищевой суспензии и воду DI до конечного объема 100 мл.
3. После 12-24 ч экспозиции, передача открытых личинок в выращивание лотки и задней к взрослой жизни после стандартного протокола воспитания¹⁶.

5. Мониторинг и вертикальная передача

1. Монитор досированных личинок для окукливания и передачи куколок, как они развиваются в чашку появления в клетке. Сахар кормит взрослых ad libitum (по^16,17). Eclosing взрослых будут инфицированы E. aedis.
2. Кровь кормит взрослых (по^16,17) и собирать яйца. Вертикальная передача E. aedis происходит на этом этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если дополнительные блюда крови предоставляются, как только oviposition завершена, женщины могут заложить по крайней мере один дополнительный муфты яиц, прежде чем взрослые страдают (часто внезапные) высокий уровень смертности.
3. Используйте эти яйца Ae. aegypti, инфицированные E. aedis, чтобы продолжать размножение, начиная с шага 1 этого протокола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться в течение 2 - 3 месяцев при соответствующих условиях¹⁶.
4. Очистите все материалы, которые соедились с E. aedis с 10% отбеливателем и автоклавом (если это возможно) для предотвращения загрязнения.

Результаты

E. aedis инфицированных Ae. aegypti Ливерпуль (LVP^1b12) яйца были вылупились, как описано в протоколе выше. В^{4-й стадии} instar, визуальные признаки инфекции могут наблюдаться, в том числе белые споры кисты по всему жировых тел инфицированных личинок (пример этого фенотипа показано на рисунке 2B). Uninucleate споры были собраны из^{4-й личинки} instar путем гомогенизации 10 личинок в 500 йл DI воды. Эти споры были пириформными (грушевидной формы) и легко видны в 400x(рисунок 2A). С помощью гемоцитометра было рассчитано количество спор 4,05^{х 10 3} споры/ОЛ. Сто здоровых личинок Ae. aegypti были затем горизонтально инфицированы спорами в 100 мл воды в 100 мл для окончательной дозы в 500 спор/личинок. Личинки были воспитаны до совершеннолетия (родительского поколения) и крови кормили с помощью дефибрированных крови кролика плюс 1% (v/v) 100 мМ аденозин трифосфат. Вертикально инфицированные яйца были собраны (семейное поколение) и вылупились для продолжения распространения E. aedis и количественной оценки успеха инфекции.

В течение семи дней после вылупления 25 личинок семейного поколения были перенесены в отдельные микроцентрифуги 1,5 мл и промыты один раз водой DI. Отдельные личинки были гомогенизированы в 250 МКЛ воды и инфекционного статуса и E. aedis нагрузки были оценены с помощью гемоцитометра. Вертикальный уровень инфицирования E. aedis в поколении фили был обнаружен на уровне 96%, а средняя спорная нагрузка инфицированных особей в течение семи дней после вылупления составила 3,31^{х 10 5} (Диапазон: 3,25 x 10⁴ - 1,47 x 10^6; Рисунок 3).

Рисунок 2: Визуализация инфекции E. aedis у комаров Ae. aegypti. (A) E. aedis унинуклеатные пириформные споры. Десять E. aedis инфицированных 4-й личинки instar были гомогенизированы в 500 йл воды DI примерно семь^дней после вылупления. 10 МКЛ гомогената был загружен на гемоцитометр и просмотрен на 400X. Красные стрелки указывают на репрезентативные споры uninucleate E. aedis. (B) E. aedis инфицированных 4-й^{личинки} instar развивать отличительные белые споры кисты по всей их жира^{тела 18}. Они также обычно имеют пороки развития и вытянутые сегменты брюшной полости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Культурный протокол приводит к эффективной инфекции E. aedis в поколении родовых.  Личинки Ae. aegypti (n No 25) из поколения фили были однородной индивидуально в 250 йл DI воды и 10 ЗЛ гомогената был загружен на гемоцитометр. Наличие однонуклеатных спор указывает на положительную инфекцию, и споры были количественно оценены по всем положительным образцам. (A)Распространенность инфекции среди личинок. Серый цвет соответствует неинфицированным личинкам, а черный - инфицированным. Цифры, отображаемые на каждом сегменте, дают абсолютный подсчет лиц в каждой группе. (B)Спорная нагрузка для каждого инфицированного человека. Черные точки представляют_{собой журнал 10} преобразованы унинуклеат споры рассчитывать на каждую личинку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Мы представляем здесь метод, первоначально описанный в Хембри и Райан, 1982⁸ для выращивания E. aedis микроспоридии в комарах Ae. aegypti. Штамм E. aedis, используемый в этом исследовании, был получен из оригинальной полевой коллекции Стивена Хембри в Таиланде в 1979^{году 19}. Метод использует горизонтальную передачу, которая естественным образом происходит в цикле передачи E. aedis⁷, для контролируемого распространения паразита. Этот метод может быть сложным для новичков, которые не знакомы с появлением спор, симптомы инфекции у личинок, или координация, необходимая для успешного завершения многоступенчатого воспитания / досирования протокола. Мы надеемся, что визуальные пособия, которые сопровождают этот протокол позволит уменьшить барьеры для входа для исследователей, которые хотят культуры E. aedis.

Мы распространяли E. aedis в Ae. aegypti, как описано выше, и количественно успех тунеядства в поколении семей. Короче говоря, мы вылупились E. aedis инфицированных Ae. aegypti яйца, вырастили их до 4-й^instar, и собрали uninucleate E. aedis споры из инфицированных личинок. Затем мы горизонтально инфицированных здоровых личинок с этими спорами через пероральный прием внутрь, и поднял горизонтально инфицированных личинок до совершеннолетия. Мы кормили инфицированных взрослых (родительское поколение) и собирали яйца (семейное поколение), которые, как мы предположили, были бы вертикально заражены паразитом E. aedis. Мы вылупились яйца из семейного поколения и собрали и гомогенизировали подмножество личинок, когда они были^4-й instars. Мы количественно определить процент личинок, которые были инфицированы E. aedis и общее количество спор у всех инфицированных людей. Мы обнаружили, что подавляющее большинство (96%) людей были инфицированы, а средняя спорная нагрузка инфицированных личинок составила 10^{5 евро.} Мы пришли к выводу, что наш протокол выращивания привел к весьма успешному распространению E. aedis у комаров Ae. aegypti.

Есть несколько аспектов этого протокола, которые могут быть особенно сложными для непосвященного пользователя. Ниже мы предлагаем некоторую дополнительную информацию, которая может оказать помощь. Что касается вопросов, касающихся выращивания комаров в целом, то полное руководство по техническому обслуживанию колонии Ae. aegypti выходит за рамки настоящего протокола. Тем не менее, многие общие вопросы могут быть решены за счет ресурсов из Biodefense и новых инфекций научно-исследовательских^{ресурсов хранилище 16},^{17 в}том числе яйцо штриховки, общие диетические потребности, жилье и условия окружающей среды, и кормления крови. Что касается сроков инфицирования, личинки, вылупившихся из инфицированных яиц, не проявляют признаков инфекции до конца^4-й стадии instar. Uninucleate споры появляются быстро, в течение 1-2 дней. Личинки могут появиться практически неинфицированными в течение 6 дней после вылупления, но сильно инфицированными в день 7 или 8 после вылупления. Кроме того, это может быть сложной задачей для визуализации спор в гомогенизированных образцов, поскольку Есть много других микробов, присутствующих в целом комаров гомогенатов, в том числе других эукариотических одноклеточных организмов (например, дрожжи) такого же размера, как споры E. aedis uninucleate. Отличительная форма спор E. aedis (рисунок 2A) является очень надежным методом идентификации и поможет отличить E. aedis от других микробов в гомогенате. Хотя это не является необходимым для идентификации или количественной оценки, если спороочистка желательно, она может быть достигнута с помощью коллоидной плотности кремнезема градиент центрифугации, которая позволит для отделения спор E. aedis от других загрязняющих элементов в гомогенате. Этот процесс подробно описан в Solter et al.²⁰.

Температура и диета, используемые в воспитании практики обычно отличаются между лабораториями, но вариации, скорее всего, по-прежнему дают успешное распространение паразитов. Незначительные различия в типе личинок питания не мешают успешной инфекции, хотя мы явно не проверить различные типы продуктов питания в этом протоколе. Влияние температуры на инфекцию было проверено и E. aedis инфекции было установлено, что надежный при широком диапазоне температур²¹. Максимальное производство спор произошло при температуре 30,8 градусов по Цельсию, но все еще было устойчивым при температурах при температуре до 20 градусов по Цельсию. Количество спор резко сократилось при более высоких температурах при выращивании (36 градусов по Цельсию), поэтому этих температур следует избегать для этого протокола.

Загрязнение всегда вызывает озабоченность при работе с паразитами. E. aedis является успешным паразитом Ae. aegypti и поэтому должен храниться отдельно от неинфицированных лабораторных колоний для предотвращения загрязнения. Мы рекомендуем по возможности хранить инфицированных комаров в отдельном инкубаторе. Мы также рекомендовали, чтобы материалы, используемые для работы микроспоридии (например, личинки лотки, передачи пипетки, клетки, чашки сбора яиц) предназначены для работы микроспоридии и не используется более широко во всем насекомых. Все материалы для выращивания должны быть стерилизованы с 10% отбеливателя после использования и автоклавинга могут быть использованы в дополнение к стерилизации отбеливателя.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mL Specimen cup	McKesson	911759	Inexpensive alternative to beaker
150 mL beakers	VWR	10754-950	For larval dosing
2 oz round glass bottle	VWR	10862-502	Bottle for 10% sucrose in adult cages
3 oz. emergence cup	Henry-Schein	1201502	For transfer of pupae to cage
Adult mosquito cages	Bioquip	1462 or 1450ASV	For adult housing
Autoclave			For sterilization
Bleach			For sterilization
Brewer’s yeast	Solgar		For feeding larvae during dosing
Controlled rearing chamber	Tritech	DT2-MP-47L	Inexpensive small rearing chamber
Cotton roll	VWR	470161-446	Wick for sugar bottles
Defibrinated rabbit blood	Fisher	50863762	For blood feeding adults
Disodium ATP, crystalline	Sigma-Aldrich	A26209-5G	For blood feeding adults
Dry cat food	9Lives	Indoor Complete	For general larval rearing
Fish food flakes	TetraMin		For general larval rearing
Hemocytometer	Fisher	267110	For counting spores
Homogenizer/mixer motor	VWR	47747-370	For homogenizing infected larvae
Larval rearing trays	Sterillite	1961	Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4"
Liver powder	NOW foods	2450	For feeding larvae during dosing
Pipette 1 - 10µL	VWR	89079-962	For larval dosing
Pipette 100 - 1000µL	VWR	89079-974	For food during larval dosing
Pipette tips 1 - 10µL	VWR	10017-042	For larval dosing
Pipette tips 100 - 1000µL	VWR	10017-048	For food during larval dosing
Plastic pestles	VWR	89093-446	For homogenizing infected larvae
Sucrose, crystalline	Life Technologies	15503022	For adult feeding
Transfer pipet	VWR	414004-033	For larval transfer, must trim ends