Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Resumo

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Resumo

Condições degenerativas retinianas (DR) associadas à perda de fotorreceptores, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinose pigmentar (RP) e amaurose congênita de Leber (LCA), causam perda progressiva e debilitante da visão. Há uma necessidade não atendida de terapias que possam restaurar a visão uma vez que os fotorreceptores tenham sido perdidos. O transplante de tecido da retina derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) no espaço sub-retiniano de um olho com DR avançada traz folhas de tecido da retina com milhares de fotorreceptores saudáveis livres de mutação e tem um potencial para tratar a maioria/todas as doenças cegantes associadas à degeneração de fotorreceptores com um protocolo aprovado. O transplante de tecido retiniano fetal para o espaço sub-retiniano de modelos animais e pessoas com DR avançada foi desenvolvido com sucesso, mas não pode ser usado como terapia de rotina devido a preocupações éticas e suprimento limitado de tecidos. Modelos animais de degeneração retiniana hereditária de grandes olhos (IRD) são valiosos para o desenvolvimento de terapias de restauração da visão utilizando abordagens cirúrgicas avançadas para transplantar células/tecidos da retina para o espaço sub-retiniano. As semelhanças no tamanho do globo e na distribuição dos fotorreceptores (por exemplo, presença de área central da região semelhante à mácula) e a disponibilidade de modelos de IRD recapitulando de perto o IRD humano facilitariam a rápida tradução de uma terapia promissora para a clínica. Apresenta-se aqui uma técnica cirúrgica de transplante de tecido retiniano derivado de hPSC para o espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte, permitindo avaliar esta abordagem promissora em modelos animais.

Introdução

Milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pela degeneração retiniana (DR) com consequente deficiência visual ou cegueira associada à perda dos fotorreceptores (RPs) sensíveis à luz. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira resultante de uma combinação de fatores de risco genéticos e fatores ambientais/estilo de vida. Além disso, mais de 200 genes e loci causaram DR hereditária (IRD)¹. A retinose pigmentar (PR), a mais comum DIR, é geneticamente heterogênea, com mais de 3.000 mutações genéticas em aproximadamente 70 genes relatadas2,3,4. A Amaurose Congênita de Leber (LAC), que causa cegueira na infância, também é geneticamente heterogênea5,6. A terapia de aumento gênico foi desenvolvida e está em ensaios clínicos para o tratamento de um pequeno número de IRDs ^3,7. No entanto, uma terapia separada deve ser desenvolvida para o tratamento de cada forma genética distinta de IRD e, assim, tratar apenas um pequeno subgrupo de pacientes. Além disso, o aumento gênico depende da presença de uma população de fotorreceptores resgatáveis e, portanto, não é aplicável para degeneração avançada.

Há, portanto, uma necessidade clínica urgente e ainda não atendida para o desenvolvimento de terapias que abordem e tratem as DRs avançadas e a cegueira profunda a terminal. Nas últimas 2 décadas implantes neuroprotéticos foram desenvolvidos e testados em modelos animais de grande porte, como o gato, antes do uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Da mesma forma, nos últimos 20 anos, terapias de reposição retiniana utilizando lâminas de retina de mamíferos embrionárias ou mesmo maduras enxertadas sub-retinicamente foram desenvolvidas 15,16,17,18,19,20,21,22 e até testadas com sucesso em pacientes com DR ^23,24,25. Ambas as abordagens utilizam a ideia de introduzir novos sensores (fotodiodos fotovoltaicos de silício, no caso de dispositivos neuroprotéticos26,27, e fotorreceptores saudáveis livres de mutação organizados em folhas^, no caso de implantação de folhas de retina) em retinas com RPs degenerados. Estudos recentes têm investigado o uso de abordagens baseadas em células-tronco, como o transplante de progenitores retinianos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)^28,29, fotorreceptores hPSC 30 e organoides retinianos hPSC^31,32,33. Os organoides da retina permitem a formação de tecido retiniano em uma placa e derivação de folhas fotorreceptoras com milhares de RPs livres de mutação, que se assemelham à camada fotorreceptora da retina fetal humana em desenvolvimento 34,35,36,37,38,39,40 . O transplante de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) para o espaço sub-retiniano de pacientes com DR é uma das novas e promissoras abordagens de terapia celular investigativa, sendo perseguida por várias equipes31,32,41,42. Em comparação com o transplante da suspensão celular (de fotorreceptores jovens ou progenitores da retina), folhas transplantadas de fotorreceptores fetais demonstraram resultar em melhora da visão em ensaios clínicos^23,24.

O protocolo aqui apresentado descreve, em detalhes, um procedimento de transplante para liberação sub-retiniana de organoides da retina inteira (em vez de bordas organoides33,41) como uma maneira potencialmente melhor de introduzir lâminas retinianas intactas com RPs^, para aumentar a sobrevida do enxerto e melhorar a preservação do lençol. Embora procedimentos para introdução de um pedaço plano de retina humana e também de placas de EPR tenham sido desenvolvidos^43,44,45, o transplante de enxertos 3D maiores ainda não foi investigado. Os organoides da retina derivados de células-tronco fornecem uma fonte inesgotável de folhas fotorreceptoras para o desenvolvimento de tecnologias de restauração da visão, são livres de restrições éticas e são considerados uma excelente fonte de tecido retiniano humano para terapias focadas no tratamento da DR avançada e cegueira terminal⁴⁶. O desenvolvimento de métodos cirúrgicos para implante sub-retiniano preciso de organoides da retina com mínima lesão do nicho retiniano do hospedeiro (retina neural, epitélio pigmentado da retina e vasculatura retiniana e coroidal) é um dos passos críticos para o avanço dessa terapia para aplicações^{clínicas31,32}. Modelos animais de grande porte, como gatos, cães, porcos e macacos, têm se mostrado bons modelos para investigar métodos de parto cirúrgico, bem como para demonstrar a segurança de lâminas de tecido implantadas (células do epitélio pigmentado da retina (EPR)) e investigar o uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . O olho do grande animal tem tamanho de globo semelhante ao humano, bem como anatomia semelhante, incluindo a presença de uma região de alta densidade de fotorreceptores, incluindo cones (a área central), assemelhando-se à mácula humana 6,51,52.

Neste manuscrito, é descrita uma técnica para a implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) no espaço sub-retiniano de modelos de animais grandes felinos (gatos selvagens e Crx^Rdy/+) que, juntamente com resultados promissores de eficácia32,53, constrói uma base para o desenvolvimento posterior dessa terapia experimental em direção a aplicações clínicas no tratamento de condições de DR.

Protocolo

Os procedimentos foram conduzidos de acordo com a declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Eles também foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan. Gatos selvagens e Crx^Rdy/+ de uma colônia de gatos mantida na Michigan State University foram usados neste estudo. Os animais foram alojados sob ciclos claro-escuro de 12 h : 12 h e alimentados com uma dieta comercial completa para gatos.

1. Procedimentos pré-implantação e arranjo cirúrgico

1. Selecione gatos selvagens ou Crx^Rdy/+, dependendo do desenho do estudo. Realizar um exame oftalmológico pré-cirúrgico, incluindo biomicroscopia com lâmpada de fenda e oftalmoscopia indireta. Excluir quaisquer animais com anormalidades de fundo de olho não relacionadas aos seus genótipos.
2. Uma semana antes do implante, iniciar os animais em um protocolo imunossupressor de ciclosporina oral 2 mg/kg e prednisolona 1 mg/kg, ambos duas vezes ao dia para ajudar a prevenir a rejeição do transplante.
3. Jejuar os animais com mais de 4 meses de idade durante a noite (pelo menos 8 h). Fornecer uma quantidade limitada de alimento úmido durante a noite para os animais com menos de 4 meses de idade e, em seguida, jejuá-los por 2 h antes da cirurgia.
4. Realizar um exame físico geral, incluindo ausculta torácica (usando um estetoscópio). Registre a frequência cardíaca e respiratória, temperatura, cor da membrana mucosa e tempo de enchimento capilar.
5. Pré-medicar os animais com menos de 4 meses de idade com buprenorfina (0,02 mg/kg) e aqueles com mais de 4 meses de idade com buprenorfina (0,02 mg/kg) combinada com acepromazina (0,02 mg/kg) por via subcutânea ou intramuscular 30–45 minutos antes da indução da anestesia geral.
6. Aplicar solução oftálmica tópica de tropicamida a 1% e solução oftálmica de fenilefrina a 10% na superfície ocular pelo menos duas vezes para dilatar as pupilas. Repita se as pupilas não estiverem bem dilatadas.
7. Colocar um cateter intravenoso de 22 G na veia cefálica em todos os animais: primeiro clipar pelos de uma área de 2 x 3 cm sobre a veia cefálica; preparar a pele esfregando-a primeiro com etanol 70% e depois com uma esfoliação de clorexidina; Coloque o cateter e fixe com fita adesiva e lave com soro fisiológico heparinizado. Em animais com menos de 4 meses, isso pode ser feito após a indução anestésica.
8. Induzir anestesia geral 30–45 min após a pré-medicação: animais com menos de 4 meses de idade são induzidos com isoflurano administrado por máscara, aqueles com mais de 4 meses de idade são induzidos com propofol intravenoso (4–6 mg/kg).
9. Intubar com tamanho adequado de tubo endotraqueal. Visualize a laringe com uma luz de exame ou laringoscópio. Borrifar 0,1 mL de lidocaína a 2% na laringe, aguardar alguns segundos e intubar em seguida.
10. Manter a anestesia com isoflurano (entre 2% a 3,5%) em oxigênio (300% a 600 mL/kg/min) por meio de um sistema Bain.
11. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre um travesseiro de posicionamento no qual uma manta de água aquecida coberta por toalhas é posicionada. Conecte um monitor do paciente e monitore a frequência cardíaca e o eletrocardiograma (ECG), a frequência respiratória, a pressão arterial, a saturação de oxigênio e o dióxido de carbono expirado. Monitorar regularmente a temperatura corporal durante o procedimento. Uma pessoa devidamente treinada é responsável pela manutenção e monitorização da anestesia.
12. Posicione o animal com a ajuda do travesseiro de posicionamento de forma que a superfície da córnea fique horizontal quando o olho for girado para uma posição primária do olhar. Fixe a cabeça no lugar usando fita adesiva médica.
13. Cubra o animal com cobertores para ajudar a manter a temperatura corporal.
14. Lavar o cateter intravenoso com solução salina heparinizada e iniciar uma infusão intravenosa de Ringer lactato fornecido a 2–5 mL/kg/h durante todo o procedimento.
15. Preparar a superfície ocular, saco conjuntival e pálpebras para cirurgia asséptica usando iodopovidona 0,2%, aplicadores estéreis de cotonete e bolas de algodão.
16. Posicione o microscópio cirúrgico com oculares também ajustadas adequadamente. Coloque o controle do pé para o microscópio (foco, zoom e controle do eixo XY) e a máquina de vitrectomia para que o cirurgião possa operá-los.
17. Prepare-se para a cirurgia asséptica: todo o pessoal deve usar esfoliantes cirúrgicos, chapéu cirúrgico e máscara. Certifique-se de que o cirurgião e o(s) assistente(s) esfreguem, aventam e luvam como para cirurgia asséptica de rotina. Todo o pessoal deve estar familiarizado com técnicas assépticas.
18. Depois que o pessoal estiver esfregado, vestido e enluvado, abra as bolsas cirúrgicas e coloque os instrumentos. Coloque botões de manipulação estéreis nos botões de ajuste do microscópio para permitir que o cirurgião ou o assistente se ajuste sem quebrar a assepsia. Drape o animal de forma rotineira para cirurgia ocular.
19. Prepare a máquina de vitrectomia seguindo as instruções do fabricante para uma vitrectomia de dois portas.
    1. Coloque uma lente de contato de vitrectomia e duas portas de vitrectomia 23 G na mesa do assistente. Fixe o cautério de campo molhado. Fixar e primer a tubulação de infusão e a peça de mão de vitrectomia 23G.
    2. Coloque os instrumentos de vitrectomia e as linhas de fluido sobre o pano estéril e mantenha-os em posição usando pinças de toalha. Ajuste a máquina de vitrectomia no modo Vácuo Proporcional entre 1.500 e 2.500 cortes por minuto (cpm) e vácuo máximo de 500 mmHg. Isso é realizado pressionando os botões de seta (para cima ou para baixo) presentes no painel frontal da máquina de vitrectomia.

2. Preparo dos organoides para implante sub-retiniano (Figura 1)

1. Derivar organoides da retina conforme descrito anteriormente 31 e, se necessário, enviar durante a noite a³⁷ °C, conforme relatado anteriormente⁵⁴.
2. Limpe as superfícies na sala de cultura de tecidos no laboratório receptor com um desinfetante e mantenha o mesmo alto nível de técnica asséptica como em uma sala cirúrgica para cirurgias oculares, para evitar contaminação bacteriana ou fúngica, e carregue para a sala de cirurgia para evitar infecção do sítio cirúrgico.
3. Usar capas cirúrgicas, jalecos descartáveis, gorros, máscaras cirúrgicas, mangas e esfoliantes cirúrgicos dentro da sala de cultura de tecidos destinada ao preparo organoide para cirurgias oculares.
4. Pré-equilíbrio do meio neural com 20 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e 20 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) por 1 h em incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO₂). Coloque organoides em meios em placas de ultrabaixa adesão usando aproximadamente um quarto do volume de meio condicionado (do embarque noturno) e três quartos do volume de meio fresco^31,54. Manter por 24–48 h.
5. Preparar e equilibrar várias placas frescas de 60 mm com meio neural (conforme preparado na etapa 2.4) por pelo menos 1 h na incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO₂) antes de anestesiar o primeiro animal. Note-se que essas placas são usadas para transferir os organoides para cada cirurgia individual, com uma suposição de que as condições de pH e saturação de CO₂ serão mantidas na mídia por pelo menos 20 min, o suficiente para mover a placa para a sala de cirurgia e carregar organoides na cânula.
6. Utilizar uma placa fresca de 60 mm com meios neurais pré-saturados para cada caso de transplante, mantendo as placas restantes na incubadora de cultura de tecidos a 37 °C.
7. Transfira 6–9 organoides em uma placa de 60 mm (com meio ressaturado) pipetando-os com uma pipeta manual de canal único (20–200 μL) com ponta de filtro estéril de 200 μL com uma abertura ampla (~0,7 mm). Essas pontas podem ser preparadas com antecedência ou durante o procedimento, cortando ~3-4 mm da ponta com uma tesoura estéril (feita no capuz de cultura de tecidos para evitar contaminação). Coloque a placa de 60 mm dentro de uma placa de cultura de tecidos de 100 mm (para evitar contaminação durante o transporte sala a sala) e transporte rapidamente para a sala cirúrgica.
8. Coloque a placa com organoides numa almofada de aquecimento eléctrico a 37 °C coberta por um campo estéril.
9. Mude para um novo par de luvas estéreis antes de preparar os organoides.
10. Enxágue os organoides em solução salina balanceada estéril (BSS) (opcional) e, em seguida, carregue no injetor, que consiste em uma cânula de vidro borossilicato de paredes finas (diâmetro externo, OD 1,52 mm; diâmetro interno, ID 1,12 mm) com uma extremidade romba polida presa por tubulação plástica estéril a uma seringa Hamilton estéril de 500 μL pré-cheia com BSS estéril.
11. Passe a cânula para a equipe cirúrgica de forma estéril quando eles estiverem prontos para injetar os organoides.
12. Mantenha a duração de todo o procedimento (desde a remoção dos organoides do meio de cultura de tecidos até o carregamento da cânula) para 20 min ou menos.
13. Se houver atraso na implantação dos organoides, coloque-os novamente na incubadora de cultura de tecidos, para evitar alterações na saturação de pH/CO₂ dentro da placa.
14. Reter organoides não utilizados por 1 semana na mesma incubadora de cultura de tecidos e monitorar qualquer evidência de contaminação.

3. Implantação de organoides sub-retinianos

1. Realizar uma cantotomia lateral de 0,5 a 1 cm com tesoura de tenotomia Stevens. Coloque um espéculo de pálpebra Barraquer de tamanho adequado para manter as pálpebras abertas. Certifique-se de que o assistente cirúrgico irrige a córnea regularmente com BSS durante o procedimento.
2. Coloque 2 pontos de permanência de sutura de seda 6–0 na conjuntiva imediatamente adjacente ao limbo nas posições 4 e 8 horas para segurar o olho no olhar primário e retrair a terceira pálpebra. Use pinça de amarração corneana de Castroviejo 0,5 e um pequeno hemostático de mosquito para segurar suavemente a conjuntiva bulbar próxima ao limbo. Deixe as suturas longas e prenda as extremidades com pequenos hemostáticos de mosquito para ajudar na sua manipulação.
   OBS: A colocação da sutura sob a terceira pálpebra é mais difícil; Certifique-se de colocá-lo imediatamente ao lado do limbo.
3. Coloque outra sutura na posição das 12 horas no limbo parcialmente através da espessura do limbo tomando cuidado para não penetrar no olho. Amarre essa sutura frouxamente e corte as pontas curtas. Isso fornece uma sutura de âncora robusta, que é usada durante a cirurgia como uma "alça" para girar o olho para permitir que o cirurgião tenha acesso a diferentes partes do globo durante diferentes etapas do procedimento.
   Observação : etapas 3.2 e 3.3 podem ser invertidas. A sequência de colocação das suturas de permanência é de preferência do cirurgião.
4. Reflita a conjuntiva bulbar entre 10 e 2 horas (uma perimetria). Com tesoura de tenotomia, incisar a conjuntiva a 2–3 mm do limbo. Limpe a cápsula do tenon para expor a esclera nos locais para as portas de vitrectomia de 2 e 10 horas, que serão colocadas a cerca de 3 a 5 mm do limbo, dependendo da idade do animal. Use lanças cirúrgicas de celulose para hemostasia e para limpar qualquer sangue.
5. Identificar locais de esclerotomia após a reflexão da conjuntiva e cápsula de tenon usando paquímetro. Escolha locais de esclerotomia (às 2 e 10 horas com o objetivo de passar pela pars plana), para evitar os grandes vasos esclerais que podem ser proeminentes no gato. Utilizar cautério de campo úmido na esclera nos locais planejados de esclerotomia para reduzir o sangramento escleral, planejando uma região de ~3 mm no portal do instrumento (porta das 10 horas para um cirurgião destro), pois esta será ampliada após a vitrectomia para permitir a introdução da cânula de implante.
6. Suturas pré-posicionadas em padrão cruzado (fio de poliglactina 6-0 ou 7-0) sem amarrar o nó no local das esclerotomias propostas antes da colocação dos orifícios de vitrectomia.
   NOTA: Isso facilita o fechamento rápido das esclerotomias no final do procedimento. A sutura para a porta do instrumento planejada precisa ter uma mordida mais longa da esclera, pois esta será uma incisão longa.
7. Uma vez colocadas as suturas, peça ao assistente para ajudar a posicionar o globo ocular segurando as suturas de 12 horas amarrando ou usando pinça de Bishop-Harmon. Deixe o cirurgião estabilizar o globo também, usando uma pinça de Castroviejo de 0,12 mm para segurar o tecido próximo ao local da esclerotomia.
   1. Introduzir uma porta de vitrectomia de 23 G usando um trocarte através da esclera nas posições de 2 horas e 10 horas direcionada a um ângulo em direção ao nervo óptico para evitar o contato com a lente.
   2. Verifique se a porta de irrigação está no vítreo, empurrando suavemente a porta usando pinças de amarração para que a ponta possa ser visualizada no vítreo. Uma vez confirmado o posicionamento correto, fixe a linha de irrigação ao porto e posicione a linha com bandagens adesivas finas para fixá-la no lugar. Ajuste a infusão de vitrectomia do tampão BSS inicialmente em 30–35 mmHg pressionando os botões de seta (para cima ou para baixo) presentes no painel frontal da máquina de vitrectomia.
8. Deixe o assistente segurar uma lente de vitrectomia irrigadora Machemer na córnea para permitir a visualização do segmento posterior do olho durante as próximas etapas. Conecte a lente de vitrectomia irrigante a um conjunto de gotejamento fornecendo suprimento de fluido constante para acoplar a lente à córnea.
   NOTA: Outras formas de lente de vitrectomia de contato também podem ser usadas. Escureça ou apague as luzes da sala para ajudar a visualização através do microscópio cirúrgico.
9. Inserir a sonda/cortador de vitrectomia 23G (2.500 cpm) através da porta do instrumento (adjacente à mão dominante do cirurgião, ou seja, a porta das 10 horas para um cirurgião destro) e realizar uma vitrectomia parcial por agulha.
   1. Em seguida, remova completamente o vítreo da superfície da retina na região que receberá o transplante (isso é importante para o sucesso do procedimento), descolando a face vítrea da retina.
   2. Coloque a sonda de vitrectomia sobre a cabeça do nervo óptico com o orifício voltado para longe da superfície da retina e aplique vácuo mais alto para iniciar o descolamento da face vítrea.
10. Preparar cristais de triancinolona para uso intraocular. Se a suspensão de triancinolona não for especificamente para uso intravítreo, lave os cristais e, em seguida, ressuspenda em BSS.
    1. Inicialmente, filtrar a suspensão com o auxílio de um filtro de seringa de poro estéril de 0,22 μm com membrana de PES (acoplada a uma seringa de 1 mL) para prender os cristais.
    2. Em seguida, lave os cristais de triancinolona aprisionados aspirando BSS na seringa de 1mL e lavando através do filtro (os cristais permanecem presos no filtro). Isso remove os conservantes na solução. Repita a lavagem 3 vezes, após o que os cristais são ressuspensos em 1 mL BSS.
11. Introduza a agulha da seringa que segura a triancinolona através da porta do instrumento. Tenha cuidado para não tocar na lente, observando a ponta da agulha através da pupila enquanto introduz a agulha através da porta do instrumento. Injetar 0,25 a 0,5 mL de suspensão de cristal. Em seguida, insira a sonda de vitrectomia através da porta do instrumento e avance-a para perto da cabeça do nervo óptico com a porta longe da superfície da retina e use alto vácuo para ajudar a desprender a face vítrea da retina.
    NOTA: Os cristais de triancinolona aderem e, assim, destacam o vítreo restante. Remova cuidadosamente qualquer vítreo acima e próximo ao local de implantação organoide planejado (por exemplo, o fundo de tapetal central próximo à região central da área ).
12. Crie um pequeno descolamento focal de retina no local de implantação desejado usando um injetor sub-retiniano, por exemplo, injetor sub-retiniano de 23 G com uma cânula extensível de 41 G conectada a uma seringa de bloqueio Luer estéril de 250 μL estanque a gás preenchida com BSS estéril.
    1. Antes de criar a bolsa sub-retiniana, reduza a pressão de infusão para 10 mmHg para facilitar a formação da bolha.
    2. Insira o injetor através da porta do instrumento e avance-o em direção à superfície da retina. Extruda a ponta da cânula e pressione-a suavemente sobre a superfície da retina. Peça ao assistente para dar um leve empurrão rápido no êmbolo da seringa para iniciar o descolamento de retina que reduz a pressão de injeção para permitir um aumento lento do descolamento de retina até que o tamanho desejado seja alcançado (aproximadamente 100 a 200 μL de BSS são usados).
13. Se a retinotomia criada estiver em posição adequada, o que evita cortar a retina entre o local de implantação e a cabeça do nervo óptico para evitar a secção da camada de fibras nervosas derivadas do local de implantação e evitar grandes vasos sanguíneos da retina (isso também é determinado pelo desenho do estudo, no nosso caso a retina central foi escolhida), em seguida, ampliá-la levemente utilizando a cânula 41G do injetor, visando facilitar a introdução da tesoura retiniana.
14. Retire o injetor do olho e retire a porta escleral das 10 horas. Ampliar a esclerotomia neste local com uma faca de fenda/cerátomo reto de 2,85 mm orientado em direção ao nervo óptico para evitar o toque no cristalino. Manter a pressão de perfusão em 10–15 mmHg.
15. Estenda a retinotomia usando tesoura vertical vitreorretiniana de 80° com alça de aperto, evitando cortar os vasos da retina para evitar hemorragia retiniana e certifique-se de cortar a retina na borda da mancha para longe da cabeça do nervo óptico para evitar cortar as fibras nervosas que levam da retina na área de transplante para o nervo óptico. A retinotomia deve ter largura suficiente para receber os organoides.
16. Inserir o capilar de vidro pré-carregado contendo os organoides (ver passo 2.10) através da esclerotomia alargada e avançá-lo em direção ao local da retinotomia sob visualização direta.
    1. Use a ponta do capilar de vidro para abrir levemente a retinotomia para acessar a abertura na bolha sub-retiniana.
    2. Peça ao assistente para pressionar lentamente o êmbolo do injetor, enquanto observa através do microscópio, injetando os organoides na mancha sub-retiniana. A SBS deve preceder os organoides e liberar a retinotomia aberta.
    3. Empurre suavemente os organoides dentro da bolha com a ponta do capilar de vidro se eles estiverem na borda da retinotomia.
17. Segure o capilar de vidro na retinotomia por alguns segundos para tentar fechar a retinotomia e evitar que os organoides escapem para o vítreo.
18. Muito lentamente, remova o capilar de vidro do olho, evitando qualquer liberação repentina de líquido do olho para evitar o movimento de fluido dentro do olho que possa expulsar os organoides da mancha sub-retiniana.
19. Aumente lentamente a pressão de perfusão para 20–30 mmHg para ajudar a prevenir hemorragia intraocular, tomando cuidado para que o fluido de perfusão não lave diretamente na bolsa. Isso é realizado pressionando os botões de seta para cima presentes no painel frontal da máquina de vitrectomia.
20. Fechar a esclerotomia com sutura pré-colocada em padrão cruzado (poliglactina 6–0 ou 7–0). Adicione suturas simples interrompidas adicionais conforme necessário para selar a esclerotomia.
21. Peça ao assistente para remover o orifício de infusão e deixe o cirurgião amarrar rapidamente a sutura pré-colocada para selar a esclerotomia e evitar a perda da pressão intraocular.
22. Fechar a incisão conjuntival (peritomia) com poliglactina 6–0 ou 7–0 em padrão simples e contínuo.
23. Faça uma imagem do fundo de olho (por exemplo, usando uma câmera de fundo de olho RetCam II, Clarity ou similar) e registre a posição imediata dos organoides dentro do espaço sub-retiniano.
24. Repreparar a superfície ocular após exames de imagem usando solução de iodopovidona a 0,2% com o auxílio de aplicadores de ponta de algodão e bolas de algodão. Remova as três suturas de estada e o espéculo da tampa.
25. Fechar a cantotomia lateral com fio de poliglactina 6-0. Coloque uma única sutura enterrada seguida de uma figura de 8 suturas de pele para reformar o canto lateral e, em seguida, use suturas simples de pele interrompida para fechar o resto da ferida.
26. Após o término do procedimento cirúrgico, administrar uma injeção subconjuntival de uma combinação de esteroides e antibióticos (2 mg de acetato de metilprednisolona, 0,1 mg de dexametasona e 1 mg de gentamicina). Coloque um lubrificante oftálmico (lágrimas artificiais) na córnea.
27. Recupere o animal da anestesia e monitore de perto durante a recuperação quaisquer sinais de dor que exijam tratamento adicional, como blefaroespasmo acentuado, relutância grave em ser manipulado, letargia ou diminuição do apetite e aumento da frequência respiratória e cardíaca. Fornecer analgesia pós-operatória conforme necessário e monitorar de perto qualquer desconforto.
    NOTA: Somente pessoal devidamente treinado deve ser responsável por anestesiar e monitorar os pacientes felinos antes, durante e pós-cirurgia. Siga as recomendações do comitê local de ética animal para cuidados pós-operatórios.

4. Procedimentos pós-implante, tratamento pós-operatório e avaliação

1. Continue a tratar com medicamentos imunossupressores orais (1 mg/kg de prednisolona e 2 mg/kg de ciclosporina por via oral duas vezes ao dia) para ajudar a controlar a inflamação e a rejeição dos organoides. Fornecer cobertura antibiótica sistêmica (por exemplo, doxiciclina oral 5 mg/kg duas vezes ao dia – esse antibiótico foi selecionado devido ao risco de infecção micoplasmática oportunista em animais imunossuprimidos).
2. Realizar exames oftalmológicos regulares para monitorar a inflamação ou o desenvolvimento de eventos adversos. Monitorar a mancha retiniana para achatamento, que ocorre nos primeiros dias após a cirurgia, apesar da grande retinotomia necessária para que os organoides sejam injetados no espaço sub-retiniano. Registrar imagens de fundo de olho em cada exame para registrar a posição e aparência dos organoides transplantados.
3. Imagem dos animais sob anestesia geral por oftalmoscopia confocal a laser de varredura (cSLO) e tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT)^5,31 durante o período de monitoramento e antes do término do experimento.
4. Eutanasiar humanamente os animais no final do experimento usando um método aprovado pela AVMA, por exemplo, administração intravenosa de 85 mg/kg de pentobarbital. Após a sedação, colocar um cateter intravenoso para administração do pentobarbital para minimizar o estresse. Confirme a morte por cessação dos batimentos cardíacos e faça uma incisão no tórax para criar um pneumotórax.
5. Remova os olhos através de uma abordagem transconjuntival padrão e corrija conforme necessário. Para imunohistoquímica (IHQ), imergir imediatamente os olhos em solução de paraformaldeído a 4% após injeção de 0,3 mL da solução fixadora no segmento posterior através de 3 fendas feitas através de pars plana com lâmina Parker 11 (~3-4 mm do limbo).
6. Dissecar as oculares após 3,5 h de fixação a 4 °C. Remova o vítreo residual, certificando-se de preservar a retina e os organoides intactos. Coloque novamente no fixador por mais 30 min a 4 °C e, em seguida, lave os óculos 3 vezes cada por 10 min em PBS. Transfira a ocular para 15% de sacarose por 2 h, depois para 30% de sacarose por mais 2 h.
7. Enxaguar a ocular duas vezes com PBS e incorporar em meio OCT (composto de temperatura de corte ideal) e congelar rapidamente e, em seguida, armazenar a -80 °C até a secção para histologia e imunoquímica.
8. Selecionar anticorpos para IHQ com base no protocolo e objetivos do estudo.

Resultados

Este procedimento permite a implantação bem-sucedida e reprodutível de organoides da retina derivados de hPSC no espaço sub-retiniano de um modelo animal de olho grande (demonstrado aqui usando 2 exemplos: gatos selvagens com fotorreceptores (RPs) saudáveis e gatos Crx^{Rdy/+ com RPs} e retina degeneradas). Usando as etapas indicadas na Figura 1 , prepare e carregue os organoides da retina derivados da hPSC na cânula de vidro borossilicato do dispositivo de in...

Discussão

A implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides da retina) no espaço sub-retiniano é uma abordagem experimental promissora para restaurar a visão para doenças degenerativas retinianas em estágio avançado causadas por morte celular PR (cegueira profunda ou terminal). A abordagem apresentada baseia-se em uma terapia experimental previamente desenvolvida e testada com sucesso, baseada no enxerto sub-retiniano de um pedaço de tecido retiniano fetal humano^23,24,25

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane	Cameo	NA	can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula	DORC	1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe	Hamilton	NA	can be found through various suppliers
6-0 Silk suture	Ethicon	707G
6-0/7-0 polyglactin suture	Ethicon	J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)	Henry Schein Animal Health	NA	can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine	Novartis	NA	can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)	Vetone	NA	can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL	Cipla	NA	can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution)	Vortech	NA	can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL	Hospira	NA	can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing	World Precision Instruments	TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL	Pfizer	NA	can be found through various suppliers
Microscope	Zeiss	NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac Size 23	Natus	NA	can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution	EMS	15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution	Akorn	NA	can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL	Akorn	NA	can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)	Zoetis	NA	can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera	Clarity Medical Systems	NA	can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)	Bristol -Myers Squibb Company	NA	can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution	Akorn	NA	can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port	Alcon	Accurus systems
Vitrectomy machine	Alcon	Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle	Frimen	FT170206T