Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Resumo

Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo causado pela perda de neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta. Anormalidades na marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos são comuns em pacientes com DP e aparecem no início do curso da doença. Assim, a quantificação de padrões motores em modelos animais de DP será importante para a caracterização fenotípica durante o curso da doença e no tratamento terapêutico. A maioria dos casos de DP é idiopática; no entanto, a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais. Enquanto os ratos são resistentes à neurodegeneração após a perda de Pink1 e Parkin (deleção única e combinada), em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e ao comprometimento motor. Aqui, relatamos a utilidade da imagem FTIR para descobrir alterações na marcha em ratos machos jovens (2 meses de idade) com perda combinada de Pink1 e Parkin antes do desenvolvimento de anormalidade motora visualmente aparente grosseira à medida que esses ratos envelhecem (observada aos 4-6 meses), caracterizada pelo arrasto dos membros posteriores, conforme relatado anteriormente em ratos Pink1 knockout (KO).

Introdução

A DP, o distúrbio do movimento neurodegenerativo relacionado à idade mais comum, é causada pela perda de neurônios DA na substância negra pars compacta. Essa perda de neurônios DA nigral e as entradas de DA no estriado levam aos comprometimentos da função motora observados em pacientes com DP ^1,2. As características motoras definidoras de pacientes com DP, conhecidas coletivamente como parkinsonismo, incluem rigidez, tremor de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e micrografia³. Além disso, os distúrbios da marcha, comuns em pacientes com DP, aparecem precocemente no curso da doença ^1,4,5. Embora certos estilos de vida sejam sugeridos para ajudar a retardar a progressão da DP, como alimentação saudável e exercícios regulares, atualmente não há cura para a DP, apenas medicamentos para gerenciar os sintomas. Isso deixa espaço para a necessidade de uma investigação mais aprofundada na esperança de melhorar a terapêutica. Assim, a caracterização do padrão de marcha em modelos animais de DP é uma ferramenta crucial para caracterizar a relevância do modelo, bem como como os tratamentos terapêuticos voltados para o controle da DP estão prevenindo ou melhorando os comprometimentos motores.

Existem vários modelos animais de DP que têm sido utilizados para testar tratamentos terapêuticos, no entanto, cada um tem suas limitações. Por exemplo, modelos animais tratados com a neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) produziram uma grande riqueza de informações sobre processos importantes para a perda do neurônio DA nigral e subsequentes adaptações estriatais, e apontaram para o papel das mitocôndrias na patogênese da DP; no entanto, o contexto patogênico do modelo MPTP é de natureza tóxica e não neurodegenerativa, como na DP humana⁶. Modelos quimicamente induzíveis adicionais incluem 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e rotenona. A 6-OHDA foi o primeiro agente usado para induzir a DP pelo acúmulo seletivo da droga nos neurônios DA, o que eventualmente mata os neurônios e leva a sintomas semelhantes aos da DP. Este modelo foi usado pela primeira vez para o rastreamento da depleção de DA, examinando o comportamento em resposta à anfetamina e apomorfina⁷. Esse método de indução da DP tem se mostrado útil para o rastreamento de agentes farmacológicos que impactam a AD e seus receptores⁸. Embora o modelo 6-OHDA seja um ótimo modelo para rastrear déficits motores quantificáveis, esse modelo não mostra como a perda gradual de neurônios e a formação de corpos de Lewy afetam o animal. O outro método de indução, a rotenona, demonstrou ter degeneração progressiva dos neurônios nigrostriatais com a perda de tirosina hidroxilase e transportador DA, permitindo um melhor modelo para rastrear a perda de neurônios ao longo do tempo⁹. Os ratos tratados com rotenona apresentaram bradicinesia, instabilidade postural e marcha instável¹⁰. No entanto, esse método tem se mostrado amplamente variável entre diferentes cepas de ratos, o que tem provocado questionamentos se a rotenona é ou não um modelo confiável de DP^11,12,13. Embora a análise da marcha tenha demonstrado ser impactada pela indução de DP em ratos, até o momento, os modelos de ratos com DP geneticamente induzidos não foram prontamente usados para análise de marcha andando livremente por uma pista.

Uma maneira de analisar o comprometimento motor em roedores que caminham livremente é a análise cinemática da marcha, que pode ser realizada utilizando imagens FTIR. Esse método estabelecido utiliza um sensor óptico de toque baseado em FTIR, que registra e rastreia as pegadas dos roedores à medida que eles se movem pela pista^14,15,16. Em comparação com outros métodos, o FTIR não depende de nenhum marcador no corpo do animal que possa interferir nas impressões das patas. A geração dos dados de vídeo produz impressões digitais de todas as quatro partes que podem ser combinadas para criar um padrão de caminhada dinâmico e reprodutível para vários modelos de roedores. O princípio da análise de marcha baseada em imagens é pegar cada pata individual e medir a área de contato ao longo do tempo enquanto o roedor caminha pela pista. Cada postura é representada por um aumento na área da pata (na fase de frenagem) e uma diminuição na área da pata (na fase de propulsão). Isso é prosseguido pela fase de balanço, que é quando não há sinal de pata detectado. Após a avaliação do vídeo, são gerados vários parâmetros que podem ser usados para comparar o tipo selvagem (WT) versus o modelo PD. Alguns exemplos dos parâmetros são o comprimento do passo (distância que a pata cobre em um passo), a duração do balanço (duração do tempo em que a pata não está em contato com a pista), a velocidade do balanço (comprimento do passo em função da duração do balanço) e o padrão do passo (passos diagonais, degraus laterais ou passos de cinto).

Para demonstrar a utilidade do FTIR para descobrir mudanças precoces no padrão de marcha em ratos, usamos um modelo genético de DP em ratos. Enquanto a maioria dos casos de DP são idiopáticos; a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial¹⁷, que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais¹⁸. Infelizmente, camundongos são resistentes à neurodegeneração após a perda dessas proteínas (únicas e combinadas)19,20,21. Em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e a deficiências motoras²², mas sem penetrância completa. Portanto, geramos um modelo combinado de ratos Pink1/Parkin double knockout (DKO), que exibe o fenótipo de arrasto do membro posterior visualmente aparente relatado em ratos machos Pink1 KO²², mas agora em uma taxa mais alta: 100% versus 30-50% dos machos entre 4-6 meses.

Embora esse método funcione bem para analisar déficits motores em camundongos¹⁴, as especificações do sistema de marcha de imagem FTIR para acomodar o tamanho e o peso dos ratos anteriormente não estavam disponíveis comercialmente. Aqui explicamos como construir o RatWalker, um sistema de imagem de marcha FTIR modificado modelado após o MouseWalker¹⁴, exceto adaptado para o tamanho e peso dos ratos. Este sistema utiliza um efeito óptico, FTIR, para fornecer um método para visualizar e, posteriormente, registrar pegadas de animais para análise. O contato do pé de um animal com o guia de ondas ópticas (plataforma) causa interrupção no caminho da luz, resultando em um efeito de dispersão visível, que é capturado usando videografia doméstica de alta velocidade e processamento usando software de código aberto. Este estudo demonstra o poder da imagem FTIR no estudo de alterações na marcha em modelos genéticos de DP em ratos. Por exemplo, enquanto alterações motoras visualmente aparentes evidentes (ou seja, arrasto dos membros posteriores) são observadas em ratos machos com DKO aos 4 meses no mínimo, usando FTIR somos capazes de descobrir anormalidades de porta em ratos machos DKO aos 2 meses de idade.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Nebraska (IACUC).

1. Aparelho de marcha

NOTA: Modelado a partir do MouseWalker¹⁴, o RatWalker foi projetado com dimensões proporcionais à diferença no comprimento do passo entre ratos e camundongos. Consiste em uma luz de fundo de iluminação lateral, gabinete de passarela, passarela de guia de onda óptica, espelho e câmera (Figura S1). Tiras de LED, orientadas em uma posição escalonada, foram usadas em cada lado da passarela e guias de onda de luz de fundo para acomodar o material extra. Os materiais necessários para a construção do aparelho de marcha modificado podem ser encontrados na Tabela S1.

1. Use uma luz de fundo (Figura S2) para criar uma silhueta do animal que é utilizada pelo software para atribuir posição, direção de movimento e qualidades morfométricas. A construção é composta por um painel em camadas de um difusor de acrílico, guia de onda óptico, refletor e fitas de luz LED montadas dentro de uma estrutura de alumínio de estoque (Tabela S1).
2. Use um compartimento de passarela (Figura S3) para guiar o animal ao longo da plataforma e direcioná-lo para a gaiola doméstica. A construção consiste em chapas de acrílico transparente soldadas com solvente com diclorometano (Tabela S2).
3. Use a passarela (Figura S4) para fornecer o meio para gerar pegadas iluminadas. A passarela é construída em acrílico transparente, que é iluminado lateralmente com fitas de LED e alojado em ângulo de alumínio (Tabela S3).
4. Coloque um espelho (Figura S5) diretamente sob a passarela em um ângulo de 45 graus para refletir a parte inferior da passarela para videografia. É construído a partir de um espelho de vidro de 1/4" de espessura suportado por acrílico e suportes angulados dispostos em uma linha (Tabela S4).
5. Realize videografia usando uma câmera de ação de alta velocidade montada em tripé, de qualidade doméstica.

2. Configuração do equipamento

1. Alinhe a luz de fundo, a passarela e o espelho de acordo com a Figura S1, em cima de uma bancada, bancada de trabalho ou carrinho estável. Certifique-se de que cada componente esteja centralizado em relação à passarela.
2. Usando um nível, certifique-se de que os componentes são horizontalmente plumb.
3. Coloque o recinto da passarela em cima da passarela.
4. Limpe todas as áreas de superfície de contato com etanol a 70%. Certifique-se de usar uma toalha não abrasiva para evitar arranhões na passarela.
5. Monte a câmera de alta velocidade em um tripé de 57 polegadas e coloque-a na linha média do espelho, espaçada o suficiente para capturar toda a passarela dentro do campo de visão. No menu de configurações de vídeo, verifique se a câmera de alta velocidade está configurada para aquisição linear no modo 1080p a 120 quadros por segundo (fps) com qualquer tipo de ajuste automático ou otimizações desativadas.
6. Conecte e ligue as luzes da fita de LED para a luz de fundo e a passarela. Pode ser necessário escurecer a luz de fundo para reduzir a captura de fundo.

3. Aclimatação Animal

NOTA: Uma semana antes do primeiro experimento, execute os animais através do aparelho de marcha modificado.

1. Posicione uma gaiola doméstica no terminal da passarela.
2. Com o recinto instalado e as luzes apagadas, coloque o rato no final da passarela em frente à gaiola doméstica e permita que ele atravesse a passarela de maneira não forçada.
3. Passe cada rato através do aparelho de marcha modificado várias vezes, até que eles possam atravessar suavemente toda a passarela.
4. Repita o processo dois dias antes do experimento.

4. Procedimento de marcha

1. Coloque uma gaiola caseira no final da passarela antes do início de cada corrida para servir como uma sugestão positiva para o rato atravessar a passarela.
2. Desligue as luzes da sala, ligue a câmera e comece a gravar vários segundos antes que o rato seja colocado na plataforma.
   NOTA: Certifique-se de usar um cartão de memória que é oficialmente recomendado pelo fabricante da câmera. Um cartão de memória não listado ainda pode funcionar, mas não é garantido para capturar na suposta taxa de quadros.
3. Com o recinto instalado, coloque o rato no final da passarela em frente à gaiola doméstica e permita que ele atravesse a passarela de maneira não forçada.
4. Pare de registrar assim que o animal chegar ao término da passarela.
5. Limpe a passarela usando etanol a 70% e uma toalha não abrasiva entre as corridas e depois que um animal urinar ou defecar, em seguida, permita que o etanol evapore antes de introduzir outro animal.
6. Execute os ratos pela passarela um total de 7 vezes durante cada período de observação, tomando as três primeiras corridas que pontuam como passagem para análise.
7. Marque uma corrida como passageira se o animal der quatro ou mais passos consecutivos na direção da gaiola doméstica sem interrupção devido a cuidados com a limpeza, pausa ou movimentos errantes.
   NOTA: É uma boa prática registar a massa dos animais antes de cada ronda de medidas. Para o nosso estudo, WT (n = 7) e DKO (n = 8) pesaram 200,3 ± 21,67 g e 296,6 ± 3,85 g, respectivamente (p = 0,004, teste t não pareado com correção de Welch). Não vemos um problema com ratos de qualquer idade ou tamanho.

5. Pré-processamento de vídeo

NOTA: Os vídeos capturados pela câmera de alta velocidade são renderizados em formato mp4 a 120 fps e uma resolução de 1080p. Para aliviar a carga sobre o software analítico a jusante, primeiro corte imagens desnecessárias e retire o áudio de cada vídeo usando o software LosslessCut (versão 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut) e, em seguida, converta o fluxo de vídeo mp4 em uma sequência de imagens png usando o software de código aberto FFmpeg (versão 4.2, http://ffmpeg.org/). Nota: outros formatos sem perdas, como tiff, podem ser utilizados no lugar do png.

1. Crie um diretório para os vídeos em um PC com o Windows 7 ou superior e, em seguida, transfira os vídeos do dispositivo de armazenamento da câmera de alta velocidade para o diretório recém-criado. Além disso, copie ffmpeg.exe para o mesmo local.
2. No LosslessCut, arraste os vídeos para a interface para abrir. Descartar o áudio, definir os pontos de corte inicial e final para incluir apenas a parte analiticamente relevante do vídeo, definir o formato de quadro de captura como png e exportar. Depois que o vídeo for exportado, renomeie o arquivo de vídeo usando qualquer convenção de nomenclatura seguida por "_trimmed".
3. Para converter em lote os vídeos em sequências de imagens, abra um prompt de comando, defina o diretório de trabalho para o local dos vídeos com "cd [caminho para o diretório]" e execute os seguintes comandos:
   para %i em (*) do mkdir "%~ni_cropped"
   para %i em (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
   para /f "tokens=1 delims=." %a em ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. Após a conclusão do processo em lote, abra cada sequência de imagens no ImageJ Fiji²³ e corte a sequência para a região de interesse (ROI), abrangendo a área do chão dentro da qual o rato é observado.
5. Para reduzir o fundo da iluminação da passarela, aumente o equilíbrio de cores mínimo do canal ciano para 76.
6. Salve como sequência de imagens e altere o sufixo "_trimmed" para "_cropped", salvando os arquivos em sua respectiva pasta "_cropped".

6. Processamento da marcha

NOTA: Os dados da marcha são processados e quantificados usando o software disponível gratuitamente, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴.

1. Descompacte e instale o software MouseWalker em um PC executando um ambiente Windows de 64 bits com o Microsoft Excel instalado.
2. Depois de iniciar o MouseWalker.exe, execute uma calibração de escala inicial para cada conjunto de execuções. Carregue uma sequência de imagens e, usando pontos de referência ou uma régua capturada no vídeo, meça dois pontos de distância conhecida. Calcule o número de pixels por centímetro no quadro de vídeo e insira esse valor na seção de parâmetros do formulário de configurações, juntamente com a taxa de quadros de aquisição de vídeo.
3. Da mesma forma, meça a cabeça, a cauda e os pés do rato para determinar o comprimento da cabeça, a largura e a área máximas da cauda, a área mínima e máxima do pé e outros recursos necessários para preencher a seção de parâmetros de rastreamento do formulário de configurações do MouseWalker. Consulte http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ para obter o manual do usuário e outra documentação.
4. Para obter os valores de área corporal, abra a mesma sequência de imagens no ImageJ, desenhe uma seleção descrevendo o rato e execute uma contagem de pixels de região de interesse (ROI).
5. Parâmetros e configurações usados para esta publicação (Figura S6).
   NOTA: Os parâmetros são fornecidos para ilustração e dependem da escala do vídeo, do hardware de aquisição e das condições. A calibração e o ajuste do software são necessários sempre que a câmera ou o equipamento é reposicionado. A captura de um dispositivo de medição dentro da aquisição melhora a precisão e facilita a calibração.
6. Após a calibração, carregue cada sequência de imagens. A seleção automática iniciará a atribuição autônoma de pegadas.
7. Percorra cada quadro da sequência, corrigindo manualmente as pegadas atribuídas por erros. Salve quando esta etapa for concluída.
8. Por fim, selecione avaliar para processar a posição da pegada e os dados de pressão. Uma série de gráficos, imagens e uma planilha com métricas quantitativas de marcha serão exportadas para uma pasta de resultados.

7. Análise dos dados

1. Use a planilha exportada no final de cada avaliação que contém dados quantitativos de marcha para cada execução. Concatenar os dados de cada corrida e a média por rato. Plote os dados médios e teste a significância usando o GraphPad Prism versão 7.0a.

Resultados

Manutenção da Colônia de Ratos
A geração e caracterização de ratos Pink1 e Parkin single KO já foram descritas anteriormente²². Os ratos Pink1 e Parkin single KO foram obtidos do SAGE Labs (e agora disponíveis no Envigo). Ratos DKO foram gerados pelo cruzamento de ratos Pink1-/- com ratos Parkin-/- para obtenção de ratos Pink1+/-/Parkin^+/- que foram cruzados para obtenção de ratos Pink1-/-^/Parkin-^/

Discussão

Distúrbios da marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos, são uma característica definidora da DP e ocorrem precocemente durante o curso da doença ^1,5. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para observar e registrar passos para análise de marcha em modelos de roedores de DP, com técnicas manuais para quantificar a posição do pisar levando a abordagens automatizadas mai...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1