파킨슨병의 유전적 쥐 모델에서 보행 분석을 위한 RatWalker 시스템 적용

요약

여기에서는 쥐의 증가된 크기와 무게를 수용하기 위해 MouseWalker 장치를 재설계하여 구축된 RatWalker 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 좌절된 전체 내부 반사(FTIR), 고속 비디오 캡처 및 오픈 액세스 분석 소프트웨어를 사용하여 보행 매개변수를 추적하고 정량화합니다.

초록

파킨슨 병 (PD)은 흑질의 도파민 성 (DA) 뉴런의 손실로 인한 진행성 신경 퇴행성 장애입니다. 팔 스윙 감소, 느린 보행 속도 및 짧은 걸음을 포함한 보행 이상은 PD 환자에게 흔하며 질병 초기에 나타납니다. 따라서, PD의 동물 모델에서 운동 패턴의 정량화는 질병 경과 동안 및 치료 치료시 표현형 특성화에 중요 할 것이다. PD의 대부분의 경우는 특발성입니다. 그러나 PD의 유전 적 형태의 확인은 동물 모델을 만드는 데 활용할 수있는 미토콘드리아 품질 관리에 관여하는 두 가지 단백질 인 Pink1 및 Parkin의 기능 상실 돌연변이와 같은 유전자 돌연변이 및 변이를 발견했습니다. 마우스는 Pink1 및 Parkin (단일 및 복합 결실)의 손실시 신경 퇴행에 내성이있는 반면, 쥐에서는 Parkin 결핍이 아닌 Pink1이 흑질 DA 뉴런 손실 및 운동 장애를 유발합니다. 여기에서, 우리는 Pink1 녹아웃 (KO) 쥐에서 이전에보고 된 바와 같이 뒷다리 끌림을 특징으로하는 Pink1과 Parkin의 결합 손실이 있기 전에 Pink1과 Parkin의 결합 손실이있는 자유롭게 걷는 어린 (2 개월) 수컷 쥐의 보행 변화를 밝히기위한 FTIR 이미징의 유용성을보고합니다 (4-6 개월에 관찰).

서문

가장 흔한 연령 관련 신경 퇴행성 운동 장애 인 PD는 흑질에서 DA 뉴런의 손실로 인해 발생합니다. 이러한 nigral DA 뉴런의 손실과 선조체로의 DA 입력은 PD ^1,2 환자에서 관찰된 운동 기능 장애로 이어집니다. 파킨슨증으로 통칭되는 PD 환자의 정의 운동 특성에는 강직, 휴식 떨림, 서맥증, 자세 불안정 및 현미경 사진이^{포함됩니다3.} 또한, PD 환자에서 흔히 볼 수 있는 보행 장애는 질병 ^1,4,5의 진행 초기에 나타납니다. 건강한 식습관과 규칙적인 운동과 같이 PD의 진행을 늦추는 데 도움이 되는 특정 생활 방식이 제안되지만 현재 PD에 대한 치료법은 없으며 증상을 관리하는 약물만 있습니다. 이것은 개선 된 치료법을 희망하는 추가 조사의 필요성을 남깁니다. 따라서 PD 동물 모델에서 보행 패턴의 특성화는 모델의 관련성뿐만 아니라 PD를 제어하기위한 치료 치료가 운동 장애를 예방하거나 개선하는 방법을 특성화하는 중요한 도구입니다.

치료 치료를 테스트하는 데 사용 된 다양한 PD 동물 모델이 있지만 각각에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 신경독 1- 메틸 -4- 페닐 -1,2,3,6- 테트라 하이드로 피리딘 (MPTP)으로 처리 된 동물 모델은 니그랄 DA 뉴런 손실 및 후속 선조체 적응에 중요한 과정에 대한 풍부한 정보를 산출했으며, PD 발병 기전에서 미토콘드리아의 역할을 지적했다. 그러나, MPTP 모델의 병리학적 배경은 인간^PD6에서와 같이 신경변성 과정이라기보다는 독성인 성질을 갖는다. 추가의 화학적 유도성 모델에는 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 및 로테논이 포함됩니다. 6-OHDA는 DA 뉴런에 약물을 선택적으로 축적하여 PD를 유도하기 위해 사용된 최초의 제제였으며, 이는 결국 뉴런을 죽이고 PD와 유사한 증상을 유발합니다. 이 모델은 암페타민과 아포 모르핀⁷에 대한 반응의 행동을 조사하여 DA 고갈을 추적하는 데 처음 사용되었습니다. PD 유도의이 방법은 DA 및 그의 수용체⁸에 영향을 미치는 약리학 적 제제의 스크리닝에 유용한 것으로 입증되었다. 6-OHDA 모델은 정량화 가능한 운동 결함을 추적하기위한 훌륭한 모델이지만,이 모델은 뉴런의 점진적인 손실과 Lewy 신체의 형성이 동물에게 어떤 영향을 미치는지 보여주지 않습니다. 유도의 다른 방법인 로테논은 티로신 하이드록실라제 및 DA 수송체의 손실과 함께 흑질선조체 뉴런의 점진적인 퇴행을 갖는 것으로 나타났으며,^{이는 시간 경과}에 따른 뉴런의 손실을 추적하는 더 나은 모델을 허용합니다9. 로테논 처리된 래트는 서맥운동증, 자세 불안정, 및 불안정한 보행¹⁰을 보였다. 그러나,이 방법은 쥐의 상이한 균주간에 광범위하게 가변적 인 것으로 밝혀졌으며, 이는 로테 논이 신뢰할 수있는 PD 모델^11,12,13인지 여부에 대한 의문을 불러 일으켰다. 보행 분석은 쥐에서 PD의 유도에 의해 영향을받는 것으로 나타 났지만, 현재까지 유 전적으로 유도 된 PD 쥐 모델은 활주로를 자유롭게 걸어 보행 분석에 쉽게 사용되지 않았습니다.

자유롭게 걷는 설치류의 운동 장애를 분석하는 한 가지 방법은 FTIR 이미징을 활용하여 수행 할 수있는 운동 학적 보행 분석입니다. 이 확립 된 방법은 FTIR을 기반으로 한 광학 터치 센서를 사용하며, 설치류가 활주로^(14,15,16)를 따라 이동할 때 발자국을 기록하고 추적합니다. 다른 방법과 비교하여 FTIR은 발자국을 방해 할 수있는 동물 신체의 마커에 의존하지 않습니다. 비디오 데이터의 생성은 다양한 설치류 모델에 대한 역동적이고 재현 가능한 보행 패턴을 생성하기 위해 결합될 수 있는 4개의 팔다리 모두의 디지털 발자국을 생성합니다. 이미징 기반 보행 분석의 원리는 설치류가 활주로를 걸어 내려갈 때 각 개별 발을 잡고 시간이 지남에 따라 접촉 면적을 측정하는 것입니다. 각 자세는 발 면적의 증가 (제동 단계에서)와 발바닥 면적의 감소 (추진 단계에서)로 표시됩니다. 이것은 발바닥 신호가 감지되지 않는 스윙 단계에 의해 진행됩니다. 비디오 평가 후 야생형(WT) 대 PD 모델을 비교하는 데 사용할 수 있는 여러 매개변수가 생성됩니다. 매개변수의 몇 가지 예는 스텝 길이(발이 한 스텝에서 커버하는 거리), 스윙 지속시간(발이 활주로와 접촉하지 않는 시간), 스윙 속도(스윙 지속시간의 함수로서의 스텝 길이) 및 스텝 패턴(대각선 스텝, 측면 스텝 또는 거들 스텝)입니다.

쥐의 초기 보행 패턴 변화를 밝히기위한 FTIR의 유용성을 입증하기 위해 PD의 유전 적 쥐 모델을 사용했습니다. PD의 대부분의 경우는 특발성입니다. PD의 유전적 형태의 확인은 동물 모델¹⁸을 만드는 데 활용될 수 있는 미토콘드리아 품질 관리¹⁷에 관여하는 두 단백질인 Pink1 및 Parkin의 기능 상실 돌연변이와 같은 유전자 돌연변이 및 변이체를 밝혀냈습니다. 불행히도, 마우스는 이러한 단백질 (단일 및 조합)의 손실시 신경 퇴행에 내성이 있습니다 19,20,21. 쥐에서 Pink1은 파킨 결핍이 아니지만 흑질질 DA 뉴런 손실 및 운동 장애²²를 유발하지만 완전한 침투는 없습니다. 따라서 우리는 결합 된 Pink1 / Parkin 이중 녹아웃 (DKO) 쥐 모델을 생성했는데, 이는 수컷 Pink1 KO 쥐²²에서보고 된 명백한 시각적으로 명백한 뒷다리 끌림 표현형을 표시하지만 지금은 더 높은 비율로 나타납니다 : 100-30 개월 사이에 남성의 50-4 % 대 6 %.

이 방법은 마우스¹⁴의 운동 결손을 분석하는 데 효과적이지만, 쥐의 크기와 무게를 수용하기위한 FTIR 이미징 보행 시스템 사양은 이전에는 비상업적으로 사용할 수 없었습니다. 여기에서는 쥐의 크기와 무게에 맞게 조정된 것을 제외하고 MouseWalker¹⁴를 모델로 한 수정된 FTIR 보행 이미징 시스템인 RatWalker를 구축하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 광학 효과 FTIR을 사용하여 분석을 위해 동물 발자국을 시각화하고 이후에 기록하는 방법을 제공합니다. 동물의 발이 광 도파관(플랫폼)과 접촉하면 광 경로가 중단되어 가시적인 산란 효과가 발생하며, 이는 국내 등급의 고속 비디오 촬영 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용한 처리를 사용하여 캡처됩니다. 이 연구는 PD의 유전 적 쥐 모델에서 보행 변화를 연구 할 때 FTIR 영상의 힘을 보여줍니다. 예를 들어, 빠르면 4 개월에 수컷 DKO 쥐에서 명백한 시각적 운동 변화 (즉, 뒷다리 끌림)가 관찰되는 반면, FTIR을 사용하면 생후 2 개월에 수컷 DKO 쥐의 게이트 이상을 발견 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 네브래스카 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 보행 장치

참고: MouseWalker¹⁴에서 모델링된 RatWalker는 쥐와 생쥐 사이의 스텝 길이의 차이에 비례하여 치수로 설계되었습니다. 측면 조명 백라이트, 통로 인클로저, 광 도파관 통로, 거울 및 카메라로 구성됩니다(그림 S1). 엇갈린 위치에 있는 LED 스트립은 추가 재료를 수용하기 위해 통로와 백라이트 도파관의 양쪽에 사용되었습니다. 수정 된 보행 장치를 만드는 데 필요한 재료는 표 S1에서 찾을 수 있습니다.

1. 백라이트 (그림 S2)를 사용하여 소프트웨어에서 위치, 이동 방향 및 형태 측정 품질을 지정하는 데 사용되는 동물의 실루엣을 만듭니다. 구조는 스톡 알루미늄 프레임 내에 조립된 아크릴 디퓨저, 광 도파관, 반사경 및 LED 조명 스트립의 적층 패널로 구성됩니다(표 S1).
2. 통로 인클로저 (그림 S3)를 사용하여 플랫폼을 따라 동물을 안내하고 동물을 홈 케이지로 안내합니다. 구조는 디클로로 메탄으로 용접 된 투명 아크릴 시트 용매로 구성됩니다 (표 S2).
3. 통로 (그림 S4)를 사용하여 조명 발자국을 생성하는 매체를 제공하십시오. 통로는 투명 아크릴로 구성되어 있으며 스트립 LED로 측면 조명이 켜지고 알루미늄 각도로 수용됩니다 (표 S3).
4. 비디오 촬영을 위해 통로의 아래쪽을 반사하도록 45도 각도로 보도 바로 아래에 거울(그림 S5)을 놓습니다. 아크릴로 지지되는 1/4" 두께의 유리 거울과 일렬로 배열된 각진 브래킷으로 구성됩니다(표 S4).
5. 삼각대에 장착된 국산 품질의 고속 액션 카메라를 사용하여 비디오 촬영을 수행합니다.

2. 장비 설정

1. 백라이트, 통로 및 거울을 그림 S1에 따라 조리대, 작업대 또는 안정적인 카트 위에 정렬하십시오. 각 구성 요소가 통로를 기준으로 중앙에 있는지 확인하십시오.
2. 레벨을 사용하여 구성요소가 수평으로 수직인지 확인합니다.
3. 통로 인클로저를 통로 위에 놓습니다.
4. 모든 접촉 표면을 70 % 에탄올로 청소하십시오. 통로가 긁히지 않도록 비연마성 수건을 사용하십시오.
5. 고속 카메라를 57인치 삼각대에 장착하고 시야 내부의 전체 통로를 캡처할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어진 거울의 중간 라인에 배치합니다. 비디오 설정 메뉴에서 고속 카메라가 모든 유형의 자동 조정 또는 최적화가 꺼진 상태에서 1080p 모드의 120fps(초당 프레임)로 선형 획득으로 설정되어 있는지 확인합니다.
6. 백라이트와 통로용 LED 스트립 조명을 연결하고 켭니다. 배경 캡처를 줄이기 위해 백라이트를 어둡게 해야 할 수도 있습니다.

3. 동물 순응

참고: 첫 번째 실험 1주일 전에 수정된 보행 장치를 통해 동물을 실행합니다.

1. 산책로의 종점에 홈 케이지를 배치하십시오.
2. 인클로저를 설치하고 조명을 끈 상태에서 쥐를 홈 케이지 맞은 편 통로 끝에 놓고 강제로 통로를 가로 질러 걸을 수 있도록합니다.
3. 수정 된 보행 장치를 통해 각 쥐를 여러 번 실행하여 전체 통로를 부드럽게 통과 할 수 있습니다.
4. 실험 이틀 전에 이 과정을 반복한다.

4. 보행 절차

1. 각 달리기가 시작되기 전에 산책로 끝에 홈 케이지를 배치하여 쥐가 산책로를 횡단하는 긍정적 인 신호 역할을합니다.
2. 방 조명을 끄고 카메라의 전원을 켜고 쥐가 플랫폼에 놓이기 몇 초 전에 녹화를 시작하십시오.
   참고: 카메라 제조업체에서 공식적으로 권장하는 메모리 카드를 사용하십시오. 목록에 없는 메모리 카드는 여전히 작동할 수 있지만 의도된 프레임 속도로 캡처하지 않을 수 있습니다.
3. 인클로저가 설치된 상태에서 쥐를 홈 케이지 맞은 편 통로 끝에 놓고 강제로 통로를 가로 질러 걸을 수 있도록합니다.
4. 동물이 통로의 종점에 도달하면 기록을 중지하십시오.
5. 달리기 사이와 동물이 소변을 보거나 배변 한 후에 70 % 에탄올과 비 마모성 수건을 사용하여 산책로를 청소 한 다음 다른 동물을 소개하기 전에 에탄올이 증발하도록하십시오.
6. 각 관찰 기간 동안 총 7 번 산책로를 통해 쥐를 달리고, 처음 세 번의 실행은 분석을 위해 통과 한 것으로 간주합니다.
7. 동물이 그루밍, 일시 중지 또는 잘못된 움직임으로 인한 중단 없이 홈 케이지 방향으로 4개 이상 연속 걸음을 내딛는 경우 달리기를 통과로 점수화합니다.
   알림: 각 측정 라운드 전에 동물의 질량을 기록하는 것이 좋습니다. 우리의 연구를 위해, WT (n = 7)와 DKO (n = 8)의 무게는 각각 200.3 ± 21.67g 및 296.6 ± 3.85g이었다 (p = 0.004, 웰치의 보정을 사용한 짝을 이루지 않은 t 검정). 우리는 어떤 연령이나 크기의 쥐에게도 문제가 없다고 생각합니다.

5. 비디오 전처리

참고: 고속 카메라로 캡처한 비디오는 120fps 및 1080p 해상도의 mp4 형식으로 렌더링됩니다. 분석 소프트웨어 다운스트림의 부담을 덜어주려면 먼저 불필요한 푸티지를 다듬고 LosslessCut 소프트웨어(버전 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut)를 사용하여 각 비디오에서 오디오를 제거한 다음 오픈 소스 소프트웨어 FFmpeg(버전 4.2, http://ffmpeg.org/)를 사용하여 mp4 비디오 스트림을 png 이미지 시퀀스로 변환합니다. 참고 : tiff와 같은 다른 무손실 형식을 png 대신 사용할 수 있습니다.

1. Windows 7 이상을 실행하는 PC에서 비디오에 대한 디렉토리를 만든 다음 고속 카메라의 저장 장치에서 새로 만든 디렉토리로 비디오를 전송합니다. 또한 ffmpeg.exe를 동일한 위치에 복사합니다.
2. LosslessCut에서 비디오를 인터페이스로 드래그하여 엽니 다. 오디오를 버리고 비디오의 분석적으로 관련된 부분만 포함하도록 시작 및 끝 절단점을 설정하고 캡처 프레임 형식을 png로 설정하고 내보냅니다. 비디오를 내보낸 후에는 명명 규칙 뒤에 "_trimmed"를 사용하여 비디오 파일의 이름을 바꿉니다.
3. 비디오를 이미지 시퀀스로 일괄 변환하려면 명령 프롬프트를 열고 작업 디렉터리를 "cd [디렉터리 경로]"를 사용하여 비디오 위치로 설정한 후 다음 명령을 실행합니다.
   (*)의 %i에 대해 mkdir "%~ni_cropped"
   (*)의 %i에 대해 mkdir "%~ni_trimmed"
   /f의 경우 "토큰=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. 배치 처리가 완료된 후, ImageJ 피지(²³ )에서 각각의 이미지 시퀀스를 열고, 쥐가 관찰되는 바닥의 영역을 포함하는 관심 영역(ROI)으로 시퀀스를 자른다.
5. 통로 조명의 배경을 줄이려면 청록색 채널의 색상 균형 최소값을 76으로 늘립니다.
6. 이미지 시퀀스로 저장하고 "_trimmed" 접미사를 "_cropped"로 변경하여 파일을 해당 "_cropped" 폴더에 저장합니다.

6. 보행 처리

참고: 보행 데이터는 무료로 제공되는 소프트웨어인 MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴를 사용하여 처리 및 정량화됩니다.

1. 마이크로소프트 엑셀이 설치된 64비트 윈도우 환경을 실행하는 PC에 마우스워커 소프트웨어의 압축을 풀고 설치합니다.
2. MouseWalker.exe를 시작한 후 각 실행 세트에 대해 초기 스케일 보정을 수행합니다. 이미지 시퀀스를 로드하고 비디오에 캡처된 랜드마크 또는 자를 사용하여 알려진 거리의 두 지점을 측정합니다. 비디오 프레임의 센티미터당 픽셀 수를 계산하고 이 값을 비디오 수집 프레임 속도와 함께 설정 양식의 매개변수 섹션에 입력합니다.
3. 마찬가지로 쥐의 머리, 꼬리 및 발을 측정하여 머리 길이, 최대 꼬리 너비 및 면적, 최소 및 최대 발 면적 및 MouseWalker 설정 양식의 추적 매개 변수 섹션을 완료하는 데 필요한 기타 기능을 결정합니다. 사용 설명서와 다른 문서는 http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ 참조하십시오.
4. 신체 영역 값을 얻으려면 ImageJ에서 동일한 이미지 시퀀스를 열고, 쥐의 윤곽을 그리는 선택 영역을 그리고, 관심 영역(ROI) 픽셀 카운트를 수행합니다.
5. 이 게시에 사용되는 매개 변수 및 설정(그림 S6).
   참고: 매개변수는 설명을 위해 제공되며 비디오의 규모, 획득 하드웨어 및 조건에 따라 다릅니다. 카메라 또는 장비의 위치를 변경할 때마다 소프트웨어 보정 및 조정이 필요합니다. 수집 내에서 측정 장치를 캡처하면 정확도가 향상되고 교정이 용이해집니다.
6. 보정 후 각 이미지 시퀀스를 로드합니다. 자동을 선택하면 풋프린트의 자율 할당이 시작됩니다.
7. 시퀀스의 각 프레임을 스크롤하여 잘못 할당된 풋프린트를 수동으로 수정합니다. 이 단계가 완료되면 저장합니다.
8. 마지막으로 평가를 선택하여 발자국 위치 및 압력 데이터를 처리합니다. 일련의 그래프, 이미지 및 정량적 보행 메트릭이 있는 스프레드시트가 결과 폴더로 내보내집니다.

7. 데이터 분석

1. 각 실행에 대한 정량적 보행 데이터가 포함된 각 평가가 끝날 때 내보낸 스프레드시트를 사용합니다. 각 실행의 데이터와 쥐당 평균을 연결합니다. 평균 데이터를 플로팅하고 GraphPad Prism 버전 7.0a를 사용하여 유의성을 테스트합니다.

결과

쥐 식민지 유지 관리
Pink1 및 파킨 단일 KO 래트의 생성 및 특성은 앞서²²에 기술되었다. Pink1 및 Parkin 단일 KO 래트는 SAGE Labs (현재 Envigo에서 입수 가능)로부터 입수하였다. DKO 쥐는 Pink1-/- 쥐와 Parkin-/- 쥐를 교배하여 Pink1+/-/Parkin+/- 쥐를 얻었고, 이는 Pink1-/-/Parkin^-/- 쥐를 얻기 위해 교배되었습니다(Envigo?...

토론

팔 스윙 감소, 느린 보행 속도 및 짧은 단계를 포함한 보행 장애는 PD의 특징이며 질병 과정 ^1,5 초기에 발생합니다. PD의 설치류 모델에서 보행 분석을위한 발자국을 관찰하고 기록하기 위해 수년에 걸쳐 여러 가지 방법이 개발되었으며, 발자국 위치를 정량화하는 수동 기술은 더 민감하고 동적 매개 변수를 캡처 할 수있는 자동화 된 접근 방식으로 이어?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1