JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Resumo

Eventos associados à maturação nuclear oócito foram bem descritos. No entanto, muito menos se sabe sobre as vias moleculares e processos que ocorrem no citoplasma em preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Durante a maturação do oócito, as mudanças na expressão genética dependem exclusivamente da tradução e degradação das RNAs (mRNAs) do mensageiro materno, em vez da transcrição. A execução do programa translacional, portanto, desempenha um papel fundamental no estabelecimento da competência de desenvolvimento oócito para sustentar o desenvolvimento de embriões. Este artigo faz parte de um foco na definição do programa de tradução materna de mRNA que ocorre durante a maturação meiotica e na transição oócito-zigoto. Neste artigo de método, é apresentada uma estratégia para estudar a regulação da tradução de mRNAs-alvo durante a maturação in vitro oócito. Aqui, um repórter Ypet é fundido à região não traduzida (UTR) de 3' do gene de interesse e, em seguida, micro-injetado em oócitos juntamente com codificação mRNA poliadenilada para mCherry para controlar o volume injetado. Usando microscopia de lapso de tempo para medir o acúmulo de repórteres, as taxas de tradução são calculadas em diferentes transições durante o maturação meiotic oócito. Aqui, os protocolos de isolamento e injeção de oócitos, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos, usando o repórter Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR como exemplo.

Introdução

Um oócito mamífero totalmente cultivado sofre mudanças rápidas na preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Essas mudanças são essenciais para sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. Embora os eventos associados à maturação nuclear sejam relativamente bem descritos, muito menos se sabe sobre os processos moleculares e caminhos no citoplasma oócito. Durante os estágios finais da maturação do oócito, os oócitos são transcricionalmente silenciosos, e a expressão genética é inteiramente dependente da tradução e degradação do mRNA1,2. A síntese de proteínas críticas para a competência do desenvolvimento, portanto, conta com um programa de tradução cronometrada de mRNAs de longa duração que foram sintetizadas anteriormente durante o crescimento do oócito1,3. Como parte de um foco na definição deste programa de tradução materna mRNA executado durante a maturação meiotic e na transição oólito-zigoto, este artigo apresenta uma estratégia para estudar a ativação e repressão da tradução de mRNAs maternas-alvo em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Neste método, o quadro de leitura aberto YPet é clonado a montante da UTR de 3' da transcrição de interesse. Em seguida, mRNAs codificando este repórter são micro-injetados em oócitos juntamente com mRNAs poliadenilated codificando mCherry para controlar o volume injetado. O acúmulo de repórteres é medido durante a maturação meiotic in vitro oocíte usando microscopia de lapso de tempo. O acúmulo de proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry é registrado em oócitos individuais, e os sinais de YFP são corrigidos pelo nível nivelado do mCherry co-injetado. Após a aquisição dos dados, as taxas de tradução são calculadas para diferentes intervalos de tempo durante a maturação meiotic in vitro oocito calculando a inclinação da curva obtida pelo encaixe da curva.

Esta abordagem fornece uma ferramenta para confirmar experimentalmente mudanças na tradução de mRNAs endógenos selecionados. Além disso, este método facilita a caracterização de elementos regulatórios que controlam a tradução durante o amadurecimento meiotico oocíte, manipulando elementos cis-regulatórios da UTR de 3' dasmRNAs-alvo 4,5,6. A manipulação do comprimento da cauda poli(A) também permite a percepção da atividade adenylase/deadenylase em oócitos5. Mutagênese de elementos cis-ação ou imunoprecipitação de RNA pode ser usado para estudar interações com proteínas de ligação RNA cogina6,7. Além disso, este método pode ser usado para identificar componentes essenciais do programa de tradução que são críticos para a competência de desenvolvimento oócito, medindo a tradução UTR alvo 3' em modelos associados à diminuição da qualidade do oócito 8,9,10. Este artigo de método apresenta um experimento representativo onde oócitos desnudados de camundongos C57/BL6 de 21 dias de idade foram micro-injetados com um repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7. A configuração e o protocolo para injeção de oócito, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos.

Protocolo

Os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco (protocolo AN182026).

1. Preparação de mídia

  1. Adicione todos os componentes, conforme descrito na Tabela 1,para tornar a média de maturação básica da coleta de oócitos e oócitos. Para o meio de coleta básica, defina o pH para 7,4. Para o meio de coleta e maturação, adicione 3 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 1 μM cilostamida no dia do uso.

2. Preparação de codificação mRNA para UTR Ypet-3' e mCherry

  1. Obtenha as sequências UTR de 3′ dos mRNAs de interesse.
    NOTA: Para este estudo, as sequências foram obtidas anteriormente a partir de cDNA oocito de rato.
  2. Projete primers para amplificar os UTRs de 3' alvo do oócito cDNA e partes do vetor pcDNA 3.1 contendo uma sequência de codificação Ypet, tag V5-epitope e um promotor T7.
  3. Amplifique usando um kit de polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute os produtos de reação em cadeia de polimerase (PCR) em um gel para verificar se os fragmentos têm o tamanho correto, cortar as bandas e extrair o DNA do gel usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Fundir os fragmentos do PCR em um vetor usando um kit de clonagem PCR.
    NOTA: Fragmentos de PCR foram incubados no gelo por 4h para facilitar um processo de recombinação mais eficiente. Isso é contrário às instruções do fabricante, que recomendam um tempo de incubação de apenas 45 min.
  5. Fragmentos transfect PCR em bactérias competentes de 5 α Escherichia coli.
    1. Adicione a mistura e plasmid às bactérias, e incubar no gelo por 30 minutos.
    2. Aqueça a mistura e o plasmídeo colocando a mistura em um banho de água a 42 °C por 45 s, e esfrie imediatamente no gelo por 3 minutos.
    3. Adicione 500 μL de caldo Super Ótimo com médio de repressão catabólica (SOC) e incubar por 1h a 37 °C.
    4. Gire a 7000 × g por 2 min, e remova a maior parte do supernante. Resuspend e placa em uma placa de ágar Luria Broth (LB) com o antibiótico de seleção apropriado.
      NOTA: A carbenicilina foi utilizada neste estudo.
    5. Incubar durante a noite a 37 °C. Isole as colônias pressionando levemente uma ponta de pipeta em uma das colônias e colocando-a em 3 mL de meio LB com 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar por 12-24 h a 37 °C.
    6. Extrair o DNA dos plasmídeos usando o kit de isolamento de DNA plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante e confirmar as sequências através de sequenciamento de DNA.
  6. Para Ypet/3' UTR:
    1. Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro. Use uma primer para a frente a montante da sequência Ypet e um primer reverso com 20 resíduos adicionais de timina. Consulte a Tabela 2 para a sequência de Ypet/IL-7 3' UTR e as sequências dos primers dianteiros e invertidos.
      NOTA: Esses resíduos adicionais de timina adicionarão oligo(A) ao mRNA linear após transcrição in vitro .
    2. In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Purifique o RNA complementar resultante (cRNA) usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Elute o cRNA purificado na água livre de RNAse, mede a concentração e avalia a integridade por eletroforese agarose. Armazenar a −80 °C.
  7. Para mCherry:
    1. Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro usando uma enzima de restrição de alta fidelidade; use a enzima de restrição mfEI-HF se replicar este exemplo. Digerir em um tampão de digestão durante a noite a 37 °C.
    2. Execute um gel para purificar a amostra e extraia o DNA linear usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
    3. In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Poliadenilate o cRNA (150-200 nucleotídeos) utilizando um kit de rejeito poli(A) de acordo com as instruções do fabricante.
    5. Purifique o cRNA resultante usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Elute o cRNA purificado em água livre de RNAse, mede as concentrações de mRNA e avalia a integridade da mensagem por eletroforese de gel. Armazenar a −80 °C.

3. Procedimento experimental

NOTA: Uma visão geral esquemática da microinjeção de oócito e da microscopia de lapso de tempo subsequente é dada na Figura 1.

  1. Dia 1º
    1. Injetar intraperitoneally camundongos de 21 dias de idade com 5 UI de gonadotropina soro da égua grávida para promover o crescimento do folículo para o estágio antral11.
  2. Dia 3.
    1. Coleção Oocyte
      1. Sacrifique ratos 44-48 h depois de preparar para coletar os ovários, e colocá-los em uma placa de Petri de plástico com meio básico de coleta de oócito.
      2. Abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha de 26 G. Isole os oócitos intactos cumulus-enclosed (COCs) com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca.
      3. Use uma pipeta menor (ligeiramente maior que o diâmetro do oócito), e desnuda mecanicamente os COCs por tubulação repetida.
        NOTA: Alternativamente, realize a micro-injeção em COCs intactos.
      4. Utilizando uma pipeta maior, aspire os oócitos desnudados e coloque-os em uma placa de Petri com meio de maturação suplementado com 1 μM do inibidor de fosfodiesterase, cilostamida, para evitar a retomada da maturação meiotic12. Coloque o prato na incubadora por 2h para que os oócitos se recuperem do estresse induzido pelo isolamento dos oócitos dos folículos.
    2. Micro-injeção de oócito
      1. Prepare as agulhas de injeção colocando um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 cm de comprimento em um puxador mecânico. Para uma injeção ideal, dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45° usando um filamento aquecido.
      2. Prepare pratos de poliestireno com gotículas de 20 μL de meio básico de coleta de oócitos e cubra as gotículas com óleo mineral leve.
      3. Prepare uma mistura de repórter adicionando 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL mCherry. Prepare um volume maior e faça alíquotas para experimentos futuros para garantir concentrações semelhantes de repórteres. Armazene essas alíquotas a -80 °C. Após o descongelamento, primeiro centrifugar a alíquota por 2 min a 20.000 x g, e transferir para um novo tubo de microcentrifuge.
        NOTA: Esta centrifugação evitará que a agulha de injeção fique entupida por potenciais agregados na mistura de repórteres.
      4. Carregue a agulha de injeção por capilaridade com aproximadamente 0,5 μL de mistura de repórter.
      5. Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção carregada nos suportes, e posicione-se na gota do meio de coleta de oócito. Aspire um pouco do meio na pipeta de retenção.
      6. Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção.
      7. Coloque oócitos em uma gota de meio básico de coleta, e injete 5-10 pL da mistura de repórteres.
      8. Incubar os oócitos no meio de maturação com cilostamida de 1 μM por 16 h para permitir que o sinal mCherry planar.
      9. Prepare uma placa de Petri que será usada para microscopia de lapso de tempo com pelo menos duas gotículas de 20 μL de meio de maturação para cada repórter injetado: uma gota com cilostamida de 1 μM para oócitos de prophase de controle I-arrested e uma gotícula sem cilostamida para oócitos maduros. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque na incubadora.
    3. Microscopia de lapso de tempo
      1. Após a pré-incubação, remova os oócitos injetados da incubadora e lave-os quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Mantenha alguns oócitos em meio de maturação com cilostamida de 1 μM como um grupo de controle de oócitos preso por prophase.
      2. Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas no prato de microscópio de lapso de tempo previamente preparado. Aglomerado os oócitos usando uma pipeta de vidro fechada (uma pipeta fechada pode ser preparada segurando a ponta em chamas por alguns segundos).
        NOTA: O agrupamento dos oócitos ajuda a evitar seu movimento durante a gravação.
      3. Coloque o prato sob o microscópio equipado com um sistema de iluminação de diodo emissor de luz e um estágio motorizado equipado com uma câmara ambiental mantida a 37 °C e 5% de CO2. Para replicar este estudo, utilize os seguintes parâmetros: conjunto de filtro: espelho dicrómico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitação (Ex): S500/20 × 49057; Emissão (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
      4. Digite as configurações apropriadas para o experimento time-lapse (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo): Clique em Aplicativos | Aquisição Multidimensional. Selecione a primeira guia Principal e selecione timelapse, várias posições de palcoe vários comprimentos de onda.
      5. Selecione a guia Salvar para inserir o local onde o experimento deve ser salvo.
      6. Selecione a guia Timelapse para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo.
        NOTA: A duração do experimento de lapso de tempo depende das espécies animais estudadas, pois o tempo de maturação meiotic oócito difere entre as espécies. Neste experimento com oócitos de camundongos, os oócitos foram registrados a cada 15 minutos por 16 h.
      7. Selecione a guia Estágio. Ligue o campo brilhante e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela selecionando a Acquire | Adquirir | Show Ao Vivo. Uma vez localizados os oócitos, volte para a janela Aquisição Multidimensional e pressione + para definir a localização dos oócitos.
      8. Selecione a guia Comprimentos de ondae defina 3 comprimentos de onda diferentes para brightfield (exposição de 15 ms), YFP (exposição de 150 ms para UTR Ypet/IL7 3') e mCherry (exposição de 75 ms para Ypet/IL7 3' UTR).
        NOTA: Ajuste a exposição para cada repórter Ypet/3' UTR com base no nível de acúmulo de repórteres e no volume injetado. Certifique-se de que o sinal YFP caia no centro da faixa de detecção no início do experimento para evitar subestimação ou saturação em caso de ativação da tradução. Para mCherry, ajuste a exposição para cada lote de mCherry, pois o sinal depende do número de nucleotídeos de adenina que foram adicionados durante o procedimento de poliadenylation. Devido à variação da eficiência da poliadenilação, use o mesmo lote de mCherry em diferentes experimentos para uma melhor comparação entre experimentos.
      9. Inicie o experimento de lapso de tempo clicando em Acquire. Consulte a Figura 2 e o Arquivo Suplementar para obter um exemplo de uma gravação de lapso de tempo em um único oócito.
    4. Análise da tradução UTR Ypet-3'
      1. Para esta análise (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo), realize duas medidas de região para cada oócito: o próprio oócito clique na região de elipse e cerque a região oócito-e uma pequena região próxima ao oócito a ser usada para subtração de fundo-clique na região retangular.
        NOTA: Certifique-se de que os oócitos não saiam da região selecionada durante a gravação do lapso de tempo. Preste especial atenção à colocação da medição da região em torno da extrusão do corpo polar, pois isso causa movimento no oócito e pode distorcer a gravação.
      2. Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando primeiro no Open Log e depois no Log Data para exportar o software de análise de dados.
      3. Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito. Faça isso para comprimentos de onda YFP e mCherry separadamente.
      4. Regisso tempo de quebra de vesícula germinal (GVBD) e extrusão do corpo polar (PBE) para referência posterior.
        NOTA: Exclua oócitos do mouse amadurecido quando o GVBD exceder 2 h.
      5. Plot YFP e mCherry expressão ao longo do tempo para cada oócito para verificar outliers.
        NOTA: Esta deve ser uma curva suave, se não for isso pode indicar que o oócito se moveu durante a gravação.
      6. Para cada oócito individual, calcule a expressão mCherry média para os últimos dez pontos de tempo da gravação. Para cada ponto de tempo, divida a expressão YFP pela expressão mCherry média para corrigir o volume injetado para obter uma razão YFP/mCherry em cada ponto de tempo para cada oócito individual.
      7. Calcule as taxas de tradução para um intervalo de tempo específico, encaixando a inclinação da curva por regressão linear. Avalie as diferenças nas taxas de tradução usando inferência estatística.

Resultados

Os oócitos desnudados prophase I-arrested de ratos C57/BL6 de 21 dias de idade foram injetados com uma mistura de repórter contendo mRNA codificando o repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7 e mRNA codificação mCherry. YFP e mCherry expressão foi registrado em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e 9 foram presos em prophase I como um controle negativo. Três oócitos maduros foram excluídos para análise por terem um GVBD atrasado (N=2) ou movidos no prato durante a gravação (N=1).

Discussão

O método apresentado descreve uma estratégia para estudar a ativação e a repressão da tradução do mRNA alvo em diferentes transições durante a maturação meiotic in vitro oocito. IL-7, uma citocina liberada pelo oócito que pode estar envolvida na comunicação celular oócito-cumulus8,13, foi escolhida com o propósito de descrever este método. O IL-7 é conhecido por ser cada vez mais traduzido durante a maturação do oócito

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM097165, GM116926 e Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 para Marco Conti. Enrico M. Daldello foi apoiado por uma bolsa da Fundação Lalor e Natasja G. J. Costermans foi apoiada por uma bolsa Rubicon da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Referências

  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Biologia do DesenvolvimentoEdi o 172O citomRNAtradu omatura o meioticmicroscopia de lapso de tempoensaio de rep rtermicro inje o

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados