JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает репортерный анализ для изучения регуляции трансляции мРНК в отдельных ооцитах во время созревания in vitro.

Аннотация

События, связанные с созреванием ядер ооцитов, хорошо описаны. Однако гораздо меньше известно о молекулярных путях и процессах, которые происходят в цитоплазме при подготовке к оплодотворению и приобретению тотипотентности. Во время созревания ооцитов изменения в экспрессии генов зависят исключительно от трансляции и деградации материнских матричных РНК (мРНК), а не от транскрипции. Таким образом, выполнение трансляционной программы играет ключевую роль в установлении компетентности развития ооцитов для поддержания развития эмбриона. Данная работа является частью фокуса на определении программы трансляции материнской мРНК, которая происходит во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу. В данной методе представлена стратегия исследования регуляции трансляции целевых мРНК при созревании ооцитов in vitro. Здесь репортер Ypet сливается с 3'-й нетранслируемой областью (UTR) интересуемого гена, а затем микроинъецируется в ооциты вместе с полиаденилированной мРНК, кодирующей для mCherry для контроля введенного объема. Используя покадровую микроскопию для измерения репортерного накопления, скорость трансляции рассчитывается при различных переходах во время мейотического созревания ооцитов. Здесь описаны протоколы выделения и инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных с использованием репортера Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR в качестве примера.

Введение

Полностью выращенный ооцит млекопитающего претерпевает быстрые изменения при подготовке к оплодотворению и приобретении котипотентности. Эти изменения необходимы для поддержания эмбрионального развития после оплодотворения. Хотя события, связанные с ядерным созреванием, относительно хорошо описаны, гораздо меньше известно о молекулярных процессах и путях в цитоплазме ооцитов. На заключительных стадиях созревания ооцитов ооциты транскрипционно молчат, а экспрессия генов полностью зависит от трансляции и деградации мРНК1,2. Синтез белков, критически важных для развития компетентности, поэтому опирается на программу временной трансляции долгоживущих мРНК, которые были синтезированы ранее во время роста ооцитов1,3. В рамках акцента на определении этой программы трансляции материнской мРНК, выполняемой во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу, в статье представлена стратегия изучения активации и подавления трансляции целевых материнских мРНК в одиночных ооцитах при мейотическом созревании in vitro.

В этом методе открытая рамка чтения YPet клонируется выше 3' UTR интересуемой транскрипты. Затем мРНК, кодирующие этот репортер, микроинъецируются в ооциты вместе с полиаденилированными мРНК, кодируемыми mCherry, для контроля инъецируемого объема. Накопление репортера измеряется во время мейотического созревания ооцитов in vitro с помощью покадровой микроскопии. Накопление желтого флуоресцентного белка (YFP) и mCherry регистрируется в отдельных ооцитах, а сигналы YFP корректируются плато-уровнем совместно вводимого mCherry. После сбора данных рассчитываются скорости трансляции для различных временных интервалов во время мейотического созревания мейотических яйцеклеток in vitro путем вычисления наклона кривой, полученной путем подгонки кривой.

Этот подход предоставляет инструмент для экспериментального подтверждения изменений в трансляции выбранных эндогенных мРНК. Кроме того, этот метод облегчает характеристику регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время мейотического созревания ооцитов путем манипулирования цис-регуляторными элементами 3' UTR целевых мРНК4,5,6. Манипуляции с длиной поли(А) хвоста также позволяют понять активность аденилазы/моденилазы в ооцитах5. Мутагенез цис-действующих элементов или иммунопреципитация РНК может быть использован для изучения взаимодействий с родственными РНК-связывающими белками6,7. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации основных компонентов программы трансляции, которые имеют решающее значение для компетентности развития ооцитов, путем измерения целевой трансляции 3' UTR в моделях, связанных со снижением качества ооцитов 8,9,10. В этой методной работе представлен репрезентативный эксперимент, в котором оголенные ооциты 21-дневных мышей C57 / BL6 были микроинъецированы с репортером Ypet, слитым с 3'UTR IL-7. Описаны установка и протокол для инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных.

протокол

Экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Сан-Франциско (протокол AN182026).

1. Подготовка СМИ

  1. Добавьте все компоненты, как описано в таблице 1,чтобы получить основную среду сбора ооцитов и среду созревания ооцитов. Для базового носителя сбора установите pH на 7,4. Как для сбора, так и для созревания добавляйте 3 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) и 1 мкМ цилостамида в день использования.

2. Подготовка кодирования мРНК для Ypet-3' UTR и mCherry

  1. Получение 3′ UTR-последовательностей интересующих мРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования последовательности были ранее получены из кДНК ооцитов мыши.
  2. Разработать праймеры для усиления целевых 3' UUTR из кДНК ооцитов и частей вектора pcDNA 3.1, содержащих кодирующую последовательность Ypet, метку V5-эпитопа и промотор T7.
  3. Амплификация с использованием высокоточного набора ДНК-полимеразы. Запустите продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геле, чтобы проверить, имеют ли фрагменты правильный размер, вырежьте полосы и извлеките ДНК из геля с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Слить фрагменты ПЦР с вектором с помощью комплекта для клонирования ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты ПЦР инкубировали на льду в течение 4 ч для облегчения более эффективного процесса рекомбинации. Это противоречит инструкциям производителя, которые рекомендуют инкубационное время всего 45 мин.
  5. Трансфектировать фрагменты ПЦР в компетентные 5-α бактерии Escherichia coli.
    1. Добавьте смесь и плазмиду к бактериям и высиживайте на льду в течение 30 минут.
    2. Тепловой удар смеси и плазмиды путем помещения смеси на водяную баню при 42 °C в течение 45 с, и немедленно охлаждают на льду в течение 3 мин.
    3. Добавьте 500 мкл супероптимального бульона со средой репрессирования катаболита (SOC) и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C.
    4. Открутите вниз при 7000 × g в течение 2 мин и удалите большую часть супернатанта. Повторное суспенд и пластина на агаровой пластине Luria Broth (LB) с соответствующим антибиотиком подбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Карбенициллин был использован в этом исследовании.
    5. Инкубировать в течение ночи при 37 °C. Изолируйте колонии, слегка надавливая кончиком пипетки на одну из колоний и помещая ее в 3 мл среды LB со 100 мкг/мл карбенициллина. Инкубировать в течение 12-24 ч при 37 °С.
    6. Извлеките ДНК плазмид с помощью набора для изоляции плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя и подтвердите последовательности с помощью секвенирования ДНК.
  6. Для Ypet/3' UTR:
    1. Создайте линейный шаблон ПЦР для транскрипции in vitro. Используйте прямую грунтовку перед последовательностью Ypet и обратную праймер с 20 дополнительными остатками тимина. В таблице 2 приведена последовательность Ypet/IL-7 3' UTR и последовательности прямого и обратного праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти дополнительные остатки тимина добавят олиго(А) к линейной мРНК после транскрипции in vitro.
    2. In vitro транскрибируйте продукт ПЦР с использованием набора транскрипции T7 в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Очистите полученную комплементарную РНК (цРНК) с помощью набора для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
    4. Элюдирование очищенной цРНК в воде, не содержит РНК, измерение концентрации и оценка целостности с помощью агарозного электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.
  7. Для мВечерри:
    1. Создание линейного шаблона ПЦР для транскрипции in vitro с помощью высокоточного фермента рестрикции; используйте фермент рестрикции mfEI-HF при репликации этого примера. Переваривает в буфере пищеварения в течение ночи при 37 °C.
    2. Запустите гель для очистки образца и извлеките линейную ДНК с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
    3. In vitro транскрибируйте продукт ПЦР с использованием набора транскрипции T7 в соответствии с инструкциями производителя.
    4. Полиаденилировать цРНК (150-200 нуклеотидов) с помощью поли(А) хвостохранилища согласно инструкции производителя.
    5. Очистите полученную кРНК с помощью комплекта для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
    6. Элюдирование очищенной цРНК в воде, свободной от РНК, измерение концентраций мРНК и оценка целостности сообщения с помощью гелевого электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.

3. Экспериментальная процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор микроанализии ооцитов и последующей покадровой микроскопии приведен на рисунке 1.

  1. День 1
    1. Внутрибрюшинно вводят 21-дневным мышам 5 МЕ сывороточного гонадотропина беременной кобылы, чтобы способствовать росту фолликула до антральной стадии11.
  2. День 3
    1. Коллекция ооцитов
      1. Жертвоприношение мышей через 44-48 ч после прайминга для сбора яичников и помещает их в пластиковую чашку Петри с основной средой сбора ооцитов.
      2. Осторожно откройте антральные фолликулы, сделав небольшой разрез в стенке фолликула иглой 26 г. Изолируйте интактные кучевые ооциты (КОК) с несколькими слоями кучевых клеток с помощью стеклянной пипетки, управляемой ртом.
      3. Используйте меньшую пипетку (немного больше диаметра яйцеклетки) и механически обнажают КОК путем повторного пипетирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, выполните микро-инъекцию неповрежденных КОК.
      4. Используя большую пипетку, аспирировать оголенные ооциты и поместить их в чашку Петри со средой созревания, дополненной 1 мкМ ингибитора фосфодиэстеразы, цилостамидом, чтобы предотвратить возобновление мейотического созревания12. Поместите чашку в инкубатор на 2 ч, чтобы яйцеклетки оправились от стресса, вызванного выделением ооцитов из фолликулов.
    2. Микро-инъекция ооцитов
      1. Подготовьте инъекционные иглы, поместив боросиликатную стеклянную капиллярную трубку длиной 10 см в механический съемник. Для оптимального впрыска согните наконечник иглы под углом 45° с помощью нагретой нити накала.
      2. Готовят блюда из полистирола с 20 мкл капель основной среды для сбора ооцитов и покрывают капли легким минеральным маслом.
      3. Приготовьте репортерную смесь, добавив 12,5 мкг/мкл Ypet-3' UTR и 12,5 мкг/мкл вишни. Подготовьте больший объем и сделайте аликвоты для будущих экспериментов, чтобы обеспечить аналогичные концентрации репортеров. Храните эти аликвоты при -80 °C. После оттаивания сначала центрифугируют аликвот в течение 2 мин при 20 000 х ги переносят на новую микроцентрифужную трубку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта центрифугирование предотвратит засорение инъекционной иглы потенциальными агрегатами в репортерной смеси.
      4. Загрузите инъекционную иглу капиллярностью примерно 0,5 мкл репортерной смеси.
      5. Поместите удерживающая пипетку и загруженную инъекционную иглу в держатели и поместите в каплю среды сбора ооцитов. Аспирировать часть среды в удерживающая пипетку.
      6. Откройте инъекционную иглу, осторожно постукивая ею по удерживающей пипетке.
      7. Поместите ооциты в каплю основной среды сбора и вводят 5-10 пл репортерной смеси.
      8. Инкубируют ооциты в среде созревания с 1 мкМ цилостамида в течение 16 ч, чтобы сигнал mCherry вышел на плато.
      9. Приготовьте чашку Петри, которая будет использоваться для покадровой микроскопии с по меньшей мере двумя каплями среды созревания по 20 мкл на каждого введенного репортера: одной каплей с цилостамидом 1 мкМ для контрольной профазы I-арестованных ооцитов и одной каплей без цилостамида для созревания ооцитов. Накройте капли легким минеральным маслом и поместите в инкубатор.
    3. Покадровая микроскопия
      1. После предварительной инкубации извлекают введенные ооциты из инкубатора и промывают их четыре раза в среде созревания без цилостамида. Держите некоторые ооциты в среде созревания с 1 мкМ цилостамида в качестве профазы I-арестованной контрольной группы ооцитов.
      2. Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на предварительно подготовленной тарелке для покадрового микроскопа. Сгруппировать ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки (закрытую пипетку можно приготовить, удерживая наконечник в огне в течение нескольких секунд).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеризация ооцитов помогает предотвратить их движение во время записи.
      3. Поместите тарелку под микроскоп, оснащенный светодиодной системой освещения и моторизованной сценой, оборудованной камерой окружающей среды, поддерживаемой при 37 °C и 5% CO2. Для воспроизведения этого исследования используйте следующие параметры: набор фильтров: дихроичное зеркало YFP/CFP/mCherry 69008BS; Канал YFP (возбуждение (Ex): S500/20 × 49057; Эмиссия (EM): D535/30 m 47281), мВечерный канал (Ex: 580/25 × 49829; Эм: 632/60 м).
      4. Введите соответствующие настройки для покадрового эксперимента (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании): Нажмите на Приложения | Многомерное приобретение. Выберите первую вкладку Главная и выберите таймлапс, несколько позиций ступении несколько длин волн.
      5. Выберите вкладку Сохранение, чтобы ввести место, где должен быть сохранен эксперимент.
      6. Выберите вкладку Timelapse, чтобы ввести количество точек времени, продолжительность и интервал времени.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность покадрового эксперимента зависит от изучаемых видов животных, так как сроки мейотического созревания ооцитов различаются между видами. В этом эксперименте с мышиными ооцитами ооциты регистрировали каждые 15 мин в течение 16 ч.
      7. Выберите вкладку Рабочая область. Включите brightfield и найдите положение ооцитов, открыв новое окно, выбрав Получить | Приобрести | Шоу в прямом эфире. Как только ооциты будут обнаружены, вернитесь в окно Многомерного Сбора и нажмите +, чтобы установить местоположение ооцитов.
      8. Выберите вкладку Длины волни установите 3 различные длины волн для яркого поля (экспозиция 15 мс), YFP (экспозиция 150 мс для Ypet/IL7 3' UTR) и mCherry (экспозиция 75 мс для Ypet/IL7 3' UTR).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте экспозицию для каждого репортера Ypet/3' UTR в зависимости от уровня накопления репортера и впрыскиваемого объема. Убедитесь, что сигнал YFP попадает в центр диапазона обнаружения в начале эксперимента, чтобы предотвратить недооценку или насыщение в случае активации трансляции. Для mCherry отрегулируйте экспозицию для каждой партии mCherry, так как сигнал зависит от количества адениннуклеотидов, которые были добавлены во время процедуры полиаденилирования. Из-за различий в эффективности полиаденилирования используйте одну и ту же партию mCherry в разных экспериментах для лучшего сравнения между экспериментами.
      9. Начните эксперимент с временными промежутками, щелкнув Получить. См. рисунок 2 и дополнительный файл для примера покадровой записи в одной яйцеклетки.
    4. Анализ перевода УТР Ypet-3'
      1. Для этого анализа (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании) выполните два измерения области для каждой яйцеклетки: сама яйцеклетка - щелчок по области эллипса и окружение ооцита - и небольшая область, близкая к ооциту, которая будет использоваться для фонового вычитания - щелчок по прямоугольной области.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ооциты не выходят из выбранной области во время покадровой записи. Обратите особое внимание на размещение измерения области вокруг экструзии полярного тела, так как это вызывает движение в ооците и может исказить запись.
      2. Экспортируйте данные измерения региона в электронную таблицу, щелкнув сначала Открыть журнал, а затем Данные журнала, чтобы экспортировать программное обеспечение для анализа данных.
      3. Для каждого отдельного ооцита и для всех измеренных временных точек вычтите измерение фоновой области из измерения области ооцитов. Сделайте это для длин волн YFP и mCherry отдельно.
      4. Запишите время разрушения зародышевого везикулы (GVBD) и экструзии полярного тела (PBE) для последующего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Исключить созревание мышиных ооцитов, когда GVBD превышает 2 ч.
      5. График экспрессии YFP и mCherry с течением времени для каждого ооцита, чтобы проверить выбросы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это должна быть гладкая кривая, если это не так, это может указывать на то, что яйцеклетка двигалась во время записи.
      6. Для каждого отдельного ооцита рассчитайте среднюю экспрессию mCherry за последние десять временных точек записи. Для каждой временной точки разделите экспрессию YFP на усредненную экспрессию mCherry, чтобы скорректировать для введенного объема, чтобы получить соотношение YFP/mCherry в каждой точке времени для каждого отдельного ооцита.
      7. Рассчитайте скорости трансляции для определенного временного интервала, подгоняя наклон кривой линейной регрессией. Оцените различия в скорости перевода с помощью статистического вывода.

Результаты

Оголенные профазные I-арестованные ооциты 21-дневных мышей C57/BL6 вводили репортерную смесь, содержащую мРНК, кодирующую репортера Ypet, слитую с 3'UTR IL-7 и мРНК, кодирующих mCherry. Экспрессия YFP и mCherry была зарегистрирована в 39 ооцитах, из которых 30 были зрелыми, а 9 были арестованы в профазе I в каче...

Обсуждение

Представленный метод описывает стратегию изучения активации и подавления трансляции целевой мРНК при различных переходах при мейотическом созревании мейотического созревания ооцитов in vitro. IL-7, цитокин, высвобождаемый ооцитом, который может быть вовлечен в ооцитар-кучевую клето?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH R01 GM097165, GM116926 и Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD Национальными центрами трансляционных исследований в области репродукции и бесплодия P50 HD055764 Марко Конти. Энрико М. Далделло был поддержан стипендией Фонда Лалора, а Натасья Г. Я. Костерманс была поддержана стипендией Рубикона от Нидерландской организации научных исследований (NWO).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Ссылки

  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены