Ensaio de fisiologia térmica baseada em campo: recuperação de choque frio em condições ambientais

Resumo

Aqui, um protocolo acessível e de baixo custo é descrito para avaliar a recuperação de choque frio de borboletas em condições ambientais ambientais.

Resumo

A fisiologia ecológica, particularmente dos ectotherms, é cada vez mais importante neste mundo em mudança, pois utiliza medidas de espécies e traços ambientais para explorar as interações entre organismos e seus arredores para entender melhor sua sobrevivência e aptidão. Os ensaios térmicos tradicionais são caros em termos de tempo, dinheiro e equipamentos e, portanto, são muitas vezes limitados a pequenos tamanhos de amostra e poucas espécies. Apresentado aqui é um novo protocolo que gera dados detalhados sobre o comportamento individual e a fisiologia de insetos grandes, volant, terrestres, usando o exemplo de borboletas. Este artigo descreve os métodos de um ensaio de recuperação de choque frio que pode ser realizado no campo em condições ambientais ambientais e não requer equipamentos laboratoriais caros. Este método tem sido usado para entender a estratégia de resposta e recuperação para o choque frio das borboletas tropicais, gerando dados individuais de nível em comunidades de borboletas inteiras. Esses métodos podem ser empregados tanto em ambientes de campo remoto quanto em salas de aula e podem ser usados para gerar dados fisiológicos ecologicamente relevantes e como ferramenta de ensino.

Introdução

A integração da fisiologia térmica e da ecologia no final da década de 1970 e início dos anos 1980^1,2 lançou o campo da fisiologia ecológica. Extensos estudos térmicos realizados em ectotherms destacam sinergias eco-fisiológicas em diversos contextos ecoevolutivos^3,4,5. Pesquisas sobre fisiologia térmica de organismos ectotérmicos recuperaram a atenção recentemente diante das mudanças climáticas e das paisagens térmicas alteradas em todo o mundo^6,7. Além de informar estudos no campo acadêmico da fisiologia ecológica, os ensaios de fisiologia térmica podem ser amplamente acessíveis aos pesquisadores e podem servir como uma abordagem prática de ensino para todos os níveis. Componentes do desempenho térmico, incluindo limites térmicos e efeitos de choques de temperatura, são fundamentais para a ecologia, comportamento e história de vida dos animais^8,9.

Especificamente, os ecototherms são usados para abordar questões de fisiologia, pois a endotermia dita uma ligação inextricável entre temperatura ambiente e organismo. A faixa de temperatura que os organismos podem suportar (seu mínimo térmico crítico para a faixa máxima térmica) e as temperaturas em que seus comportamentos e condicionamento físico são maximizadas (optima térmica) são frequentemente enraizadas em processos ecológicos e evolutivos. Esses traços fisiológicos são de importância crescente, pois as temperaturas, tanto os meios quanto os extremos, estão aumentando¹⁰. Por exemplo, as mudanças abióticas, incluindo aumentos de temperatura, que acompanham a destruição e a fragmentação do habitat têm afetado comunidades de ectotherms, incluindo anurans, limitando espécies fisiologicamente frágeis (com tolerância térmica estreita) a pequenas manchas de habitat^{remanescentes 11,12}.

Avaliar os principais componentes do desempenho térmico pode ser caro tanto em termos de tempo quanto de recursos e tradicionalmente requer equipamentos de laboratório e condições padronizadas. Além disso, ensaios convencionais muitas vezes não refletem a amplitude das condições ambientais experimentadas na natureza por um determinado animal^13, pois a temperatura em experimentos fisiológicos semelhantes é cuidadosamente controlada e muitas vezes não relacionada às condições ambientais experimentadas por um animal. Este controle de temperatura pode diminuir a compreensão da variação nas respostas individuais^2,14. Os fisiologistas têm se apoiado em experimentos de aquecimento e resfriamento baseados em laboratório, usando banhos de água programáveis para aquecer ou resfriar o ambiente de um animal para informar as curvas de desempenho térmico¹⁵.

Normalmente, os animais são colocados em frascos com um termopar, e sua temperatura ambiente é alterada constantemente, controlando a temperatura do banho de água circundante. Os pesquisadores medem o tempo necessário para alcançar um estado fisiológico alterado (por exemplo, coma frio, knockdown) e a temperatura em que a mudança de status ocorreu^16,17. A partir de um mínimo de US$ 500, essas ferramentas são grandes, pesadas e requerem equipamentos técnicos adicionais (por exemplo, computador, termopares). Consequentemente, as ferramentas básicas para realizar métodos clássicos de avaliação do desempenho térmico são 1) não economicamente acessíveis a todos, 2) não são adequadas para avaliar animais grandes demais para serem contidos em frascos habituais usados para pequenos dipteranos, e 3) não portáteis para uso em configurações remotas de campo. A adesão à prática comum resultou em representação limitada entre a taxonomia e as condições experimentais^18,19,20.

Embora as curvas de desempenho térmico completas possam informar a distribuição das espécies, traços históricos de vida e comportamento, entre outros traços, a quantificação de métricas térmicas cada vez mais simples pode ser mais eficiente e ainda extremamente informativa. Ensaios fisiológicos, medindo o início do coma frio e a subsequente recuperação de choque frio, o endurecimento a frio e o comportamento de redoeamento, são proxies eficazes e executáveis para o mínimo térmico crítico de um organismo⁸. Descrito aqui é um ensaio de choque frio útil para obter dados fisiológicos de grandes insetos ectoréricos terrestres. O ensaio é acessível, acessível e fácil de executar em condições de campo ou em sala de aula. Os dados sobre a recuperação de choque frio gerados por este protocolo podem ser associados a espécies ou dados de características de nível individual para buscar questões sobre fisiologia ecológica e/ou usados para ensinar os alunos sobre princípios fisiológicos.

Protocolo

1. Identificação de espécies de interesse

1. Identifique espécies de interesse para determinar o tempo de recuperação do choque frio. Tenha em mente que cada grupo vai diferir no tempo que leva para induzir um coma frio (ou seja, o ponto em que o inseto ainda está vivo, mas não está se movendo e não respondendo). Da mesma forma, com base no organismo e no uso de dados, escolha diferentes pontos de corte para parar o experimento se o indivíduo focal não voar (ver seção 4).
   NOTA: Este protocolo foi projetado e desenvolvido para uso em Lepidoptera. No entanto, é aplicável a insetos grandes, volant, terrestres, em particular, aqueles que podem ser armazenados planas em envelopes de vidro restringindo o movimento e os danos (por exemplo, borboletas e libélulas/damselflies).

2. Realização de um pré-julgamento

1. Realizar um pré-julgamento em uma pequena amostra de indivíduos para determinar os parâmetros-chave. Siga as seções 3 a 5 do protocolo abaixo com 5-10 indivíduos para um pré-julgamento.
   1. Teste o tempo necessário no gelo para induzir um coma frio (não se movendo), mas não mate as espécies focais seguindo o passo 5.1 usando tratamentos de 30 minutos, 60 min e 90 min.
      NOTA: O tempo necessário para induzir um coma frio dependerá do tamanho, localização e histórico/comportamento natural dos indivíduos.
   2. Com base nos resultados das etapas 4.1-4.4 e utilizando o conhecimento da ecologia dos insetos focais, escolha um tempo para concluir o ensaio se um determinado indivíduo não fizer uma recuperação completa. Basear este tempo de corte na ecologia da espécie também, tendo em mente que depois de muitos minutos de ser incapaz de voar, muitos insetos são predados.
      NOTA: Por exemplo, se a maioria dos testes preliminares terminar em voo após 15 minutos, pode-se decidir encerrar os testes após 25 minutos para garantir que mesmo os outliers tenham a chance de se recuperar totalmente (ou seja, voar). Este protocolo é baseado em um tempo de corte de 30 minutos (etapa 5.4).
2. Use parâmetros de dados pré-julgamento para informar a coleta de dados para os experimentos. Modifique o protocolo descrito abaixo com base nas necessidades dos organismos focais, incluindo tempo no chorume de gelo, tempo para chamar os ensaios ao fim, e comportamentos documentados na folha de dados (por exemplo, o arrepio pode ser um comportamento inadequado para o inseto de escolha).
   1. Defina perguntas específicas de pesquisa a serem respondidas com esses dados, refinando os parâmetros.
      NOTA: Por exemplo, se o pesquisador estiver interessado no efeito da exposição prolongada na recuperação, o tempo no gelo é uma variável chave para modificar. Se os pesquisadores estão interessados em diferenças na fisiologia entre espécies de cor clara e escura, eles podem escolher duas espécies distintamente coloridas ou modificar a cor da asa do inseto para medir o efeito da cor da asa no tempo de recuperação. É importante ressaltar que este método é altamente personalizável às necessidades e questões de pesquisa colocadas (ver a seção de discussão).

3. Coleta de insetos

1. Recolher insetos utilizando métodos apropriados, como armadilhas iscas e redes entomológicas,(Figura Suplementar 1). Após a coleta, coloque cada indivíduo em um envelope de vidro separado com uma ID única.
2. Armazene animais em um lugar escuro e fresco depois de serem capturados e antes da exposição ao experimento de choque frio. Sempre exponha o animal ao tratamento experimental dentro de 24 horas após ser capturado, e padronize desta vez o máximo possível em ensaios.
   1. Embora as condições de armazenamento possam variar, mantenha os insetos fora do sol direto. Se possível, coloque-os dentro de um quarto fresco e escuro.
   2. No campo, certifique-se de que eles serão sombreados enquanto armazenados e são protegidos contra o vento (soprando) e outros predadores de insetos que podem entrar nos envelopes.

4. Configure o experimento de choque frio

1. Encha um refrigerador com gelo e água. Certifique-se de que há gelo suficiente para persistir por pelo menos uma hora, e adicione gelo periodicamente conforme necessário com o objetivo de manter o ambiente na água a 0 °C.
2. Escolha entre 1 e 4 indivíduos focais para uma rodada de experimentação, certificando-se de que cada indivíduo é identificável.
   1. Se usar várias espécies, use apenas uma de cada para evitar confundir indivíduos na folha de dados. Se experimentar com apenas uma espécie, use apenas indivíduos que possam ser facilmente distinguidos, por exemplo por uma asa quebrada ou marcação distinta.
   2. Se o objetivo do experimento não estiver relacionado com a coloração das asas, marque as asas com IDs únicos (por exemplo, números) com um marcador fino de ponta de feltro para distinguir indivíduos.
   3. Se os experimentos não atenderem a nenhum dos critérios acima, realize o experimento em um indivíduo de cada vez.
3. Preencha as linhas da ficha técnica com as informações pertinentes a cada inseto ensaio, incluindo seu ID exclusivo e um identificador útil nas notas, como nome da espécie ou caractere distinto(Tabela Suplementar 1).
4. Coloque todos os indivíduos focais (ainda em seus envelopes marcados individualmente) em um saco plástico selado com peso (Tabela de Materiais),e coloque o saco em água gelada por 60 minutos (ou até que o coma frio tenha sido induzido; veja discussão) (Figura Suplementar 2).
   1. Certifique-se de que o peso é pesado (por exemplo, moedas grandes, arruelas grandes ou rochas lisas) e grande o suficiente para manter o saco de insetos submerso na água gelada e perpendicular à superfície da água. Use um peso que não cause vazamentos no saco plástico selado.
      NOTA: Enquanto os insetos ainda são capazes de se recuperar se forem expostos diretamente à água enquanto estão submersos, envelopes molhados complicam a remoção de cada indivíduo. É melhor manter os insetos secos em sua bolsa.
5. Registo de temperatura e luz.
   1. Use um gravador de dados (ver a Tabela de Materiais) para registrar dados de temperatura ambiente e luz usando a etapa 5.1 ou 5.2.
      1. Programe o data logger para coletar dados de temperatura e luz em intervalos de 10 s, começando no momento em que os insetos serão liberados.
      2. Basear o tempo de início do data logger sobre quando os insetos foram colocados na água gelada. Certifique-se de que as informações do data-logger (data, hora) sejam sincronizadas para que os dados sobre condições ambientais possam ser posteriormente combinados com cada inseto focal individual.
   2. Use um termômetro simples para registrar dados de temperatura e luz em intervalos curtos à mão (por um segundo pesquisador).
      1. Decida sobre os parâmetros experimentais para associar ao tempo de recuperação que pode ser medido sem um data logger. Use tratamentos distintos: sombra/sol; crepúsculo/meio-dia.
6. Coloque uma gaiola de malha para os insetos em um local apropriado para que os ambientes de temperatura e luz sejam o mais homogêneos possível dentro da gaiola, e para que a base da gaiola seja elevada e possa ser aproveitada pelo observador.
7. Coloque o data logger fora da gaiola, ou dentro da gaiola para que não seja derrubado ou afetado por pequenos movimentos dentro da gaiola. Se não estiver usando um data logger, posicione um termômetro adequadamente e/ou configure as gaiolas na configuração apropriada.
   NOTA: O gravador de dados deve ser colocado para que as condições ambientais registradas sejam o mais próximas possível daquelas que o inseto está experimentando.

5. Comece o experimento de choque frio

1. Retire os animais do banho de água gelada após 60 min (ou tempo determinado apropriado; veja acima). Remova imediatamente os insetos do saco plástico e remova cada indivíduo do envelope o mais rápido possível, minimizando o manuseio(Figura Suplementar 3).
2. Inicie o cronômetro assim que os animais estiverem nas gaiolas de malha (veja os dados do exemplo, Tabela Suplementar 1).
3. Toque na base da gaiola com um lápis para agitar os insetos em recuperação.
   NOTA: Fornecer estímulos durante a recuperação garante que os insetos focais demonstrem estado de recuperação e comportamentos assim que forem fisiologicamente capazes(Vídeo Suplementar).
   1. Toque com frequência e força suficiente para garantir que um animal responda se possível, mas não cause uma resposta.
      NOTA: Por exemplo, ao tocar na gaiola, se um animal é catapultado para o ar e pousa ereto, mas não se move para ficar por conta própria, isso não é considerado um comportamento "stand", pois o organismo não se levantou sozinho.
4. Marque o teste como completo uma vez que um indivíduo tenha voado (ou seja, mostrado uma recuperação completa). Termine o teste e considere que o inseto conseguiu uma recuperação completa se ele não se mover após 30 min.
5. Remova os insetos da gaiola de malha e coloque os indivíduos de volta em seus envelopes de vidro rotulados. Liberte os animais ou guarde-os para posterior coleta de dados (por exemplo, traços individuais de tamanho, peso).
6. Se usar um data logger, pare a coleta de dados de data logger e salve o arquivo de dados de temperatura e luz durante o experimento com informações de data/hora apropriadas.

6. Processamento de dados

1. Digite os dados apresentados a partir da folha de dados em uma planilha (por exemplo, MS Excel).
2. Se usar um data-logger, adicione dados de temperatura e luz para cada resposta de cada indivíduo avaliado.
   1. Calcule o desvio médio e padrão da temperatura e da luz para cada comportamento de cada indivíduo.
      NOTA: Como o data logger registra dados a cada 10 s, se o comportamento de stand de um animal levou 48 s para ocorrer, use as primeiras 5 entradas do data logger para esse teste.
   2. Associe cada comportamento de recuperação de cada indivíduo com dados abióticos registrados pelo datalogger, arredondando para cima ou para baixo até intervalos de 10 s, conforme necessário.
3. Plote e analise dados. A Figura 1,por exemplo, visualiza o efeito da temperatura e da luz no tempo de recuperação do choque frio. Compile outros dados relevantes (características das espécies, características do habitat regional) para examinar os padrões ecológicos e evolutivos em traços fisiológicos dos grupos testados.
   NOTA: A figura 1 foi plotada usando o pacote ggplot2 em R. O nível de detalhamento dos dados sobre as condições ambientais difere com base nos instrumentos utilizados para medir as condições ambientais. Se um data logger for usado, podem ser gerados números com detalhes comparáveis à Figura 2. Se um termômetro for usado, o pesquisador não será capaz de criar um enredo informado pela luz ambiente. Da mesma forma, se os pesquisadores usarem categorias de luz ou temperatura, essas estações de dispersão podem ser modificadas em boxplots ou outro modelo apropriado para ilustrar esses fenômenos.

Resultados

Os dados coletados neste protocolo permitem o exame e particionamento de variáveis importantes para a fisiologia organizacional. Por exemplo, tanto a temperatura quanto as condições de luz contribuem para a recuperação das borboletas do choque frio(Figura 1). O enredo tem o objetivo de explorar a interação entre condições ambientais e recuperação de choque frio. Usando borboletas capturadas de silvestre de ambas as armadilhas e redes, 181 espécies de borboletas demonstraram recuperação distinta do coma frio induzido por choque frio(Figura 2). Os dados apresentados na Figura 2 foram coletados por três observadores ao longo de aproximadamente cinco meses (janeiro, fevereiro, maio a julho de 2020) nos Andes colombianos. Experimentos sempre foram realizados na manhã após a coleta de borboletas. Com a máxima eficiência, foi possível que dois observadores observassem simultaneamente quatro borboletas cada, repetidas sete vezes (mínimo de 7,37 horas), resultando no teste de 56 indivíduos em uma única manhã. Isso permitiu uma grande quantidade de coleta de dados em comunidades de borboletas inteiras, incluindo e considerando dados sobre variação individual. Como os ensaios podem ocorrer em condições ambientais ambientais, as condições de recuperação são representativas de seus habitats e refletem a variação natural experimentada pelos organismos na natureza. A Figura 3 ilustra a sobreposição entre temperatura e condições de luz do experimento de recuperação de choque frio e condições em um pasto do qual algumas borboletas testadas foram coletadas.

Figura 1: Dispersos do tempo de recuperação (em segundos) de borboletas após choque frio. (A) Temperatura média e (B) média LUX (intensidade de luz) durante sua recuperação. As espécies são organizadas e coloridas pela Família. No geral, à medida que a luz e a temperatura aumentam, o tempo de recuperação do choque frio diminui, mostrando variabilidade em relação à taxa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de resultados do ensaio de recuperação de choque frio em 181 espécies de borboletas dos Andes colombianos. Os dados representam o número de segundos que se passaram da remoção da borboleta do frio e quando ela foi capaz de voar. As espécies são organizadas e coloridas pela Família. Este número demonstra a amplitude taxonômica através da qual este experimento pode ser aplicado com sucesso, e a variedade de respostas de recuperação de choque frio entre as espécies. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Temperatura ambiente e LUX durante ensaios de recuperação de choque frio. Parcela da temperatura ambiente (azul) e LUX (intensidade de luz, vermelho) como registrado por data loggers colocados nos pastos onde ocorreu a coleta de borboletas (cores claras, condições se estendem durante todo o dia) e condições durante testes de recuperação de choque frio (cores escuras, apenas horas da manhã). As condições de campo ambiente e as condições experimentais traçadas mostram a gama e média de condições experimentadas pelas borboletas ao longo de uma semana de amostragem e experimentação de campo. Os experimentos só foram realizados na madrugada (07:00-13:00 h), enquanto os dataloggers foram implantados no campo por uma semana (horário de verão, 06:00-18:00 h mostrado). Aqui é mostrada a sobreposição entre condições experimentais e condições ambientais experimentadas pelas borboletas, demonstrando a relevância ecológica da realização de ensaios fisiológicos em condições ambientais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Procedimento para coleta de insetos focais-neste caso, borboletas-utilizando armadilhas van-someren iscas e redes ativas. As armadilhas eram iscas com peixes podres e iscas de frutas podres. Armadilha (sem isca) em segundo plano, em primeiro plano está um espécime em seu envelope único contra uma caixa de coleta de plástico azul. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Sacos com até quatro borboletas individuais submersas em água gelada em um refrigerador. Sacos plásticos foram marcados com o tempo em que foram colocados na água gelada, para que experimentos de choque frio pudessem ser escalonados durante a manhã. Os sacos plásticos devem ser selados para evitar que os espécimes se molhem; no entanto, a inundação dos sacos e envelopes neste caso não teve efeito mensurável na recuperação das borboletas. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Dois observadores coletam dados no campo. Cada gaiola de malha contém quatro borboletas únicas se recuperando de choque frio. A junta T de cloreto de polivinil na gaiola abriga o viga de dados para evitar a exposição direta ao sol ou à chuva. Cada observador tem um cronômetro que foi iniciado imediatamente após a borboleta soltar na gaiola. As gaiolas são elevadas por bancos, permitindo que os observadores agitar a base da gaiola para garantir que as borboletas respondam comportamentalmente o mais rápido possível fisiologicamente. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela suplementar 1: Exemplo de ficha técnica. A folha mostra o ID único de cada borboleta como atribuído no campo e distinguindo caracteres (nome da espécie, cores-chave) em notas. Também é registrada a posição dominante da borboleta (ou seja, qual lado da asa foi exposta ao sol) durante o período de recuperação, anotado como D (dorsal) ou V (ventral). Clique aqui para baixar esta Tabela.

Vídeo suplementar 1: Tocando na gaiola para recuperação de choque frio. À medida que as borboletas se recuperam, o observador toca a base da gaiola suavemente para induzir comportamentos assim que as borboletas são capazes. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

O estudo da fisiologia térmica incorpora medidas de espécies e traços ambientais para entender melhor as interações entre organismos e seus arredores que são fundamentais para a sobrevivência e o condicionamento físico. Embora sempre integrantes da compreensão da história natural e da ecologia de plantas e animais, os traços térmicos são de importância crescente diante da paisagem e das mudanças climáticas^11,21. Vários grupos de insetos terrestres ectotérmicos, em particular, lepidoptera e odonatano, são relativamente grandes e abundantes, exibem comportamentos distintos e são favoráveis à manipulação. Delineado aqui é um ensaio eficiente e de baixo custo para medir efetivamente as respostas fisiológicas desses insetos. Este protocolo requer uma fonte de organismos saudáveis para avaliar, cujo tempo de manuseio antes do experimento é limitado. Embora flexível no número de organismos avaliados ao mesmo tempo, o número de indivíduos focais por experimento variará de acordo com a finalidade da coleta de dados e/ou número de observadores.

Por exemplo, este protocolo foi desenvolvido para coletar dados individuais detalhados sobre borboletas em comunidades inteiras. Como tal, os resultados representativos ilustram um esforço para maximizar a coleta de dados para indivíduos do maior número possível de espécies e sob uma variedade de condições relevantes para o ambiente local. Independentemente do número de espécies focais, é crucial que o observador seja capaz de identificar cada indivíduo na gaiola que experimenta a recuperação. Se o objetivo é coletar dados de apenas uma espécie, então apenas um ou dois indivíduos (se identificáveis com base em desgaste de asa diferente ou se marcados individualmente) devem ser avaliados de uma só vez. Os sujeitos do estudo devem ser escolhidos de acordo com uma questão ou plano de estudo específico. Com base na questão colocada e na finalidade da coleta de dados (pesquisa ou sala de aula, por exemplo), o tamanho da amostra e a coleta de outros traços serão diferentes.

Para ilustrar os componentes fundamentais da fisiologia elucidados por este protocolo (indução de coma frio, etapas de recuperação, papel das condições ambientais), um instrutor de sala de aula pode escolher duas espécies distintas ou morfos de uma única espécie. Se os indivíduos focais diferem apenas em um traço-chave (por exemplo, cor), um tamanho amostral menor será necessário, e os alunos podem estudar de perto a relação desse traço e fisiologia do organismo. Pesquisadores interessados em fisiologia ecológica podem usar seus dados experimentais para explorar questões ecológicas e evolutivas complexas. Os pesquisadores devem ter certeza de escolher cuidadosamente insetos focais que abordam diretamente suas questões (por exemplo, com base na fase de vida, idade, sexo, localização) e, com base no número de variáveis envolvidas, determinar o tamanho adequado da amostra. Os tamanhos amostrais para modelos complexos serão maiores do que os descritos acima.

Ao coletar dados de recuperação comportamental, é fundamental que a gaiola descanse acima do solo, pois o observador deve ser capaz de tocar na parte inferior da gaiola para provocar comportamentos de recuperação. Isso garante que o organismo responda (se levanta, voa) assim que for fisiologicamente capaz de fazê-lo, e o comportamento de recuperação terminal (voo) é documentado. O registro de condições ambientais durante a recuperação do choque frio é parte integrante do estudo da fisiologia térmica, pois este protocolo é projetado para estudar e desembaraçar o papel do ambiente na fisiologia do organismo. Os data loggers (ver a Tabela de Materiais) são úteis para registrar medidas padronizadas de condições relevantes (por exemplo, temperatura, luz e até umidade). No entanto, se essas ferramentas não estiverem disponíveis, condições relevantes podem ser medidas de outras formas, como com um termômetro digital ou simplificando a variável de condições ambientais e utilizando ambientes distintos como sombra e sol. Este protocolo dá ao pesquisador opções para medir as condições durante a recuperação de choque frio com base na finalidade e escopo do estudo.

Embora este método possa ser modificado para melhor atender a grupos taxonômicos específicos, recomenda-se que insetos grandes e volant sejam usados. Insetos voadores que recuperam sua capacidade de voar independentemente podem ser considerados como ter realizado uma recuperação completa. O método, como descrito, foi usado com sucesso em borboletas nos trópicos e subtrópicos. Com base nas tendências térmicas de uma determinada área (ou seja, a faixa de temperaturas experimentadas em um local que vai variar, influenciando assim as expectativas com base na elevação, latitude, cobertura do dossel), um organismo pode exigir mais ou menos de uma hora em um banho de água gelada para entrar em coma frio. O tamanho do organismo também pode afetar o tempo necessário para entrar em coma frio. É fundamental encontrar o tempo de exposição a frio necessário para induzir um coma frio (não se movendo), mas não matar espécies focais. O tempo necessário para induzir um coma frio dependerá do tamanho, localização e histórico/comportamento natural dos indivíduos. Com base nos resultados do experimento de choque frio descrito aqui e usando o conhecimento da ecologia dos insetos focais, escolha um tempo para concluir o ensaio se um determinado indivíduo não fizer uma recuperação completa.

Com base nas questões específicas do pesquisador, esse método pode ser empregado tanto no campo quanto no laboratório para permitir a variação ambiental natural e o controle de variáveis importantes, respectivamente. Este ensaio é simples e barato e ajuda a preencher lacunas existentes no campo da fisiologia térmica. A facilidade deste protocolo torna acessível empregar para uma variedade diversificada de taxas, abrindo o campo para organismos mais do que amigáveis ao laboratório. A novidade da realização de um ensaio térmico padronizado, porém ambiente, preenche a lacuna entre os resultados laboratoriais e de campo²². Aproveitar as condições ambientais para a recuperação do organismo ajudará os pesquisadores a dividir o papel dos fatores ambientais e de espécies na fisiologia^14,22. Finalmente, devido ao seu baixo custo e falta de materiais necessários, este protocolo pode ser usado em locais remotos no campo com pouco equipamento ideal para muitos biólogos de campo - bem como em salas de aula para permitir aos jovens estudantes uma experiência prática de aprendizagem.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.