Test di fisiologia termica sul campo: recupero degli shock freddi in condizioni ambientali

Riepilogo

Qui, viene descritto un protocollo accessibile a basso costo per valutare il recupero degli shock freddi delle farfalle in condizioni ambientali ambientali.

Abstract

La fisiologia ecologica, in particolare degli ectotermi, è sempre più importante in questo mondo che cambia in quanto utilizza misure di specie e tratti ambientali per esplorare le interazioni tra gli organismi e l'ambiente circostante per comprenderne meglio la sopravvivenza e la forma fisica. I test termici tradizionali sono costosi in termini di tempo, denaro e attrezzature e sono quindi spesso limitati a piccole dimensioni del campione e poche specie. Presentato qui è un nuovo protocollo che genera dati dettagliati sul comportamento individuale e la fisiologia di insetti terrestri grandi, volant, utilizzando l'esempio delle farfalle. Questo documento descrive i metodi di un saggio di recupero degli urti freddi che può essere eseguito sul campo in condizioni ambientali ambientali e non richiede costose attrezzature di laboratorio. Questo metodo è stato utilizzato per comprendere la strategia di risposta e recupero allo shock freddo delle farfalle tropicali, generando dati di livello individuale in intere comunità di farfalle. Questi metodi possono essere utilizzati sia in contesti di campo remoto che in classe e possono essere utilizzati per generare dati fisiologici ecologicamente rilevanti e come strumento didattico.

Introduzione

L'integrazione della fisiologia termica e dell'ecologia tra la fine degli anni '70 e l'inizio degli anni^{'80 1,2 ha} lanciato il campo della fisiologia ecologica. Ampi studi termici condotti su ectotermi evidenziano sinergie eco-fisiologiche in diversi contesti eco-evolutivi^3,4,5. La ricerca sulla fisiologia termica degli organismi ectotermici ha recentemente ripreso l'attenzione di fronte ai cambiamenti climatici e ai paesaggi termici alterati in^{tutto il mondo 6,7}. Oltre a informare gli studi nel campo accademico della fisiologia ecologica, i test di fisiologia termica possono essere ampiamente accessibili ai ricercatori e possono servire come approccio didattico pratico per tutti i livelli. I componenti delle prestazioni termiche, inclusi i limiti termici e gli effetti degli shock di temperatura, sono fondamentali per l'ecologia, il comportamento e la storia della^{vita degli animali 8,9}.

In particolare, gli ecototermi sono usati per affrontare le questioni di fisiologia, poiché l'endotermia detta un legame inestricabile tra temperatura ambiente e temperatura corporea. L'intervallo di temperatura che gli organismi possono sopportare (il loro minimo termico critico fino all'intervallo massimo termico) e le temperature alle quali i loro comportamenti e la loro forma fisica sono massimizzati (optima termica) sono spesso radicati nei processi ecologici ed evolutivi. Questi tratti fisiologici sono sempre più importanti in quanto le temperature, sia medie che estreme, stanno aumentando^{di 10}. Ad esempio, i cambiamenti abiotici, compresi gli aumenti di temperatura, che accompagnano la distruzione e la frammentazione dell'habitat hanno colpito comunità di ectotermi, compresi gli anurani, limitando le specie fisiologicamente fragili (con stretta tolleranza termica) alle piccole macchie dell'habitat residuo^11,12.

La valutazione dei componenti chiave delle prestazioni termiche può essere costosa sia in termini di tempo che di risorse e tradizionalmente richiede attrezzature di laboratorio e condizioni standardizzate. Inoltre, i saggi convenzionali spesso non riflettono l'ampiezza delle condizioni ambientali vissute in natura da un dato animale¹³ poiché la temperatura in esperimenti di fisiologia simili è attentamente controllata e spesso non correlata alle condizioni ambientali vissute da un animale. Questo controllo della temperatura può diminuire la comprensione della variazione nelle singole^{risposte 2,14}. I fisiologi si sono affidati a esperimenti di riscaldamento e raffreddamento basati su laboratorio, utilizzando bagni d'acqua programmabili per riscaldare o raffreddare costantemente l'ambiente di un animale per informare le curve di^{prestazione termica 15}.

Tipicamente, gli animali vengono collocati in fiale con una termocopia e la loro temperatura ambiente viene cambiata costantemente controllando la temperatura del bagno d'acqua circostante. I ricercatori misurano il tempo necessario per raggiungere uno stato fisiologico alterato (ad esempio, coma freddo, knockdown) e la temperatura alla quale si è verificato il cambiamento di stato^16,17. A partire da un minimo di $ 500 USD, questi strumenti sono grandi, pesanti e richiedono attrezzature tecniche aggiuntive (ad esempio, computer, termoaccoppie). Di conseguenza, gli strumenti di base per effettuare metodi classici di valutazione delle prestazioni termiche non sono 1) economicamente accessibili a tutti, 2) non adatti per il dosaggio di animali troppo grandi per essere contenuti nelle fiale abituali utilizzate per i piccoli ditteri e 3) non portatili per l'uso in ambienti di campo remoti. L'adesione alla pratica comune ha portato a una rappresentanza limitata tra tassonomia e condizioni^{sperimentali 18,19,20}.

Mentre curve complete di prestazioni termiche possono informare la distribuzione delle specie, i tratti della cronologia della vita e il comportamento, tra gli altri tratti, la quantificazione di metriche termiche sempre più semplici può essere più efficiente e comunque estremamente informativa. I test fisiologici, la misurazione dell'insorgenza del coma freddo e il successivo recupero degli shock freddi, l'indurimento a freddo e il comportamento di adeggio, sono proxy efficaci ed eseguibili per il minimo termico critico^{di un organismo 8}. Descritto qui è un saggio di shock freddo utile per ottenere dati fisiologici da grandi insetti ectotermici terrestri. Il test è conveniente, accessibile e facile da eseguire in condizioni di campo o in classe. I dati sul recupero degli shock a freddo generati da questo protocollo possono essere abbinati a dati sulle specie o sui tratti a livello individuale per perseguire domande riguardanti la fisiologia ecologica e / o utilizzati per insegnare agli studenti i principi fisiologici.

Protocollo

1. Identificazione delle specie di interesse

1. Identificare le specie di interesse per determinare i tempi di recupero degli shock freddi. Tieni presente che ogni gruppo differirà nel tempo necessario per indurre un coma freddo (cioè il punto in cui l'insetto è ancora vivo, ma non si muove e non risponde). Allo stesso modo, in base all'organismo e all'uso dei dati, scegliere diversi punti di taglio in cui interrompere l'esperimento se l'individuo o i singoli focali non volano (vedere sezione 4).
   NOTA: Questo protocollo è stato progettato e sviluppato per l'uso su Lepidoptera. Tuttavia, è applicabile agli insetti terrestri grandi, volant, in particolare quelli che possono essere conservati piatti in buste vetrose che limitano il movimento e i danni (ad esempio, farfalle e libellule / damselflies).

2. Condurre un preprocesso

1. Condurre un preprocesso su un piccolo campione di individui per determinare i parametri chiave. Seguire le sezioni da 3 a 5 del protocollo sottostante con 5-10 persone per un preprocesso.
   1. Testare il tempo richiesto sul ghiaccio per indurre un coma freddo (non in movimento), ma non uccidere la specie focale seguendo il passaggio 5.1 utilizzando trattamenti di 30 min, 60 min e 90 min.
      NOTA: Il tempo necessario per indurre un coma freddo dipenderà dalle dimensioni, dalla posizione e dalla storia / comportamento naturale degli individui.
   2. Sulla base dei risultati dei passaggi 4.1-4.4 e utilizzando la conoscenza dell'ecologia degli insetti focali, scegli un momento in cui concludere lo studio se un dato individuo non fa un pieno recupero. Basa questa volta anche sull'ecologia della specie, tenendo presente che dopo molti minuti di incapaci di volare, molti insetti sono prima.
      NOTA: Ad esempio, se la maggior parte delle prove preliminari termina in volo dopo 15 minuti, si potrebbe decidere di terminare le prove dopo 25 minuti per garantire che anche gli outlier abbiano la possibilità di riprendersi completamente (cioè volare). Questo protocollo si basa su un tempo di taglio di 30 minuti (passaggio 5.4).
2. Utilizzare i parametri dei dati preprocessali per informare la raccolta dei dati per gli esperimenti. Modificare il protocollo descritto di seguito in base alle esigenze degli organismi focali, incluso il tempo nei liquami di ghiaccio, il momento in cui chiamare le prove fino alla fine e i comportamenti documentati sulla scheda tecnica (ad esempio, il brivido può essere un comportamento inappropriato per l'insetto di scelta).
   1. Definire domande di ricerca specifiche a cui rispondere con questi dati, affinando al contempo i parametri.
      NOTA: Ad esempio, se il ricercatore è interessato all'effetto di un'esposizione prolungata sul recupero, il tempo nel ghiaccio è una variabile chiave da modificare. Se i ricercatori sono interessati alle differenze di fisiologia tra specie di colore chiaro e scuro, possono scegliere due specie distintamente colorate o modificare il colore delle ali dell'insetto per misurare l'effetto del colore delle ali sul tempo di recupero. È importante sottolineare che questo metodo è altamente personalizzabile in base alle esigenze e alle domande di ricerca poste (vedi la sezione di discussione).

3. Raccolta di insetti

1. Raccogliere gli insetti con metodi appropriati come trappole esche e reti entomologiche (Figura complementare 1). Al momento della raccolta, posiziona ogni individuo in una busta di vetro separata con un ID univoco.
2. Conservare gli animali in un luogo ombreggiato e fresco dopo essere stati catturati e prima dell'esposizione all'esperimento dello shock freddo. Esporre sempre l'animale al trattamento sperimentale entro 24 ore dall'essere catturato e standardizzare questa volta il più possibile durante gli studi.
   1. Sebbene le condizioni di conservazione possano variare, tenere gli insetti fuori dal sole diretto. Se possibile, posizionali al chiuso in una stanza fresca e buia.
   2. Sul campo, assicurati che vengano ombreggiati mentre sono conservati e siano protetti dal vento (che soffia via) e da altri predatori di insetti che possono entrare nelle buste.

4. Impostare l'esperimento dello shock freddo

1. Riempire un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio e acqua. Assicurarsi che vi sia ghiaccio sufficiente per persistere per almeno un'ora e aggiungere periodicamente ghiaccio se necessario con l'obiettivo di mantenere l'ambiente nell'acqua a 0 °C.
2. Scegli tra 1 e 4 individui focali per un ciclo di sperimentazione, assicurandoti che ogni individuo sia identificabile.
   1. Se si utilizzano più specie, utilizzare solo una di ciascuna per evitare di confondere gli individui nel foglio dati. Se si sperimenta con una sola specie, utilizzare solo individui che possono essere facilmente distinti, ad esempio da un'ala rotta o da una marcatura distinta.
   2. Se l'obiettivo dell'esperimento non è correlato alla colorazione delle ali, contrassegnare le ali con ID univoci (ad esempio, numeri) con un marcatore a punta di feltro fine per distinguere gli individui.
   3. Se gli esperimenti non soddisfano nessuno dei criteri di cui sopra, condurre l'esperimento su un individuo alla volta.
3. Popolare le righe della scheda tecnica con le informazioni pertinenti a ciascun insetto analizzato, compreso il loro ID univoco e un identificatore utile nelle note, ad esempio il nome della specie o il carattere distintivo (tabella complementare 1).
4. Mettere tutti gli individui focali (ancora nelle loro buste contrassegnate individualmente) in un sacchetto di plastica sigillato con un peso(Tabella dei materiali)e mettere il sacchetto in acqua ghiacciata per 60 minuti (o fino a quando non è stato indotto il coma freddo; vedi discussione)(Figura complementare 2).
   1. Assicurarsi che il peso sia pesante (ad esempio, monete di grandi dimensioni, grandi rondelle o rocce lisce) e abbastanza grande da mantenere il sacchetto di insetti immerso nell'acqua ghiacciata e perpendicolare alla superficie dell'acqua. Utilizzare un peso che non causi perdite nel sacchetto di plastica sigillato.
      NOTA: Mentre gli insetti sono ancora in grado di riprendersi se sono esposti direttamente all'acqua mentre sono sommersi, le buste bagnate complicano la rimozione di ogni individuo. È meglio mantenere gli insetti asciutti nella loro borsa.
5. Registrare i dati di temperatura e luce.
   1. Utilizzare un registratore di dati (vedere la tabella dei materiali) per registrare la temperatura ambiente e i dati leggeri utilizzando il passaggio 5.1 o 5.2.
      1. Programma il data logger per raccogliere dati di temperatura e luce a intervalli di 10 s, a partire dal momento in cui gli insetti verranno rilasciati.
      2. Basare l'ora di inizio del data logger su quando gli insetti sono stati collocati nell'acqua ghiacciata. Assicurarsi che le informazioni sul data logger (data, ora) siano sincronizzate in modo che i dati sulle condizioni ambientali possano essere successivamente abbinati a ogni singolo insetto focale.
   2. Utilizzare un semplice termometro per registrare a breve distanza i dati di temperatura e luce (da un secondo ricercatore).
      1. Decidere i parametri sperimentali da associare al tempo di recupero che può essere misurato senza un data logger. Utilizzare trattamenti distinti: ombra/sole; crepuscolo/ mezzogiorno.
6. Posizionare una gabbia a rete per gli insetti in un luogo appropriato in modo che la temperatura e gli ambienti luminosi siano il più omogenei possibile all'interno della gabbia e che la base della gabbia sia elevata e possa essere sfruttata dall'osservatore.
7. Posizionare il data logger appena fuori dalla gabbia o all'interno della gabbia in modo che non venga rovesciato o altrimenti influenzato da piccoli movimenti all'interno della gabbia. Se non si utilizza un data logger, posizionare un termometro in modo appropriato e/o impostare le gabbie nella configurazione appropriata.
   NOTA: Il data logger deve essere posizionato in modo che le condizioni ambientali registrate siano il più vicino possibile a quelle che l'insetto sta vivendo.

5. Inizia l'esperimento di shock freddo

1. Rimuovere gli animali dal bagno d'acqua ghiacciata dopo 60 minuti (o tempo determinato appropriato; vedi sopra). Rimuovere immediatamente gli insetti dal sacchetto di plastica e rimuovere ogni individuo dalla busta il più rapidamente possibile riducendo al minimo la manipolazione (Figura complementare 3).
2. Avviare il cronometro non appena gli animali si trovano nelle gabbie a maglie (cfr. dati di esempio, tabella complementare 1).
3. Tocca la base della gabbia con una matita per agitare gli insetti in recupero.
   NOTA: Fornire stimoli durante il recupero assicura che gli insetti focali dimostrino lo stato e i comportamenti di recupero non appena sono fisiologicamente capaci(Video supplementare).
   1. Tocca spesso e con sufficiente forza per assicurarti che un animale risponda se possibile, ma non causi una risposta.
      NOTA: Ad esempio, quando si tocca la gabbia, se un animale viene catapultato in aria e atterra in posizione eretta, ma non si muove per stare da solo, questo non è considerato un comportamento "stand", in quanto l'organismo non si è effettivamente alzato da solo.
4. Contrassegnare la prova come completata una volta che un individuo ha volato (cioè, mostrato un recupero completo). Termina lo studio e considera che l'insetto abbia raggiunto un recupero completo se non si muove dopo 30 minuti.
5. Rimuovere gli insetti dalla gabbia a rete e riposizionare gli individui nelle loro buste di vetro etichettate. Libera gli animali o conservali per un'ulteriore raccolta dei dati (ad esempio, tratti individuali di dimensioni, peso).
6. Se si utilizza un data logger, interrompere la raccolta dei dati del data logger e salvare il file di dati di temperatura e luce durante l'esperimento con informazioni di data/ora appropriate.

6. Trattamento dei dati

1. Immettere i dati presentati dal foglio dati in un foglio di calcolo (ad esempio, MS Excel).
2. Se si utilizza un data logger, aggiungere dati di temperatura e luce per ogni risposta di ogni singolo test.
   1. Calcola la deviazione media e standard della temperatura e della luce per ogni comportamento di ogni individuo.
      NOTA: Poiché il data logger registra i dati ogni 10 s, se il comportamento dello stand per un animale ha richiesto 48 s, utilizzare le prime 5 voci dal data logger per quella prova.
   2. Associare ogni comportamento di recupero di ogni individuo a dati abiotici registrati dal datalogger, arrotondando per l'alto o per il basso a intervalli di 10 s, se necessario.
3. Tracciare e analizzare i dati. La figura 1, ad esempio, visualizza l'effetto della temperatura e della luce sui tempi di recupero degli urti freddi. Compilare altri dati rilevanti (tratti delle specie, caratteristiche dell'habitat regionale) per esaminare i modelli ecologici ed evolutivi nei tratti fisiologici dei gruppi testati.
   NOTA: la figura 1 è stata tracciata utilizzando il pacchetto ggplot2 in R. Il livello di dettaglio dei dati sulle condizioni ambientali sarà diverso in base agli strumenti utilizzati per misurare le condizioni ambientali. Se si utilizza un data logger, è possibile generare cifre con dettagli paragonabili alla figura 2. Se viene utilizzato un termometro, il ricercatore non sarà in grado di creare un grafico informato dalla luce ambientale. Allo stesso modo, se i ricercatori usano categorie di luce o temperatura, questi scatterplot possono essere modificati in boxplot o in un altro modello appropriato per illustrare questi fenomeni.

Risultati

I dati raccolti in questo protocollo consentono l'esame e la partizionamento di variabili importanti per la fisiologia organismica. Ad esempio, sia la temperatura che le condizioni di luce contribuiscono al recupero delle farfalle dagli urti freddi (Figura 1). La trama ha lo scopo di esplorare l'interazione tra le condizioni ambientali e il recupero degli shock freddi. Utilizzando farfalle catturate dalla natura sia da trappole che da reti, 181 specie di farfalle hanno dimostrato un netto recupero dal coma freddo indotto dallo shock freddo(figura 2). I dati presentati nella figura 2 sono stati raccolti da tre osservatori nell'corso di circa cinque mesi (gennaio, febbraio, maggio-luglio 2020) nelle Ande colombiane. Gli esperimenti sono sempre stati condotti la mattina dopo la raccolta delle farfalle. Con la massima efficienza, due osservatori hanno permesso di osservare simultaneamente quattro farfalle ciascuna, ripetute sette volte (minimo 7,37 ore), con il risultato di testare 56 individui in una sola mattina. Ciò ha permesso una grande quantità di raccolta di dati in intere comunità di farfalle, includendo e considerando i dati sulle variazioni individuali. I saggi possono verificarsi in condizioni ambientali ambientali, le condizioni di recupero sono rappresentative dei loro habitat e riflettono la variazione naturale sperimentata dagli organismi in natura. La figura 3 illustra la sovrapposizione tra la temperatura e le condizioni di luce dell'esperimento di recupero degli shock freddi e le condizioni in un pascolo da cui sono state raccolte alcune farfalle testate.

Figura 1: Scatterplot del tempo di recupero (in secondi) delle farfalle dopo shock freddo. (A) Temperatura media e (B) lux medio (intensità luminosa) durante il loro recupero. Le specie sono organizzate e colorate da Family. Nel complesso, con l'aumento della luce e della temperatura, il tempo di recupero degli shock freddi diminuisce, mostrando variabilità tra i taxa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio di risultati del saggio di recupero degli shock freddi su 181 specie di farfalle delle Ande colombiane. I dati rappresentano il numero di secondi trascorsi dalla rimozione della farfalla dal freddo e quando è stata in grado di volare. Le specie sono organizzate e colorate da Family. Questa figura dimostra l'ampiezza tassonomica attraverso la quale questo esperimento può essere applicato con successo e la varietà di risposte di recupero degli shock freddi tra le specie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Temperatura ambiente e LUX durante le prove di recupero degli shock a freddo. Grafico della temperatura ambiente (blu) e LUX (intensità della luce, rosso) registrato dai registratori di dati collocati nei pascoli in cui si è svolta la raccolta delle farfalle (colori chiari, condizioni per l'intera giornata) e condizioni durante le prove di recupero degli shock freddi (colori scuri, solo ore del mattino). Le condizioni del campo ambientale e le condizioni sperimentali tracciate mostrano la gamma e le condizioni medie vissute dalle farfalle nell'oltre una settimana di campionamento e sperimentazione sul campo. Gli esperimenti sono stati condotti solo nelle prime ore (07:00-13:00 h), mentre i datalogger sono stati distribuiti sul campo per una settimana (ore diurne, 06:00-18:00 h mostrate). Qui è mostrata la sovrapposizione tra le condizioni sperimentali e le condizioni ambientali vissute dalle farfalle, dimostrando la rilevanza ecologica di condurre test di fisiologia in condizioni ambientali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 1: Procedura per la raccolta degli insetti focali-in questocaso farfalle-con trappolead esca Van-Someren e rete attiva. Le trappole erano esche con pesci in decomposizione e esche di frutta in decomposizione. Trappola (senza esca) sullo sfondo, in primo piano c'è un esemplare nella sua busta unica contro una scatola di raccolta di plastica blu. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura complementare 2: Sacchi con un massimo di quattro farfalle singole immerse nell'acqua ghiacciata in un dispositivo di raffreddamento. I sacchetti di plastica erano contrassegnati con il tempo in cui venivano collocati nell'acqua ghiacciata, in modo che gli esperimenti di shock freddo potessero essere scaglionato per tutta la mattinata. I sacchetti di plastica devono essere sigillati per evitare che i campioni si bagnino; tuttavia, l'inondazione delle borse e della busta in questo caso non ha avuto alcun effetto misurabile sul recupero delle farfalle. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura complementare 3: Due osservatori raccolgono dati sul campo. Ogni gabbia a rete contiene quattro farfalle uniche che si riprendono dallo shock freddo. Il polivinil cloruro T-joint nella gabbia ospita il data logger per prevenire l'esposizione diretta al sole o alla pioggia. Ogni osservatore ha un cronometro che è stato avviato immediatamente dopo il rilascio della farfalla nella gabbia. Le gabbie sono elevate da panchine, permettendo agli osservatori di agitare la base della gabbia per garantire che le farfalle rispondessero comportamentalmente il più rapidamente fisiologicamente possibile. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella complementare 1: scheda tecnica di esempio. Il foglio mostra l'ID univoco di ogni farfalla assegnato nel campo e i caratteri distintivi (nome della specie, colori chiave) nelle note. È anche registrata la posizione dominante della farfalla (cioè quale lato dell'ala è stato esposto al sole) durante il periodo di recupero, nota come D (dorsale) o V (ventrale). Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Video supplementare 1: Maschiatura della gabbia per il recupero degli urti freddi. Mentre le farfalle si riprendono, l'osservatore tocca delicatamente la base della gabbia per indurre comportamenti non appena le farfalle sono in grado. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Lo studio della fisiologia termica incorpora misure di specie e tratti ambientali per comprendere meglio le interazioni tra gli organismi e l'ambiente circostante che sono fondamentali per la sopravvivenza e la forma fisica. Pur essendo sempre parte integrante della comprensione della storia naturale e dell'ecologia di piante e animali, i tratti termici sono sempre più importanti di fronte al paesaggio e ai cambiamenti^{climatici 11,21}. Diversi gruppi di insetti terrestri ectotermici, in particolare i lepidotteri e l'odonatano, sono relativamente grandi e abbondanti, mostrano comportamenti distinti e sono suscettibili di manipolazione. Qui è delineato un saggio efficiente e a basso costo per misurare efficacemente le risposte fisiologiche di tali insetti. Questo protocollo richiede una fonte di organismi sani per il test, il cui tempo di manipolazione prima dell'esperimento è limitato. Sebbene flessibile nel numero di organismi saggiati contemporaneamente, il numero di individui focali per esperimento varierà in base allo scopo della raccolta dei dati e/o al numero di osservatori.

Ad esempio, questo protocollo è stato sviluppato per raccogliere dati individuali dettagliati sulle farfalle in intere comunità. Pertanto, i risultati rappresentativi illustrano uno sforzo per massimizzare la raccolta di dati per individui di quante più specie possibile e in una varietà di condizioni rilevanti per l'ambiente locale. Indipendentemente dal numero di specie focali, è fondamentale che l'osservatore sia in grado di identificare ogni individuo nella gabbia che sperimenta il recupero. Se l'obiettivo è quello di raccogliere dati da una sola specie, solo uno o due individui (se identificabili in base all'usura diversa delle ali o se contrassegnati individualmente) devono essere saggiati contemporaneamente. Le materie di studio devono essere scelte in base a una specifica domanda di ricerca o piano di studio. In base alla domanda posta e allo scopo della raccolta dei dati (ricerca o classe, ad esempio), le dimensioni del campione e la raccolta di altri tratti differiranno.

Per illustrare le componenti fondamentali della fisiologia chiarite da questo protocollo (induzione del coma freddo, fasi di recupero, ruolo delle condizioni ambientali), un istruttore di classe può scegliere due specie distinte o morfi di una singola specie. Se gli individui focali differiscono solo in un tratto chiave (ad esempio, il colore), sarà necessaria una dimensione del campione più piccola e gli studenti possono studiare da vicino la relazione di quel tratto e la fisiologia dell'organismo. I ricercatori interessati alla fisiologia ecologica possono utilizzare i loro dati sperimentali per esplorare complesse questioni ecologiche ed evolutive. I ricercatori devono essere sicuri di scegliere attentamente gli insetti focali che affrontano direttamente le loro domande (ad esempio, in base alla fase della vita, all'età, al sesso, alla posizione) e, in base al numero di variabili coinvolte, determinare la dimensione del campione appropriata. Le dimensioni del campione per i modelli complessi saranno maggiori di quelle sopra descritte.

Durante la raccolta dei dati di recupero comportamentale, è fondamentale che la gabbia si riposi dal suolo perché l'osservatore deve essere in grado di toccare il fondo della gabbia per suscitare comportamenti di recupero. Ciò garantisce che l'organismo risponda (sta in piedi, vola) non appena è fisiologicamente in grado di farlo e il comportamento di recupero terminale (volo) è documentato. La registrazione delle condizioni ambientali durante il recupero degli shock freddi è parte integrante dello studio della fisiologia termica, in quanto questo protocollo è progettato per studiare e districare il ruolo dell'ambiente nella fisiologia organismica. I registratori di dati (vedi tabella dei materiali) sono utili per registrare misure standardizzate delle condizioni rilevanti (ad esempio, temperatura, luce e persino umidità). Tuttavia, se questi strumenti non sono disponibili, le condizioni rilevanti possono essere misurate in altri modi come con un termometro digitale o semplificando la variabile delle condizioni ambientali e utilizzando ambienti distinti come ombra e sole. Questo protocollo offre al ricercatore opzioni per misurare le condizioni durante il recupero degli shock a freddo in base allo scopo e alla portata dello studio.

Sebbene questo metodo possa essere modificato per adattarsi meglio a specifici gruppi tassonomici, si raccomanda di utilizzare insetti grandi e volant. Gli insetti volanti che riacquistano la loro capacità di volare in modo indipendente possono essere considerati come aver compiuto un pieno recupero. Il metodo, come descritto, è stato utilizzato con successo sulle farfalle nei tropici e subtropicali. In base alle tendenze termiche di una data area (cioè, la gamma di temperature sperimentate in un sito che varierà, influenzando così le aspettative in base all'elevazione, alla latitudine, alla copertura del baldacchino), un organismo può richiedere più o meno di un'ora in un bagno d'acqua ghiacciata per entrare in coma freddo. La dimensione dell'organismo può anche influenzare il tempo necessario per entrare in coma freddo. È fondamentale trovare il tempo di esposizione al freddo necessario per indurre un coma freddo (non in movimento), ma non uccidere le specie focali. Il tempo necessario per indurre un coma freddo dipenderà dalle dimensioni, dalla posizione e dalla storia / comportamento naturale degli individui. Sulla base dei risultati dell'esperimento di shock freddo descritto nel presente documento e utilizzando la conoscenza dell'ecologia degli insetti focali, scegliere un momento in cui concludere lo studio se un dato individuo non fa un pieno recupero.

Sulla base delle domande specifiche del ricercatore, questo metodo può essere utilizzato sia sul campo che in laboratorio per consentire sia variazioni ambientali naturali che controlli per variabili importanti, rispettivamente. Questo saggio è semplice ed economico e aiuta a colmare le lacune esistenti nel campo della fisiologia termica. La facilità di questo protocollo lo rende accessibile da utilizzare per una vasta gamma di taxa, aprendo il campo a organismi più che amichevoli per il laboratorio. La novità di eseguire un saggio termico standardizzato ma ambientale colma il divario tra risultati di laboratorio e di campo^22. Sfruttare le condizioni ambientali per il recupero degli organismi aiuterà i ricercatori a dividere il ruolo dei fattori ambientali e delle specie nella^{fisiologia 14,22}. Infine, a causa del suo basso costo e della mancanza di materiali richiesti, questo protocollo può essere utilizzato in luoghi remoti sul campo con poche attrezzature ideali per molti biologi sul campo e in classe per consentire ai giovani studenti un'esperienza di apprendimento pratica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.