Um método para preservar raízes úmidas e rizosferas para imagem elementar

Resumo

Descrevemos um protocolo para amostrar, preservar e seção de raízes intactas e o solo circundante da rizosfera de ambientes pantanosos usando arroz(Oryza sativa L.) como espécie modelo. Uma vez preservada, a amostra pode ser analisada utilizando técnicas de imagem elementar, como a fluorescência química de raios-X síncrotron (XRF).

Resumo

As raízes interagem extensivamente com seu ambiente de solo, mas visualizar tais interações entre raízes e a rizosfera circundante é um desafio. A química da rizosfera das plantas úmidas é particularmente desafiadora de capturar por causa de gradientes de oxigênio íngremes das raízes para o solo a granel. Aqui é descrito um protocolo que preserva efetivamente a estrutura radicular e a química da rizofera de plantas úmidas através do congelamento de slam e secagem congelante. O congelamento de slam, onde a amostra é congelada entre blocos de cobre pré-resfriados com nitrogênio líquido, minimiza danos radiculares e distorção amostral que pode ocorrer com o congelamento de flash, minimizando ainda as alterações de especiação química. Embora a distorção da amostra ainda seja possível, a capacidade de obter várias amostras rapidamente e com custo mínimo aumenta o potencial de obter amostras satisfatórias e otimiza o tempo de imagem. Os dados mostram que este método é bem sucedido na preservação de espécies reduzidas de arsênico em raízes de arroz e rizosferas associadas a placas de ferro. Este método pode ser adotado para estudos de relações entre plantas e solo em uma ampla variedade de ambientes pantanosos que abrangem a concentração que abrange desde o ciclismo de elementos até aplicações de fitoremediação.

Introdução

As raízes e suas rizosferas são dinâmicas, heterogêneas e criticamente importantes para entender como as plantas obtêm nutrientes minerais e contaminantes^1,2,3. As raízes são o caminho primário pelo qual nutrientes (por exemplo, fósforo) e contaminantes (por exemplo, arsênico) se movem do solo para as plantas e, assim, entender esse processo tem implicações para quantidade e qualidade dos alimentos, funcionamento do ecossistema e fitromediação. No entanto, as raízes são dinâmicas no espaço e no tempo crescendo em resposta às necessidades de aquisição de nutrientes e muitas vezes variam em função, diâmetro e estrutura (por exemplo, raízes laterais, raízes aventurárias, cabelos radiculares)². A heterogeneidade dos sistemas radiculares pode ser estudada em escalas espaciais, do celular ao nível do ecossistema e em escalas temporais, de hora em hora para decadal. Assim, a natureza dinâmica e heterogênea das raízes e seu solo circundante, ou rizosfera, coloca desafios para capturar a química da rizosfera ao longo do tempo. Apesar desse desafio, é imprescindível estudar raízes em seu ambiente de solo para caracterizar essa relação crítica entre plantas e solo.

A química da rizosfera das plantas úmidas é particularmente desafiadora de investigar por causa de gradientes de oxigênio íngremes que existem do solo a granel para as raízes, que mudam no espaço e no tempo. Como as raízes precisam de oxigênio para respirar, as plantas úmidas adaptaram-se às baixas condições de oxigênio dos solos pantanosos, criando o aerenchyma^4,5. Aerenchyma são tecidos cortical ocos que se estendem de brotos até raízes, permitindo a difusão do ar através da planta para as raízes. No entanto, parte desse ar vaza para a rizosfera em partes menos suberizadas das raízes particularmente perto de junções laterais radiculares, pontas radiculares menos maduras e zonas de alongamento^6,7,8,9. Essa perda de oxigênio radial cria uma zona oxidada na rizofera das plantas úmidas que afeta a rizosfera (bio-geo)química e é distinta do solo a granel reduzido^10,11,12. Para entender o destino e o transporte de nutrientes e contaminantes em rizosferas e raízes úmidas, é fundamental preservar o solo a granel quimicamente reduzido, a rizosfera oxidada e raízes de plantas úmidas para análise. No entanto, como o solo a granel contém constituintes reduzidos do solo que são sensíveis ao oxigênio, os métodos de preservação das raízes e do solo devem preservar estruturas radiculares e minimizar as reações sensíveis ao oxigênio.

Existem métodos para fixar tecidos vegetais e preservar a ultraestrutura para imagem, mas esses métodos não podem ser aplicados para preservar quimicamente raízes que crescem em solo pantanoso. Para investigações onde apenas a distribuição elementar dentro das células vegetais é desejada, as plantas são tipicamente cultivadas hidroponicamente e as raízes podem ser facilmente removidas da solução, fixadas sob substituição de congelamento e congelamento de alta pressão e seccionadas para uma variedade de aplicações de imagem, incluindo espectrometria de massa de íons secundários de alta resolução (nanoSIMS), microscopia eletrônica e análise de fluorescência de raios-X síncrotrons (S-XRF)^{análise 13, 14,15}. Para investigar a placa fe na parte externa das raízes úmidas, esses estudos hidropônicos devem induzir artificialmente a formação de placas fe na solução¹⁶, que não representa com precisão a heterogeneidade da distribuição e composição mineral da formação da placa fe e elementos associados no situ^17,18,19,20. Existem métodos para preservar o solo pantanoso e microrganismos associados com congelamento^21,mas é difícil obter raízes com essa técnica. Os métodos atuais para visualizar raízes crescendo no solo e sua química rizosférica consistem em dois tipos de medição primária: fluxos elementares e concentração elementar total (e especiação). O primeiro é tipicamente medido usando gradientes difusivos em filmes finos (DGT)^22,23,24, em que o solo é colocado em rizoboxes para apoiar o crescimento da planta em um ambiente de laboratório e elementos labile no solo difusos através de um gel em uma camada de ligação. Esta camada de ligação pode então ser imageda para quantificar os elementos labil de interesse. Esta técnica pode ilustrar com sucesso as relações entre raízes e a rizosfera^24,25,26,27, mas artefatos de limitação de raízes podem existir cultivando plantas em rizoboxes, e informações sobre o interior da raiz não são capturadas com DGT. Este último envolve a amostragem das raízes e da rizosfera, preservando a amostra e analisando diretamente a distribuição elementar em uma seção amostral. Para esta amostragem ambiental das raízes das plantas úmidas e sua rizosfera circundante, é necessário um manuseio cuidadoso de amostras para evitar artefatos da preparação da amostra.

Aqui é descrito um protocolo que preserva efetivamente estruturas radiculares e química da rizofera de plantas úmidas por meio do congelamento e congelamento da secagem. O congelamento de flash pode retardar drasticamente as transformações de solutos sensíveis ao oxigênio, mas pode danificar raízes e causar mobilização quando as amostras secam. No entanto, o congelamento de slam onde a amostra é congelada entre blocos de cobre pré-resfriados com nitrogênio líquido minimiza danos radiculares e distorção amostral²⁸. As amostras preservadas são então incorporadas em uma resina epóxi que preserva como especiação^20,29 e pode ser cortada e polida para imagens de raízes dentro de seu solo rizosfera. As amostras deste relatório foram analisadas por imagem de especiação química S-XRF após secção fina. No entanto, outras técnicas de imagem também poderiam ser usadas, incluindo espectrometria de massa de plasma acoplada indutivamente a laser (LA-ICP-MS), emissão de raios-X induzida por partículas (PIXE), espectrometria de massa de íons secundário (SIMS) e imagem de espectroscopia induzida por laser (LIBS).

Protocolo

1. Preparação de equipamentos de congelamento de slam

1. Coloque dois blocos de cobre (~5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontalmente dentro de um refrigerador limpo capaz de segurar nitrogênio líquido e despeje nitrogênio líquido suficiente para submergir os blocos. Uma vez que o borbulhante diminua, coloque dois espaçadores em cima de um bloco de cobre em cada extremidade.
   NOTA: A altura do espaçador determina a altura da amostra a ser congelada; este exemplo usa um espaçador de 2 cm para criar cubos de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm. O volume do nitrogênio líquido dependerá do tamanho do refrigerador. Este exemplo usa aproximadamente 1 L para aproximadamente 5 cubos em série.
   ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual adequados e ventilação, pois o nitrogênio líquido é um criogeno e um asfixiante.
2. Usando pinças e luvas criogênicas, levante-se o outro bloco de cobre em sua extremidade, para facilitar a recuperação quando a amostra estiver no lugar.

2. Coleta de amostras e slam-freezing

1. Extrair a planta desejada e a rizosfera do solo molhado usando uma pá e garantir que o buraco cavado seja muito maior do que o volume de raiz desejado. Coloque o solo e plante em um recipiente e coloque-o em um banco.
   NOTA: Todo o solo em vasos e a planta de um estudo de vaso também podem ser usados.
2. Determine a localização desejada do solo onde as raízes devem ser tomadas (ou seja, profundidade e proximidade com a filmagem). Corte o excesso de solo usando uma lâmina de aço, tomando cuidado para não perturbar o solo na área desejada. Quando a área desejada for atingida, corte um "cubo" raiz de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm e coloque imediatamente o cubo entre os dois espaçadores no bloco de cobre horizontal. Usando luvas criogênicas, pegue o bloco de cobre vertical e coloque-o em cima dos espaçadores para congelar o cubo de rizosfera.
3. Depois de borbulhar subsídios (~5 min), recupere o cubo de rizosfera congelado dos blocos de cobre e enrole dentro de um quadrado de folha de alumínio pré-rotulado. Marque a orientação do bloco na folha, se desejar. Coloque em um segundo recipiente de nitrogênio líquido até o armazenamento em um congelador de -80 °C.
4. Repita conforme necessário para obter o número desejado de cubos radiculares do local de campo ou do experimento. Certifique-se de que ambos os blocos de cobre têm tempo para esfriar entre as amostras.

3. Congelar e incorporar cubos de rizosfera

1. Prepare a secadora de congelamento de acordo com as instruções do fabricante. Tenha cuidado para garantir que tenha obtido a pressão e temperatura adequadas do vácuo antes de remover amostras do congelador de -80 °C.
2. Quando o secador congelado estiver pronto para receber amostras, coloque um cubo de rizosfera congelado dentro de um tubo limpo e lavado com ácido de 50 mL e cubra livremente com um lenço descartável limpo. Segure o lenço com um elástico. Repita conforme necessário para garantir um cubo por tubo.
   NOTA: Se a amostra for muito grande para um tubo, ela pode ser colocada diretamente no recipiente de secador congelado usando a folha de alumínio como porta-amostras.
3. Coloque tubos contendo amostras em recipientes de secador congelado e congele por vários dias. O tempo exato de secagem dependerá das propriedades do solo.
   NOTA: Armazene amostras secas no secador congelado ou em um desiccador para evitar a reidratação.
4. Use uma lâmina de aço para cortar cubos de solo secos ao tamanho para que eles se encaixem na forma desejada (por exemplo, a forma de 25 mm de diâmetro é ideal para a maioria das aplicações). Rotule cada forma, coloque os cubos de solo nas formas e coloque as formas dentro de um dessecador de vácuo.
5. Prepare o epóxi de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que o epóxi escolhido não esteja contaminado e não cause alterações de especiação dos elementos desejados ^20,29,30.
6. Use um conta-gotas para adicionar epóxi à forma de um lado do solo, até cobrir inteiramente a amostra. O solo escurecerá de cor enquanto o epóxi molha o solo.
   NOTA: Adicione o epóxi lentamente para permitir que o ar no solo escape.
7. Uma vez preenchidos formulários com epóxi, feche o desiccador de vácuo e ligue o vácuo. Dependendo da quantidade de ar presa no solo, mais epóxi pode precisar ser adicionado aos formulários periodicamente. Verifique o nível de epóxi a cada 30-90 min para as primeiras 1-4 h e adicione epóxi conforme necessário.
8. Remova a amostra do formulário uma vez que o epóxi tenha endurecido (~5 dias).

4. Cortar e seccionar os cubos da rizosfera

1. Corte a amostra usando uma serra molhada de precisão de lâmina de diamante. Corte as amostras em diferentes locais se não forem obtidas raízes no corte anterior.
2. Lixe manualmente as amostras cortadas com lixa progressivamente mais fina (por exemplo, 220, 500, 1000 e 1500 grãos) no lado cortado para ~30 s.
3. Realizar imagens superficiais das amostras utilizando técnicas como LA-ICP-MS.
   NOTA: Para preparar seções finas para S-XRF, envie as amostras para uma empresa capaz de preparar as seções finas (polimento lateral único ou duplo) ou siga os passos 4.4 - 4.6 conforme descrito abaixo.
4. Cole o lado da amostra desejado em um slide de quartzo usando super cola e deixe curar durante a noite.
5. Usando uma máquina de secção fina, corte o solo em lâminas até 2 mm de espessura e, em seguida, triture até a espessura desejada (tipicamente 30 μm). A superfície da amostra pode ser polida se desejar.
6. Realize imagens S-XRF das seções. Siga as etapas apropriadas na instalação síncrotron desejada e na linha de feixe para solicitar e utilizar o tempo de imagem.

Resultados

Este método permite a preservação de raízes e espécies químicas nas raízes e rizosfera das plantas úmidas e no solo a granel. Neste trabalho, o método foi utilizado para avaliar como especiação e co-localização com óxidos fe e mn e nutrientes vegetais na rizosfera do arroz(Oryza sativa L.). O arroz foi cultivado na Instalação RICE da Universidade de Delaware, onde 30 mesocosmos de arroz (2 m x 2 m, 49 plantas cada) são usados para cultivar arroz sob várias condições de manejo do solo e da ág...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo para obter solo a granel preservado + rizosferas de raízes vegetais úmidas usando uma técnica de congelamento de slam que pode ser usada para mapeamento de imagens elementares e/ou especiação química.

Existem vários benefícios deste método em relação aos métodos existentes. Em primeiro lugar, este método permite a investigação simultânea das raízes e das rizoferas circundantes. Atualmente existem métodos para preservar e quimicamente as raíz...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper blocks	McMaster Carr	89275K42
Diamond blade	Buehler	15 LC, 102 mm x 0.3 mm	operation speed: 225 rpm
Epoxy forms	Struers	40300085	FixiForm
Epoxy	Epotek	301-2FL
Superglue	Loctite	404
Thin sectioning machine	Buehler	PetroThin
Wet saw	Buehler	IsoMet 1000