Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

Resumo

O protocolo aqui apresentado descreve o uso do Spotiton, um novo sistema robótico, para entregar duas amostras de interesse em uma grade de nanofios que se misturam por um mínimo de 90 ms antes da vitrificação em criogen líquido.

Resumo

A captura de estados moleculares de curta duração desencadeada pelo encontro precoce de duas ou mais partículas interativas continua a ser um desafio experimental de grande interesse para o campo da microscopia crio-elétron (crio-EM). Foram desenvolvidas algumas estratégias metodológicas que suportam esses estudos "resolvidos no tempo", um dos quais, Spotiton-um novo sistema robótico, combina a dispensação de gotículas amostrais do tamanho de picoliter com controle temporal e espacial preciso. O fluxo de trabalho Spotiton resolvido com o tempo oferece uma abordagem exclusivamente eficiente para interrogar rearranjos estruturais precoces a partir do volume mínimo da amostra. Disparados de distribuidores piezoelétricos controlados independentemente, duas amostras pousam e se misturam rapidamente em uma grade EM nanofios enquanto mergulha em direção ao criógeno. Potencialmente centenas de grades podem ser preparadas em rápida sucessão a partir de apenas alguns microliters de uma amostra. Aqui, um protocolo passo-a-passo detalhado da operação do sistema Spotiton é apresentado com foco na solução de problemas específicos que surgem durante a preparação da grade.

Introdução

O potencial para que o crio-EM capture e revele estados conformacionais transitórios de proteínas na escala de tempo sub-segundo (crio-EM resolvido pelo tempo) foi realizado por vários grupos, começando por Berriman e Unwin¹ cuja técnica foi construída sobre o método padrão de congelamento de mergulho desenvolvido por Dubochet para a preparação das grades crio-EM². Eles adicionaram um atomizador logo acima do copo de criogen que usou gás nitrogênio comprimido para pulverizar uma névoa fina de uma segunda amostra em uma grade EM mergulhando contendo uma primeira amostra que havia sido aplicada e borrada em uma fina camada aquosa. Embora este sistema pudesse alcançar tempos de mistura tão baixos quanto 1 ms, ele ainda exigia a mancha manual da primeira amostra pelo usuário - uma tarefa tecnicamente desafiadora - e um volume relativamente alto da segunda amostra. Além disso, na prática, era difícil saber onde havia ocorrido a mistura das duas amostras, exigindo o uso de nanopartículas de ferritina como marcador fiduciário na amostra mista. Os esforços subsequentes de Howard White e colegas de trabalho melhoraram o controle e a reprodutibilidade dessa abordagem de mistura de pulverização, incorporando o controle computacional das etapas de mancha e pulverização^3,4. Para abordar o quão bem e onde as amostras se misturam, o mesmo grupo⁵ e outros^6,7,8,9,10 mudaram para uma abordagem de pulverização de mistura¹¹ em que duas amostras são misturadas em tubos capilares estreitos sob a pressão de bombas de seringa ou em chips microfabridados microfluidos conduzidos por gás nitrogênio. Esses sistemas de pré-mistura não só garantem a mistura completa, mas também permitem o ajuste fino dos tempos de mistura para aumentar a resolução de estudos resolvidos pelo tempo.

A introdução de distribuidores piezoelétricos como uma maneira alternativa de aplicar amostra às redes EM no sistema Spotiton permitiu tanto o direcionamento preciso da deposição amostral quanto a exigência de um volume amostral muito menor para fazer uma grade¹². Posteriormente, o uso de grades de nanofios e aplicação de amostra em rota ("spotting on-the-fly") removeu a necessidade de uma etapa de mancha e reduziu o vezes de aplicação para vitrificação^13,14. Para a nova abordagem para crio-EM resolvida pelo tempo descrita aqui, um segundo dispensador juntamente com os upgrades de hardware e software de controle necessários foram adicionados ao sistema Spotiton para permitir a entrega de uma segunda amostra em uma grade de nanofios móveis quase imediatamente após a deposição dos primeiros¹⁵. As duas amostras sobrepostas se misturam na grade, pois são perversas pelos nanofios em uma fina camada aquosa antes da vitrificação. Tempos de mistura tão baixos quanto 90 ms podem ser alcançados. Este protocolo pretende fornecer informações práticas sobre como realizar experimentos resolvidos com o tempo usando redes piezoelétricas e nanofios. Além disso, como o hardware e o software estão sendo modificados para melhorar a facilidade de uso, consistência e throughput, este protocolo também serve como uma descrição atualizada do método¹⁵relatado anteriormente .

Protocolo

1. Configure a máquina e o software Spotiton

1. Prepare o sistema para dispensar(Figura 1).
   1. Abra a válvula principal no tanque de suprimento de nitrogênio. Certifique-se de que o reservatório do sistema está cheio de água ultrapurada e desgaseada. Ligue o computador. Ligue o sistema Spotiton na tira de energia multioutlet.
   2. Clique no ícone da área de trabalho ( Figura2A) para abrir a interface do usuário (UI) do software Spotiton (Figura 2B). No menu Ferramentas, selecione Estágios de Inicialização para inicializar e abrigar os robôs de 3 eixos (estágio de grade e estágio pipeta) e o conjunto rotativo da cabeça do dispensador (estágio theta). Certifique-se de que as pontas do dispensador estão apontando para baixo antes da inicialização e do homing.
   3. Na janela principal, clique em Ir para o SafePosition para enviar os robôs para o SafePosition (Figura 3).
      NOTA: A mudança para o SafePosition pode ser feita com robôs em qualquer posição sem risco de colisão.
   4. Na guia Aspirar, selecione Prime para lavar as cabeças do distribuidor várias vezes com água do reservatório. Continue até que fluxos ininterruptos de água possam ser vistos emergindo das duas pontas.
      NOTA: Isso pode precisar ser repetido se um volume significativo de ar entrou nas linhas de fluido quando as pontas foram lavadas com metanol no último desligamento.
2. Inspecione o desempenho do dispensador
   1. Na guia Inspecionar, envie cada dica para a câmera de inspeção para testar a água de fogo e combine com o padrão de produção de gotículas dos dois distribuidores(Figura S1).
      NOTA: Se uma ponta não for acionada devido a uma bolha (Figura S2A) ou detritos, limpe as pontas da estação de lavagem(Figura S2B) usando a função Lavagem Ultrassônica acessada na guia Aspirar.
   2. Ajuste a amplitude de disparo (sem unidade) para cada dispensador e amostra para obter um fluxo de gotículas discretas de tamanho consistente.
   3. Confirme visualmente a produção equivalente de gotículas pelos dois distribuidores.
      1. Pressione o botão Gravar no monitor da câmera superior para gravar um vídeo de disparo da Ponta 1. Reprodução de volta o vídeo de Tip 1 disparando no monitor do lado direito ao mesmo tempo que a Ponta 2 é disparada no monitor da câmera superior(Figura S1).
         NOTA: Vídeos de cada disparo de ponta são gravados e armazenados.
   4. Os distribuidores estão prontos para testar o fogo em uma rede.
      NOTA: Este protocolo pressupõe que o alinhamento correto da grade e das etapas de pipeta em suas respectivas posições de mergulho tenha sido verificado. A não confirmação do alinhamento correto pode resultar em uma colisão, danificando as pontas ou os robôs.
3. Água de teste de fogo em uma rede.
   1. Certifique-se de que os robôs estão no SafePosition.
   2. Remova as pinças do suporte do robô da grade usando a chave Allen fornecida.
   3. Em uma bancada próxima, posicione uma grade de teste, lado nanofios para cima, na borda do bloco de grade. Pegue cuidadosamente a borda da grade, posicione corretamente na pinça(Figura S3)e remonte a pinça.
   4. Na aba Cryo, clique em Ponta para Câmera para mover as pontas para o campo de visão da câmera superior do caminho de mergulho(câmera superior). Ensure Live é selecionado no monitor da câmera superior, e a luz da câmera superior é ligada (discar na frente do gabinete da máquina (Figura 1).
   5. Monte a pinça no robô da grade. Posição Dica 1, visível no monitor da câmera superior, clicando no mouse dentro do monitor.
      NOTA: Apenas a Dica 1 será visível e se deslocará para o local do clique.
   6. Clique em Grade para Câmera para posicionar a grade na frente da câmera superior. Ajuste a posição da Ponta 1 como antes, se necessário.
   7. Escolha tip1, Tip2ou Tip1 e Tip2 para selecionar um ou ambos os distribuidores para testar o fogo.
      NOTA: Ao testar as pontas individualmente, use o mouse para posicionar a Ponta 1 no monitor da câmera superior em diferentes locais laterais da grade. Isso depositará listras líquidas das duas pontas em um padrão não sobreposto e permitirá que o usuário confirme que cada dica foi disparada.
   8. Na guia Cryo, certifique-se de que a Grade Vitrify não está selecionada, clique em Alvo de Fila, e depois em Mergulhar.
      NOTA: O estágio da pipeta subirá ligeiramente, seguido pelo estágio da grade. O robô de grade então mergulha a grade além dos distribuidores de disparo e câmeras superiores e inferiores, chegando a descansar logo acima do convés. Uma captura de imagem da câmera superior aparece acima de uma captura de imagem da câmera inferior no lado esquerdo da interface do usuário.
   9. Avaliar as imagens superiores e inferiores: Cada ponta disparou quando selecionado? Quando disparados juntos, o líquido das duas pontas se sobrepôs totalmente, criando uma listra visivelmente mais grossa do que quando disparado individualmente?
      1. Se qualquer ponta não disparar, realize um ou vários ciclos de lavagem ultrassônicos até que o disparo claro seja observado.
      2. Se as listras de amostra não se sobreporem totalmente, ajuste o alinhamento lateral de um dos distribuidores usando uma tecla Allen para girar o parafuso de ajuste lateral em um dos distribuidores de um quarto de curva, e realizar um mergulho de teste. Repita até que as listras se sobreponham completamente.
         NOTA: Se ambas as pontas forem disparadas com sucesso e como esperado, o sistema está pronto para preparar grades de amostra.

2. Preparem grades mistas de duas amostras

1. Atualize os valores de aceleração, desaceleração e velocidade no arquivo XML dos parâmetros da máquina para atingir o tempo de mistura de interesse.
   NOTA: As tabelas que correlacionam esses valores aos tempos de mixagem foram previamente relatadas¹⁵.
2. Prepare a amostra e as grades.
   NOTA: A partir deste ponto do protocolo, 20-30 min serão decorridos antes da primeira grade ser preparada, e as amostras devem ser mantidas a uma temperatura apropriada durante este intervalo de tempo.
   1. Diluir duas amostras (ou seja, proteína e ligante ou outro parceiro interagidor) para as concentrações desejadas com um buffer apropriado, idealmente, o mesmo para ambos.
      NOTA: As grades spotiton requerem concentrações 1,5-2 vezes maiores de proteína do que normalmente usadas para freezers de mergulho automáticos. Isso pode ser devido ao tempo mínimo que a proteína passa em uma fina camada aquosa na superfície da rede durante um mergulho, dando às partículas menos oportunidade de se concentrar na interface ar-água.
   2. Encha a tigela de criogen com nitrogênio líquido.
   3. Plasma limpo 3-4 grades de nanofios. Use 5 W, hidrogênio e oxigênio, 1,5 min como ponto de partida.
      NOTA: A duração e receita de limpeza plasmática mais eficaz podem mudar do dia-a-dia com base na temperatura e umidade ambiente e no lote de grades de nanofios utilizadas. Misturas alternativas de gás ou um descarregador de brilho também podem ser eficazes, mas não foram testadas para este fim. Como a água e a proteína na solução tampão são muitas vezes perversas em velocidades diferentes por nanofios, é melhor avaliar o pavimento das grades a serem usadas naquele dia em um mergulho no qual a amostra real é dispensada.
3. Defina o nível de umidade no sistema.
   NOTA: Além das condições utilizadas tanto para fazer quanto para limpar as grades, a umidade é outro fator primário que impacta a velocidade de pavio das grades de nanofios. Embora a umidade percentual-alvo para uma determinada sessão seja determinada empiricamente para cada dia e lote de grades, 90-95% é um bom ponto de partida.
   1. Certifique-se de que o nebulizador esteja suficientemente preenchido com água ultrapura. Conecte o nebulizador e observe a saída de vapor da porta central na tampa do nebulizador.
   2. Observe o monitor de umidade ao vivo na janela principal ou abra o rastreador de umidade ambiente sob relatórios | Ambiente (Figura S4). Verifique os níveis de umidade nas duas zonas: Câmara e Mortal .
      NOTA: A câmara inclui todas as áreas dentro do gabinete Spotiton. Sudário é a área imediatamente que abrange as posições "na câmera" da grade e dicas de dispensador. A mortalha de resina preta mantém o nível de umidade definido quando as portas do gabinete são abertas para carregar uma grade.
   3. Uma vez alcançados os valores de umidade alvo, mantenha esses valores automaticamente ou manualmente da guia Umidade. Selecione controle automáticoe escolha um ponto de ajuste e um limiar para manter o ponto de ajuste dentro do limite de limite escolhido. Alternativamente, selecione controle manuale ajuste o nível de umidade usando os dois controles do ventilador: ventilador de câmara e ventilador de mortalha.
      NOTA: Ligar o ventilador da câmara puxa o vapor através de um filtro na porta esquerda e impede que gotículas de água maiores entrem na câmara, evitando um aumento adicional na umidade ambiente. Enquanto as portas da câmara permanecerem fechadas, o nível de umidade se estabilizará na porcentagem desejada. Ligar o ventilador de mortalha puxa o vapor através da porta direita para dentro da mortalha. Isso reduz a liberação de vapor na câmara e aumenta o nível de umidade dentro da mortalha.
4. Coloque a amostra nos distribuidores.
   1. Adicione 5 μL de cada amostra nos copos de amostra.
      NOTA: Para evitar a introdução de bolhas, dispense o volume com muito cuidado na parede lateral interna do copo e, em seguida, agite para forçar a amostra até o fundo do copo.
   2. Coloque os copos de amostra na bandeja de retenção, a amostra para a ponta 1 à esquerda, para a ponta 2 à direita. Empurre a bandeja de volta para dentro da máquina até que ela se aconte bem.
   3. Na guia Aspirar, selecione 3 μL para que o volume seja aspirado por cada ponta. Certifique-se de que a bandeja de amostra foi sentada com segurança, em seguida, clique em Aspirar e observe como o estágio pipeta move as cabeças do distribuidor para os copos de amostra.
   4. Verifique a aspiração bem sucedida de ambas as amostras removendo os copos de amostra e observando uma queda no nível líquido.
   5. Na guia Inspecionar, envie cada dica para a câmera de inspeção para confirmar a dispensa não estruturada. Ajuste a amplitude conforme necessário para combinar a formação de gotículas de cada ponta (ver seção 1.2).
      NOTA: A amplitude provavelmente precisará ser aumentada para a ponta que dispensa a amostra de proteína.
   6. O sistema está pronto para preparar uma grade de amostra.
5. Congelar grades de amostras
   1. Coloque uma grade limpa de plasma recém-plasma nas pinças, mas não monte as pinças ainda. Certifique-se de que o nível de umidade esteja elevado, ~90-95%. Encha o copo de etano.
   2. Realize um teste final de fogo de ambas as pontas na frente da câmera de inspeção, confirmando nenhuma obstrução. Na aba Cryo, clique em Dica para câmera.
   3. Encha a xícara de etano. Se o gelo de etano se formar, derreta conforme necessário com gás etano adicional.
      NOTA: As etapas 2.5.4 e 2.5.5 devem ser concluídas relativamente rapidamente (<20 s) para minimizar (i) a saturação dos nanofios na alta umidade da câmara e (ii) a probabilidade de que a ponta que dispara a amostra de proteína obstrua.
   4. Monte a pinça com a grade no palco da grade. Na guia Cryo, clique em Grade para câmera. Certifique-se de que a Dica 1 esteja posicionada corretamente no monitor da câmera superior (veja as etapas 1.3.4-1.3.5).
   5. Clique em Vitrify Grid, Alvo da fila,e depois Mergulhe. Clique em OK quando solicitado a comandar o robô de grade para saltar a grade do etano em nitrogênio líquido e soltá-lo na prateleira submersa.
      NOTA: A pinça então sobe de volta para a câmara. Após o salto para nitrogênio líquido, um prompt aparece perguntando se a grade caiu da pinça. Se ele não cair, clique em Não, e a pinça abrirá e fechará várias vezes para desprender a grade.
   6. Examine as imagens da grade(Figura S5) para decidir se ela deve ser mantida ou descartada.
   7. Se manter a grade, transfira-a para a caixa de grade pré-resfriada. Alternativamente, localmente grades subsequentes e, em seguida, transferir todas as grades de uma só vez para a caixa de grade, tomando cuidado para que cada grade possa ser identificada por sua posição na área de descanso.
   8. Para transferir a grade para uma caixa de grade, fórceps pré-frios de ponta fina, segure suavemente a grade pela borda e coloque-a em um slot de caixa de grade, começando com o primeiro slot esquerdo do entalhe indo no sentido horário.
   9. Quando todas as grades estiverem carregadas, conecte a tampa da caixa da grade à ferramenta da tampa e o pré-cozido em nitrogênio líquido. Enrosque a tampa na caixa da grade e aperte com uma ferramenta de tampa ou uma chave de fenda pré-controlada.
   10. Use bipes grandes para transferir rapidamente a caixa de grade fechada para uma pequena de guerra para imagens ou armazenamento a longo prazo.
6. Avalie a adequação da grade para imagens EM a jusante.
   1. Observe as imagens das câmeras de caminho de mergulho superior e inferior que são exibidas no lado esquerdo da interface do usuário imediatamente após uma grade ser mergulhada. Use essas imagens para avaliar a velocidade de pavio, disparo bem sucedido de ambas as pontas e a extensão da sobreposição das duas listras de amostras.
   2. Revise e compare as imagens da grade das câmeras superiores e inferiores, juntamente com as configurações da máquina e as medidas de umidade no momento do mergulho usando o visualizador do experimento: Relatórios | Experimento.
   3. Selecione grades para imagens no microscópio eletrônico que demonstrem evidências de boas mechas.

Resultados

A Figura 4 mostra imagens de grades preparadas durante uma única sessão spotiton resolvida pela hora, misturando polimerase de RNA e um oligômero de DNA de 105 bp carregando uma sequência de promotores para 150 ms antes da vitrificação¹⁵. Na figura estão imagens tiradas pelas duas câmeras de alta velocidade de seis grades em dois pontos de tempo após a aplicação da amostra. Essas câmeras, únicas entre os freezers estilo mergulho, permitem que o usuário decida imediatamente se mantém ou descarta uma grade com base na extensão observada de pavio pelos nanofios e na probabilidade de as amostras líquidas serem desenhadas em uma camada aquosa fina o suficiente para a imagem EM. Embora uma única grade possa fornecer gelo suficiente para um conjunto de dados completo, uma vez que condições ideais foram alcançadas, várias grades estão preparadas para manter-se à mão no caso de uma ou mais estar perdida ou contaminada. Das seis grades preparadas nesta sessão, as capturas de imagem mostram apenas uma com pavio subótimo(Figura 4F).

As grades mostradas foram preparadas (etapas 2.5.1 a 2.5.8) em sucessão durante um período de 40 minutos após uma hora para preparar as amostras e a máquina conforme descrito no protocolo (etapas 1.1.1 a 2.4.6). Das seis grades, duas foram utilizadas para coleta de dados, e as demais foram salvas para análise posterior, se necessário. O padrão de gelo em uma grade vitrificada(Figura 5C) corresponde de perto ao padrão de líquido depositado visto na imagem da câmera superior(Figura 5B). O pavio efetivo das amostras mistas, aparente pela falta de uma faixa líquida visível na imagem inferior da câmera(Figura 5A),ocorre ao longo das barras de grade cobertas de nanofios, e a amostra raramente transborda em quadrados adjacentes aos que aterrissam. Dentro de quadrados cheios de gelo, o gelo é tipicamente mais espesso dentro de buracos no centro do quadrado e torna-se mais fino em buracos mais próximos às barras de grade(Figura 5E). Muitas vezes os orifícios imediatamente adjacentes às barras de grade estão vazios devido à proximidade com os nanofios(Figura 5F).

Figura 1: O sistema Spotiton resolvido pelo tempo. 1. Estação de trabalho do operador; 2. Câmara ambiental; 3. Fornecimento de nitrogênio; 4. Suprimento de etano 5. Controle de luz traseira para câmera de caminho de mergulho superior 6. Controladores dispensadores piezoelétricos; 7. Bombas de seringa; 8. Bomba de vácuo; 9. Lave o abastecimento de água e os frascos de resíduos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Interface do usuário de software Spotiton. (A) Ícone de desktop e tela de respingo. (B) A interface do usuário principal é composta por seis áreas: 1. área de exibição para o caminho superior de mergulho ("superior") e câmeras de inspeção de ponta; 2. área de exibição para câmera de menor caminho de mergulho ("inferior"); 3. Área de reprodução para vídeos de inspeção de ponta; 4. Área de guia multifuncional; 5. Monitor de umidade ao vivo; 6. Arquivo de loge do sistema ao vivo. Abreviação: Interface do usuário = interface do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Vista interior da câmara Spotiton (robôs em Posição Segura). 1. Robô de grade (vermelho); 2. Robô dispensador (amarelo); 3. Câmera de caminho de mergulho superior (rosa); 4. Câmera de caminho de mergulho inferior (azul claro); 5. Câmera de inspeção de ponta (laranja); 6. Mortalha de umidade (verde); 7. bandeja de amostra; 8. Montagem de nebulizador (azul escuro); 9. Reservatório do sistema e linhas de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas da câmera do sistema de uma sessão de fabricação de grade Spotiton resolvida no tempo. (A -F) Imagens superiores (esquerda) e inferior (direita) de mergulhar imagens da câmera de caminho de seis grades nas quais a polimerase de RNA e uma sequência de DNA do promotor foram aplicadas usando Spotiton. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Padrão de deposição de gelo em uma grade preparada por Spotiton. Porções das imagens da câmera superiorinferiore(B)e(C)da grade mostrada na Figura 4F. Locais aproximados de gelo resultantes da deposição e mistura de amostras são lavanda colorida. Áreas dentro do quadrado marcadas com uma ponta de flecha amarela são imagens em (E-G). A região mostrada em (E) é encaixotada em amarelo em(D). Praça representativa(E),orifício(F)e(G) imagens de exposição coletadas da grade mostrada em (A-D). As áreas encaixotados nas imagens quadradas e orifícios correspondem às imagens de orifício e exposição, respectivamente. Barras de escala = 100 μm(A-D),5 μm(E),2 μm(F),100 nm(G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: Inspeção de disparo de ponta. Uma visão ao vivo do disparo da Dica 2 é vista no monitor de câmera superior à esquerda da Interface do Usuário, enquanto uma gravação feita anteriormente de disparo do Tip 1 é reproduzida em um loop para comparação na área de reprodução de vídeo à direita. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura S2: Limpeza ultrassônica de dicas de dispensador. Uma bolha de ar na ponta(A)interromperá a formação de gotículas e evitará disparos de ponta. (B) Pontas imersas em água na estação de limpeza ultrassônica para remover uma bolha de ar ou limpar proteína seca bloqueando o orifício da ponta. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura S3: Grade de carregamento em pinças. (A) Uma grade colocada de lado nanofio na borda do bloco de grade. (B) Uma grade posicionada corretamente nas pinças de auto-fechamento. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura S4: Rastreador de umidade. A umidade relativa por cento na câmara (azul escuro) e mortalha (azul claro) como registrado durante uma sessão típica de fabricação de grade. Os tempos de mergulhos de grade (quadrados verdes) são plotados no gráfico. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura S5: Wicking em grades de nanofios durante um mergulho. Representante superior (A, C, E) e inferior(B, D, F) mergulhar imagens da câmera de caminho de pavio em grades de nanofios que é muito lento(A, B),ideal(C, D), e muito rápido(E, F). Um leve espessamento (pontas de flecha branca) indica barras de grade com nanofios que foram saturados por amostra. Quadrados nessas regiões normalmente contêm gelo de espessura apropriada para imagens microscópicas eletrônicas. Barra de escala = 500 μm. Por favor, clique aqui baixe este Arquivo.

Discussão

Este protocolo descreve o uso do sistema robótico Spotiton para preparar grades para imagens crio-EM que carregam duas amostras, geralmente uma proteína de interesse e um ligante ativador, que foram misturados para 90-500 ms. Embora o fluxo de trabalho seja simples, existem algumas considerações que o usuário deve ter em mente para garantir uma sessão produtiva de fabricação de grade. Em primeiro lugar, não é incomum que uma das pontas do dispensador piezoelétrico fique entupida ou bloqueada impedindo que ela dispare. Tal falha resultará em uma faixa líquida, vista em capturas de imagem da câmera superior ou inferior, que é visivelmente mais estreita do que a vista após ambas as pontas disparadas. Um bloqueio pode resultar de uma entrada de bolha de ar na ponta, interrompendo a formação de gotículas, ou de uma amostra de proteína que secou e selou o orifício de ponta estreita. Embora a amostra aspirada seja perdida no processo, ambos os problemas podem ser resolvidos por uma lavagem ultrassônica das pontas e a ressusida da amostra. Para evitar o entupimento subsequente e resíduos amostrais, é crucial que o topo das linhas de fluidos antes da aspiração da amostra e mantenha um nível de umidade alto e consistente dentro da câmara e da mortalha. Além disso, uma amostra de proteína com uma concentração particularmente alta pode afetar a queima de ponta, apesar da umidade bem conservada. Embora o aumento da amplitude de disparo na guia Inspect possa compensar parcialmente o disparo fraco devido à alta concentração de proteínas, diluir a amostra pelo menos 1:2 melhorará o disparo de ponta e evitará entupimento.

Em segundo lugar, pode ser difícil alcançar a velocidade ideal de pavio necessária para gerar gelo de espessura ideal para a duração da mistura direcionada. Geralmente, tempos de mistura mais rápidos exigirão um pavimento mais rápido, tempos de mistura mais lentos requerem pavio mais lento. Para a grade idealmente perversa, uma faixa líquida é claramente discernível na imagem da câmera superior, enquanto na câmera inferior, apenas um leve espessamento das barras de grade na localização da listra permanece visível. O pavio lento, indicado por uma faixa escura na imagem da câmera inferior, geralmente deixa gelo muito espesso para a imagem. A ausência de uma listra em qualquer imagem indica pavio rápido que pode não ter deixado água nos orifícios(Figura S5). Vários fatores como densidade de nanofios, configurações de limpeza de plasma e duração, e tempo de exposição e nível definido de umidade da câmara podem afetar a velocidade de pavio. O pavio ruim (lento) pode ser o resultado de um revestimento esparso de nanofios na grade. Ao diluir ligeiramente e aumentar o tempo de exposição à solução de nanofios^16,a densidade e a cobertura de nanofios nas barras de grade aumentarão, facilitando o pavio mais rápido. Se a densidade de nanofios for suficiente, aumentar a configuração de wattage ou a duração da limpeza plasmática também melhorará a ad vime. As configurações recomendadas aqui são relativamente baixa potência e longa duração, mas podem ser alteradas se necessário.

No entanto, se tanto o lote específico de grades quanto as configurações de limpeza de plasma funcionaram bem em uma sessão anterior, o desempenho lento pode surgir da exposição excessiva dos nanofios à alta umidade dentro da câmara, levando à sua saturação com umidade e capacidade reduzida de retenção líquida. O efeito saturador da grade da umidade da câmara pode ser reduzido minimizando o tempo decorrido entre a montagem da pinça e a queda da grade ou a diminuição do nível de umidade do sistema antes de um mergulho. Deve-se notar, no entanto, que este último traz o risco associado de que a ponta carregada com amostra de proteínas obstrua. Para compensar esse risco, segurar as pontas na mortalha onde um alto nível de umidade é mantido, pode aumentar o tempo permitido para montar pinças segurando uma nova grade. Finalmente, deve-se notar que um tempo reduzido de mergulho (alcançado pelo aumento da aceleração da grade e/ou velocidade máxima) pode resultar em grades com gelo mais fino sem realmente alterar as características de pavio da grade. No entanto, como o tempo de mistura das duas amostras também será reduzido, o tempo de mergulho não é um fator que normalmente é alterado para lidar com a delírio lento. Para abordar o pavio que é muito rápido, resultando em gelo que é muito fino ou ausente nos orifícios da grade, o oposto das medidas acima descritas pode ser tomada.

Spotiton apresenta certas vantagens e desvantagens quando comparado com outras técnicas desenvolvidas para estudos subssegundos resolvidos no tempo. Como a faixa de amostra mista contém apenas 2-4 nL de líquido de cada dispensador, uma única alíquota de 3 μL de cada amostra é suficiente para preparar muitas grades - uma vantagem chave quando a amostra é limitada. Além disso, a observação da deposição amostral usando câmeras integradas, embora não totalmente exclusiva do Spotiton^17,não é uma característica de outros dispositivos de mistura e permite que grades mergulhadas sejam submetidas a uma avaliação bruta de passe/falha, reduzindo consideravelmente o tempo de triagem. Uma das principais desvantagens do sistema é um tempo mínimo de mistura de 90 ms, restrito pelas limitações físicas dos componentes mecânicos, que coloca o interrogatório de reações biológicas mais rápidas fora de alcance. Em comparação, vezes menos de 10 ms são rotineiramente alcançados em sistemas microfluidos existentes. No sistema camaleão, com base no Spotiton, melhorias no design e construção reduziram o tempo mínimo de mergulho para 54 ms e levantaram a possibilidade de que a adição de um segundo dispensador poderia permitir tempos de mixagem mais rápidos do que o Spotiton pode oferecer atualmente.

Até o momento, uma série de experimentos foram realizados para investigar estados moleculares de curta duração usando spotiton, incluindo a montagem do ribossomo 70S, alterações conformais desencadeadas por cálcio em um canal de íons transmembranos, e constrição de dinamismo em resposta à hidrólise GTP¹⁵. Desde a publicação desses resultados, várias mudanças foram incorporadas ao sistema para melhorar o throughput, a reprodutibilidade e o relatório das sessões de fabricação de grades spotiton. Estes incluem, entre outros, o sistema de controle e monitoramento automático de umidade, o recurso de visualização de experimentos, o recurso de inspeção de ponta lado a lado e várias pequenas atualizações para a interface do usuário. O sistema atualizado suportará melhor futuros experimentos de mistura de duas amostras semelhantes aos relatados anteriormente, bem como ensaios de ligação rápida, como entre uma pequena molécula terapêutica e seu alvo proteico ou mesmo formação complexa de anticorpos-anticorpos. Embora os experimentos atuais e futuros resolvidos com o tempo envolvendo dois parceiros interagindo certamente continuem, a adição de um terceiro distribuidor piezoelétrico e hardware associado poderia ampliar ainda mais o leque de possíveis experimentos. Por exemplo, a deposição inicial de um detergente seguido pela proteína de interesse, seguida pelo ligante interagindo ou ativando poderia remover qualquer impacto negativo potencial de exposição prolongada ao detergente, muitas vezes necessário para evitar desfechos comuns de imagem subótimal, como orientação preferencial. À luz tanto do trabalho já publicado quanto de potenciais aplicações futuras, o Spotiton representa uma ferramenta importante para a comunidade crio-EM facilitar a realização de estudos subssegundos resolvidos no tempo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer	N/A	N/A
cryogenic grid storage boxes	EMS (Hatfield, PA; USA)	N/A
Cu/Rh 300 mesh EM grids	EMS (Hatfield, PA; USA)	EMS300-Cu-Rh	treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)
ethane gas	TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)	N/A
Grid-handling forceps	EMS (Hatfield, PA; USA)	78320-5B
liquid nitrogen	Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)	N/A
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
Picosystem	Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)	N/A	water purification system
Protein/other sample	N/A	N/A
Solarus 950 plasma cleaner	Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)	N/A