Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

Riepilogo

Il protocollo qui presentato descrive l'uso di Spotiton, un nuovo sistema robotico, per fornire due campioni di interesse su una griglia di nanofili auto-traspiranti che si mescolano per un minimo di 90 ms prima della vetrificazione nel criogeno liquido.

Abstract

La cattura di stati molecolari di breve durata innescati dall'incontro precoce di due o più particelle interagenti continua ad essere una sfida sperimentale di grande interesse nel campo della crio-microscopia elettronica (cryo-EM). Sono state sviluppate alcune strategie metodologiche che supportano questi studi "risolti nel tempo", uno dei quali, Spotiton - un nuovo sistema robotico - combina l'erogazione di goccioline campione di dimensioni picoliter con un preciso controllo temporale e spaziale. Il flusso di lavoro Spotiton risolto nel tempo offre un approccio straordinariamente efficiente per interrogare i primi riarrangiamenti strutturali da un volume minimo di campioni. Sparati da distributori piezoelettrici controllati in modo indipendente, due campioni atterrano e si mescolano rapidamente su una griglia EM a nanofili mentre si tuffa verso il criogeno. Potenzialmente centinaia di griglie possono essere preparate in rapida successione da pochi microlitri di un campione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato passo-passo del funzionamento del sistema Spotiton con particolare attenzione alla risoluzione di problemi specifici che sorgono durante la preparazione della griglia.

Introduzione

Il potenziale per la crio-EM di catturare e rivelare stati conformazionali transitori delle proteine sulla scala temporale al di sotto del secondo (cryo-EM risolta nel tempo) è stato realizzato da diversi gruppi, a partire da Berriman e Unwin¹ la cui tecnica si è basata sul metodo standard di congelamento a tuffo sviluppato da Dubochet per la preparazione di griglie crio-EM². Hanno aggiunto un atomizzatore appena sopra la tazza di criogeno che utilizzava gas azoto compresso per spruzzare una nebbia fine di un secondo campione su una griglia EM immersa contenente un primo campione che era stato applicato e cancellato su un sottile strato acquoso. Sebbene questo sistema potesse raggiungere tempi di miscelazione fino a 1 ms, richiedeva comunque il blotting manuale del primo campione da parte dell'utente - un compito tecnicamente impegnativo - e un volume relativamente elevato del secondo campione. Inoltre, in pratica, era difficile sapere dove fosse avvenuta la miscelazione dei due campioni, richiedendo l'uso di nanoparticelle di ferritina come marcatore fiduciale nel campione misto. Gli sforzi successivi di Howard White e colleghi hanno migliorato il controllo e la riproducibilità di questo approccio di spruzzatura-miscelazione incorporando il controllo computerizzato delle fasi di blotting e spruzzatura^3,4. Per affrontare il modo in cui i campioni si mescolano, lo stesso gruppo⁵ e altri^6,7,8,9,10 sono passati a un approccio di miscelazione-spruzzatura¹¹ in cui due campioni vengono miscelati in stretti tubi capillari sotto la pressione di pompe a siringa o in chip microfabbricati e microfluidici azionati da gas di azoto. Questi sistemi di premiscelazione non solo garantiscono una miscelazione completa, ma consentono anche la messa a punto dei tempi di miscelazione per aumentare la risoluzione degli studi risolti nel tempo.

L'introduzione di erogatori piezoelettrici come modo alternativo per applicare il campione alle griglie EM nel sistema Spotiton ha permesso sia il targeting preciso della deposizione del campione sia il requisito di un volume di campione molto più piccolo per creare una griglia¹². Successivamente, l'uso di griglie di nanofili e l'applicazione di campioni in rotta (spotting "al volo") ha eliminato la necessità di una fase di blotting e ridotto i tempi da applicazione a vetrificazione^13,14. Per il nuovo approccio alla crio-EM risolta nel tempo qui descritto, un secondo distributore insieme ai necessari aggiornamenti hardware e software di controllo sono stati aggiunti al sistema Spotiton per consentire la consegna di un secondo campione su una griglia di nanofili in movimento quasi immediatamente dopo la deposizione dei primi¹⁵. I due campioni sovrapposti si mescolano sulla griglia mentre sono malvagi dai nanofili in un sottile strato acquoso prima della vetrificazione. È possibile ottenere tempi di miscelazione fino a 90 ms. Questo protocollo intende fornire informazioni pratiche su come condurre esperimenti risolti nel tempo utilizzando l'erogazione piezoelettrica e le griglie di nanofili. Inoltre, poiché l'hardware e il software vengono modificati per migliorare la facilità d'uso, la coerenza e la velocità effettiva, questo protocollo funge anche da descrizione aggiornata del metodo¹⁵precedentemente riportato.

Protocollo

1. Configura la macchina e il software Spotiton

1. Preparare il sistema per l'erogazione (Figura 1).
   1. Aprire la valvola principale sul serbatoio di alimentazione dell'azoto. Assicurarsi che il serbatoio del sistema sia riempito con acqua degassata e ultrapura. Accendere il computer. Accendi il sistema Spotiton sulla cartella di alimentazione multioutlet.
   2. Fare clic sull'icona del desktop (Figura 2A) per aprire l'interfaccia utente (UI) del software Spotiton (Figura 2B). Nel menu Strumenti, selezionate Inizializza fasi per inizializzare e gestire i robot a 3 assi (stadio griglia e stadio pipetta) e il gruppo testa erogatrice rotante (stadio theta). Assicurarsi che le punte del dispenser siano puntate verso il basso prima dell'inizializzazione e dell'homing.
   3. Nella finestra principale, fare clic su Vai a SafePosition per inviare i robot a SafePosition (Figura 3).
      NOTA: il passaggio a SafePosition può essere eseguito con robot in qualsiasi posizione senza rischio di collisione.
   4. Nella scheda Aspira, selezionare Prime per lavare più volte le teste del distributore con l'acqua del serbatoio. Continuare fino a quando non si vedono flussi d'acqua ininterrotti che emergono dalle due punte.
      NOTA: potrebbe essere necessario ripetere se un volume significativo di aria è entrato nelle linee del fluido quando le punte sono state lavate con metanolo all'ultimo spegnimento.
2. Ispezionare le prestazioni del dispenser
   1. Nella scheda Ispeziona, inviare ogni suggerimento alla telecamera di ispezione per testare l'acqua di fuoco e abbinare il modello di produzione di goccioline dai due distributori (Figura S1).
      NOTA: se una punta non si accende a causa di una bolla (Figura S2A) o detriti, pulire le punte presso la stazione di lavaggio (Figura S2B) utilizzando la funzione lavaggio ad ultrasuoni accessibile nella scheda Aspirato.
   2. Regolare l'ampiezza di cottura (senza unità) per ogni distributore e campione per ottenere un flusso di goccioline discrete di dimensioni coerenti.
   3. Confermare visivamente la produzione equivalente di goccioline da parte dei due distributori.
      1. Premere il pulsante Registra nel monitor della fotocamera superiore per registrare un video di Tip 1 che spara. Riproduci il video del tip 1 che spara sul monitor destro nello stesso momento in cui il suggerimento 2 viene attivato nel monitor della telecamera superiore (Figura S1).
         NOTA: i video di ogni tiro della punta vengono registrati e memorizzati.
   4. I distributori sono ora pronti per testare il fuoco su una griglia.
      NOTA: questo protocollo presuppone che sia stato verificato il corretto allineamento degli stadi della griglia e della pipetta nelle rispettive posizioni di immersione. La mancata conferma del corretto allineamento potrebbe provocare una collisione, danneggiando le punte o i robot.
3. Prova l'acqua del fuoco su una griglia.
   1. Assicurati che i robot siano presenti alla SafePosition.
   2. Rimuovere le pinzette dal supporto sul robot a griglia utilizzando la chiave a brugola in dotazione.
   3. Su un banco vicino, posizionare una griglia di prova, lato nanofilo, sul bordo del blocco della griglia. Afferrare con attenzione il bordo della griglia, posizionarsi correttamente nelle pinzette (Figura S3) e rimontare le pinzette.
   4. Nella scheda Cryo, fare clic su Punta alla fotocamera per spostare le punte nel campo visivo della fotocamera del percorso di immersione superiore (fotocamera superiore). Assicurarsi che Live sia selezionato nel monitor superiore della telecamera e che la spia superiore della telecamera sia accesa (comporre la parte anteriore dell'armadio della macchina (Figura 1).
   5. Montare le pinzette sul robot griglia. Suggerimento di posizione 1, visibile nel monitor superiore della telecamera, facendo clic con il mouse all'interno del monitor.
      NOTA: solo il suggerimento 1 sarà visibile e si sposterà nella posizione del clic.
   6. Fare clic su Griglia alla fotocamera per posizionare la griglia davanti alla fotocamera superiore. Regolare la posizione della punta 1 come prima, se necessario.
   7. Scegliere Tip1, Tip2o Tip1 e Tip2 per selezionare uno o entrambi i dispenser da testare.
      NOTA: quando si testano le punte singolarmente, utilizzare il mouse per posizionare il suggerimento 1 nel monitor della fotocamera superiore in diverse posizioni laterali sulla griglia. Questo depositerà strisce liquide dalle due punte in uno schema non sovrapposto e consentirà all'utente di confermare che ogni punta ha sparato.
   8. Nella scheda Cryo, assicurati che Vitrify Grid non sia selezionato, fai clic su Queue Target, quindi su Plunge.
      NOTA: lo stadio della pipetta aumenterà leggermente, seguito dallo stadio della griglia. Il robot della griglia quindi immerge la griglia oltre i distributori di fuoco e le telecamere superiori e inferiori, arrivando a riposare appena sopra il ponte. Un'acquisizione di immagini dalla fotocamera superiore viene visualizzata sopra un'acquisizione di immagini dalla fotocamera inferiore sul lato sinistro dell'interfaccia utente.
   9. Valuta le immagini superiore e inferiore: ogni punta è stata attivata quando selezionata? Quando è stato sparato insieme, il liquido delle due punte si è sovrapposto completamente, creando una striscia notevolmente più spessa rispetto a quando è stato sparato individualmente?
      1. Se una delle punte non è riuscita a sparare, eseguire uno o più cicli di lavaggio ad ultrasuoni fino a quando non si osserva una chiara cottura.
      2. Se le strisce campione non si sovrappongono completamente, regolare l'allineamento laterale di uno dei distributori utilizzando una chiave a brugola per ruotare la vite di regolazione laterale su uno dei dispenser di un quarto di giro ed eseguire un tuffo di prova. Ripeti fino a quando le strisce non si sovrappongono completamente.
         NOTA: se entrambe le punte sono risultate correttamente e come previsto, il sistema è pronto per preparare le griglie di esempio.

2. Preparare griglie miste a due campioni

1. Aggiornare i valori di accelerazione, decelerazione e velocità nel file XML dei parametri macchina per ottenere il tempo di miscelazione di interesse.
   NOTA: le tabelle che correlano questi valori ai tempi di miscelazione sono state precedentemente riportate¹⁵.
2. Prepara il campione e le griglie.
   NOTA: da questo punto del protocollo, 20-30 minuti saranno trascorsi prima che venga preparata la prima griglia e i campioni devono essere mantenuti a una temperatura appropriata durante questo intervallo di tempo.
   1. Diluire due campioni (cioè proteine e ligando o altro partner interagente) alle concentrazioni desiderate con un tampone appropriato, idealmente, lo stesso per entrambi.
      NOTA: le griglie Spotiton richiedono concentrazioni di proteine 1,5-2 volte superiori rispetto a quelle tipicamente utilizzate per i congelatori automatici. Ciò può essere dovuto al tempo minimo che la proteina trascorre in un sottile strato acquoso sulla superficie della griglia durante un tuffo, dando alle particelle meno opportunità di concentrarsi sull'interfaccia aria-acqua.
   2. Riempire la ciotola di criogeno con azoto liquido.
   3. Plasma pulito 3-4 griglie di nanofili. Utilizzare 5 W, idrogeno e ossigeno, 1,5 minuti come punto di partenza.
      NOTA: la durata e la ricetta di pulizia al plasma più efficaci possono cambiare di giorno in giorno in base alla temperatura e all'umidità ambiente e al lotto di griglie di nanofili utilizzate. Miscele di gas alternative o uno scaricatore a bagliore possono anche essere efficaci, ma non sono stati testati per questo scopo. Poiché l'acqua e le proteine in soluzione tampone sono spesso malvagie a velocità diverse dai nanofili, è buona norma valutare l'assorbimento delle griglie da utilizzare quel giorno in un tuffo in cui viene erogato il campione effettivo.
3. Impostare il livello di umidità nel sistema.
   NOTA: Oltre alle condizioni utilizzate sia per fare che per pulire al plasma le griglie, l'umidità è un altro fattore primario che influisce sulla velocità di assorbimento delle griglie di nanofili. Sebbene l'umidità percentuale target per una particolare sessione sia determinata empiricamente per ogni giorno e lotto di griglie, il 90-95% è un buon punto di partenza.
   1. Assicurarsi che il nebulizzatore sia sufficientemente riempito con acqua ultrapura. Collegare il nebulizzatore e osservare il vapore uscire dalla porta centrale sul cappuccio del nebulizzatore.
   2. Osservare il monitor di umidità in tempo reale nella finestra principale o aprire il tracker dell'umidità ambientale in Rapporti | Ambiente (Figura S4). Controllare i livelli di umidità nelle due zone: Camera e Sindone.
      NOTA: la camera include tutte le aree all'interno del recinto Spotiton. La Sindone è l'area che comprende immediatamente le posizioni "a telecamera" della griglia e delle punte del distributore. Il sudario in resina nera mantiene il livello di umidità impostato quando le porte dell'involucro vengono aperte per caricare una griglia.
   3. Una volta raggiunti i valori di umidità target, mantenere questi valori automaticamente o manualmente dalla scheda Umidità. Selezionare Controllo automaticoe scegliere un setpoint e una soglia per mantenere il setpoint entro il limite di soglia scelto. In alternativa, selezionare Controllo manualee regolare il livello di umidità utilizzando i due controlli della ventola: ventola a camera e ventola a sudario.
      NOTA: l'accensione della ventola della camera tira il vapore attraverso un filtro nella porta sinistra e impedisce alle goccioline d'acqua più grandi di entrare nella camera, impedendo un ulteriore aumento dell'umidità ambientale. Finché le porte della camera rimangono chiuse, il livello di umidità si stabilizzerà alla percentuale desiderata. Accendendo la ventola del sudario si tira il vapore attraverso la porta destra nel sudario. Ciò riduce il rilascio di vapore nella camera e aumenta il livello di umidità all'interno del sudario.
4. Caricare il campione nei dispenser.
   1. Aggiungere 5 μL di ciascun campione nelle coppette del campione.
      NOTA: Per evitare di introdurre bolle, erogare il volume con molta attenzione sulla parete laterale interna della tazza, quindi agitare verso il basso per forzare il campione sul fondo della tazza.
   2. Caricare le coppe campione nel vassoio di attesa, il campione per il suggerimento 1 a sinistra, per il suggerimento 2 a destra. Spingere il vassoio di nuovo nella macchina fino a quando non si siede.
   3. Nella scheda Aspirato selezionare 3 μL per il volume da aspirare da ciascuna punta. Assicurarsi che il vassoio del campione sia stato inserito saldamente, quindi fare clic su Aspirate e osservare come lo stadio della pipetta sposta le teste del distributore nelle tazze del campione.
   4. Verificare il successo dell'aspirazione di entrambi i campioni rimuovendo le tazze del campione e osservando un calo del livello del liquido.
   5. Nella scheda Ispeziona, inviare ogni suggerimento alla telecamera di ispezione per confermare l'erogazione senza ostacoli. Regolare l'ampiezza secondo necessità per abbinare la formazione di goccioline da ciascuna punta (vedere paragrafo 1.2).
      NOTA: l'ampiezza dovrà probabilmente essere aumentata per la punta che eroga il campione proteico.
   6. Il sistema è ora pronto per preparare una griglia di esempio.
5. Bloccare le griglie di esempio
   1. Caricare una griglia appena pulita al plasma nelle pinzette, ma non montare ancora le pinzette. Assicurarsi che il livello di umidità sia elevato, ~ 90-95%. Riempi la tazza di etano.
   2. Eseguire un test-fire finale di entrambe le punte davanti alla telecamera di ispezione, confermando l'e ruzionismo. Nella scheda Cryo, fai clic su Punta alla fotocamera.
   3. Riempi la tazza di etano. Se si forma ghiaccio di etano, sciogliersi secondo necessità con gas etano aggiuntivo.
      NOTA: i passaggi 2.5.4 e 2.5.5 devono essere completati relativamente rapidamente (<20 s) per ridurre al minimo (i) la saturazione dei nanofili nell'elevata umidità della camera e (ii) la probabilità che la punta che spara il campione proteico si ostruisci.
   4. Montare le pinzette con la griglia sul palco della griglia. Nella scheda Cryo, fai clic su Griglia alla fotocamera. Assicurarsi che la punta 1 sia posizionata correttamente nel monitor superiore della telecamera (vedere i passaggi 1.3.4-1.3.5).
   5. Fare clic su Vitrify Grid, Queue Target, quindi Plunge. Fare clic su OK quando viene richiesto di comandare al robot della griglia di far saltare la griglia dall'etano all'azoto liquido e rilasciarla sullo scaffale sommerso.
      NOTA: le pinzette risalgono quindi nella camera. Dopo il salto all'azoto liquido, appare un prompt che chiede se la griglia è caduta dalle pinzette. Se non è caduto, fai clic su Noe le pinzette si apriranno e si chiuderanno più volte per staccare la griglia.
   6. Esaminare le immagini della griglia (Figura S5) per decidere se deve essere conservata o scartata.
   7. Se si mantiene la griglia, trasferirla nella casella della griglia pre-raffreddata. In alternativa, individuare le griglie successive e quindi trasferire tutte le griglie contemporaneamente nella casella della griglia, facendo attenzione che ogni griglia possa essere identificata dalla sua posizione nell'area di riposo.
   8. Per trasferire la griglia in una griglia, pre-raffreddare le pinne a punta fine, afferrare delicatamente la griglia per il bordo e posizionarla in uno slot della griglia, iniziando con il primo slot a sinistra della tacca in senso orario.
   9. Quando tutte le griglie sono cariche, collegare il coperchio della scatola della griglia allo strumento del coperchio e preraffreddare in azoto liquido. Avvitare il coperchio sulla scatola della griglia e stringere con uno strumento coperchio o un cacciavite preraffreddato.
   10. Utilizzare pinne di forza di grandi dimensioni per trasferire rapidamente la scatola a griglia chiusa in un piccolo dewar per l'imaging o l'archiviazione a lungo termine.
6. Valutare l'idoneità della griglia per l'imaging EM a valle.
   1. Osserva le immagini delle telecamere del percorso di immersione superiore e inferiore visualizzate sul lato sinistro dell'interfaccia utente subito dopo l'immersione di una griglia. Utilizzare queste immagini per valutare la velocità di assorbimento, il successo dello sparo di entrambe le punte e l'entità della sovrapposizione delle due strisce di campioni.
   2. Rivedere e confrontare le immagini della griglia dalle telecamere superiore e inferiore insieme alle impostazioni della macchina e alle misurazioni dell'umidità al momento del tuffo utilizzando il visualizzatore dell'esperimento: Reports | Esperimento.
   3. Selezionare griglie per l'imaging al microscopio elettronico che dimostrino la prova di una buona traspirazione.

Risultati

La Figura 4 mostra immagini di griglie preparate durante una singola sessione di Spotiton risolta nel tempo mescolando RNA polimerasi e un oligomero di DNA da 105 bp che trasporta una sequenza di promotori per 150 ms prima della vetrificazione¹⁵. Nella figura si vedono le immagini scattate dalle due telecamere ad alta velocità di sei griglie in due punti temporali dopo l'applicazione del campione. Queste telecamere, uniche tra i congelatori a immersione, consentono all'utente di decidere immediatamente se mantenere o scartare una griglia in base all'entità osservata di assorbimento da parte dei nanofili e alla probabilità che i campioni liquidi siano stati prelevati in uno strato acquoso abbastanza sottile per l'imaging EM. Sebbene una singola griglia possa fornire ghiaccio sufficiente per un set di dati completo, una volta raggiunte le condizioni ottimali, diverse griglie sono pronte a tenere a portata di mano nel caso in cui una o più siano perse o contaminate. Delle sei griglie preparate in questa sessione, le acquisizioni di immagini ne mostrano solo una con assorbimento non ottimale (Figura 4F).

Le griglie mostrate sono state preparate (passaggi da 2.5.1 a 2.5.8) in successione per un periodo di 40 minuti dopo un'ora per preparare i campioni e la macchina come descritto nel protocollo (passaggi da 1.1.1 a 2.4.6). Delle sei griglie, due sono state utilizzate per la raccolta dei dati e il resto è stato salvato per un'analisi successiva, se necessario. Il modello di ghiaccio su una griglia vetrificata (Figura 5C) corrisponde strettamente al modello di liquido depositato visto nell'immagine superiore della telecamera (Figura 5B). L'assorbimento efficace dei campioni misti, reso evidente dalla mancanza di una striscia liquida visibile nell'immagine inferiore della telecamera(Figura 5A),si verifica lungo le barre della griglia coperte di nanofili e il campione raramente trabocca in quadrati adiacenti a quelli in cui è atterrato. All'interno di quadrati pieni di ghiaccio, il ghiaccio è in genere più spesso all'interno dei fori al centro del quadrato e diventa più sottile nei fori più vicini alle barre della griglia (Figura 5E). Spesso i fori immediatamente adiacenti alle barre della griglia sono vuoti a causa della vicinanza ai nanofili (Figura 5F).

Figura 1: Il sistema Spotiton risolto nel tempo. 1. Postazione di lavoro dell'operatore; 2. Camera ambientale; 3. Fornitura di azoto; 4. Fornitura di etano 5. Controllo della retroilluminazione per la fotocamera del percorso di immersione superiore 6. Regolatori piezoelettrici; 7. Pompe a siringa; 8. Pompa per vuoto; 9. Lavare l'approvvigionamento idrico e le bottiglie di scarico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Interfaccia utente del software Spotiton. ( A )Iconadel desktop e schermata iniziale. (B)L'interfaccia utente principale è composta da sei aree: 1. area di visualizzazione per il percorso di immersione superiore ("superiore") e telecamere di ispezione della punta; 2. area di visualizzazione per la fotocamera con percorso di immersione inferiore ("inferiore"); 3. Area di riproduzione per i video di ispezione della punta; 4. Area tab multifunzione; 5. Monitor di umidità dal vivo; 6. File di registro di sistema in tempo reale. Abbreviazione: UI = interfaccia utente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vista interna della camera Spotiton (robot in SafePosition). 1. Robot a griglia (rosso); 2. Robot dispenser (giallo); 3. Fotocamera del percorso di immersione superiore (rosa); 4. Fotocamera del percorso di immersione inferiore (azzurro); 5. Telecamera di ispezione della punta (arancione); 6. Sudario di umidità (verde); 7. vassoio del campione; 8. Assemblaggio nebulizzatore (blu scuro); 9. Serbatoio del sistema e linee d'acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative della telecamera di sistema da una sessione di creazione della griglia Spotiton risolta nel tempo. (A) -F) Immagini della telecamera del percorso di immersione superiore (a sinistra) e inferiore (a destra) di sei griglie su cui è stata applicata l'RNA polimerasi e una sequenza di DNA promotore utilizzando Spotiton. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Modello di deposizione di ghiaccio su una griglia preparata da Spotiton. Porzioni delle immagini (A) inferiore e (B) della fotocamera superiore e (C) dell'atlante della griglia mostrato nella Figura 4F. Le posizioni approssimative del ghiaccio risultanti dalla deposizione e dalla miscelazione del campione sono color lavanda. Le aree all'interno del quadrato contrassegnate da una punta di freccia gialla sono immaginate in (E-G). La regione mostrata in (E) è inscatolata in giallo in (D). Immagini rappresentative di esposizione quadrata (E), foro (F) e (G) raccolte dalla griglia mostrata in (A-D). Le aree inscatole nelle immagini quadrate e foro corrispondono rispettivamente alle immagini del foro e dell'esposizione. Barre di scala = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Ispezione della cottura della punta. Una vista dal vivo dello sparo del suggerimento 2 è visibile nel monitor della fotocamera superiore a sinistra dell'interfaccia utente, mentre una registrazione effettuata in precedenza dello sparo del suggerimento 1 viene riprodotta su un loop per il confronto nell'area di riproduzione video a destra. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S2: Pulizia ad ultrasuoni delle punte del dispenser. Una bolla d'aria nella punta(A)interromperà la formazione di goccioline e impedirà la cottura della punta. (B)Punte immerse in acqua presso la stazione di pulizia ad ultrasuoni per rimuovere una bolla d'aria o una proteina secca trasparente che blocca l'orifizio della punta. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S3: Griglia di caricamento in pinzette. (A) Una griglia posizionata sul lato del nanofilo sul bordo del blocco della griglia. (B) Una griglia posizionata correttamente nelle pinzette a chiusura stessa. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S4: Tracker di umidità. La percentuale di umidità relativa nella camera (blu scuro) e nel sudario (azzurro) registrata durante una tipica sessione di creazione della griglia. I tempi dei tuffi della griglia (quadrati verdi) sono tracciati sul grafico. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S5: Traspirazione su griglie di nanofili durante un tuffo. Immagini rappresentative superiori (A, C, E) e inferiori (B, D, F) del percorso di immersione della telecamera di assorbimento su griglie di nanofili troppo lente (A, B), ideali (C, D) e troppo veloci (E, F). Un leggero ispessimento (punte di freccia bianche) indica barre della griglia con nanofili che sono stati saturati dal campione. I quadrati in queste regioni contengono tipicamente ghiaccio di spessore appropriato per l'imaging al microscopio elettronico. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo delinea l'uso del sistema robotico Spotiton per preparare griglie per l'imaging crio-EM che trasportano due campioni, generalmente una proteina di interesse e un ligando attivante, che sono stati miscelati per 90-500 ms. Sebbene il flusso di lavoro sia semplice, ci sono alcune considerazioni che l'utente deve tenere a mente per garantire una sessione di creazione di griglia produttiva. Innanzitutto, non è raro che una delle punte del distributore piezoelettrico si intasi o si blocchi impedendone lo sparo. Tale guasto si tradurrà in una striscia liquida, vista sulle acquisizioni di immagini dalla fotocamera superiore o inferiore, che è visibilmente più stretta di quella vista dopo che entrambe le punte sono sparate. Un blocco potrebbe derivare da una bolla d'aria che si insegna nella punta, interrompendo la formazione di goccioline, o da un campione proteico che si è asciugato e ha sigillato l'orifizio della punta stretta. Sebbene il campione aspirato venga perso nel processo, entrambi i problemi possono essere risolti con un lavaggio ad ultrasuoni delle punte e una rias aspirazione del campione. Per evitare successivi intasamenti e sprechi di campioni, è fondamentale innescare accuratamente (lavare) le linee del fluido prima dell'aspirazione del campione e mantenere un livello di umidità elevato e costante all'interno della camera e del sudario. Inoltre, un campione proteico con una concentrazione particolarmente elevata può influenzare la cottura della punta nonostante l'umidità ben mantenuta. Sebbene l'aumento dell'ampiezza di cottura sulla linguetta Inspect possa parzialmente compensare la cottura debole dovuta all'elevata concentrazione di proteine, diluire il campione di almeno 1:2 migliorerà la cottura della punta ed eviterà l'intasamento.

In secondo luogo, può essere difficile raggiungere la velocità di traspirazione ideale necessaria per generare ghiaccio di spessore ottimale per la durata di miscelazione prevista. Generalmente, tempi di miscelazione più rapidi richiedono un assorbimento più rapido, tempi di miscelazione più lenti richiedono un assorbimento più lento. Per la griglia idealmente malvagia, una striscia liquida è chiaramente distinguibile nell'immagine superiore della fotocamera, mentre nella fotocamera inferiore rimane visibile solo un leggero ispessimento delle barre della griglia nella posizione della striscia. L'assorbimento lento, indicato da una striscia scura sull'immagine inferiore della fotocamera, generalmente lascia ghiaccio troppo spesso per l'imaging. L'assenza di una striscia su entrambe le immagini indica un traspirante veloce che potrebbe non aver lasciato acqua nei fori (Figura S5). Diversi fattori come la densità dei nanofili, le impostazioni e la durata della pulizia del plasma e il tempo di esposizione e il livello impostato di umidità della camera possono influenzare la velocità di assorbimento. Una scarsa (lenta) traspirazione può essere il risultato di un rivestimento sparso di nanofili sulla griglia. Diluendo leggermente e aumentando il tempo di esposizione alla soluzione di nanofili¹⁶, la densità e la copertura dei nanofili sulle barre della griglia aumenteranno, facilitando una traspirazione più rapida. Se la densità del nanofilo è sufficiente, aumentare l'impostazione della potenza o la durata della pulizia al plasma migliorerà anche l'assorbimento. Le impostazioni consigliate qui sono relativamente a bassa potenza e lunga durata, ma possono essere modificate se necessario.

Tuttavia, se sia il lotto specifico di griglie che le impostazioni di pulizia del plasma hanno funzionato bene in una sessione precedente, le prestazioni di assorbimento lento possono derivare da un'eccessiva esposizione dei nanofili a un'elevata umidità all'interno della camera, portando alla loro saturazione con umidità e ridotta capacità di trattenere i liquidi. L'effetto di saturazione della griglia dell'umidità della camera può essere ridotto riducendo al minimo il tempo trascorso tra il montaggio della pinzetta e l'immersione della griglia o diminuendo il livello di umidità del sistema prima di un tuffo. Va notato, tuttavia, che quest'ultimo comporta il rischio associato che la punta caricata con il campione proteico si ostruisa. Per compensare questo rischio, tenere le punte nel sudario dove viene mantenuto un alto livello di umidità, può aumentare la quantità di tempo consentita per montare una pinzetta che tiene una nuova griglia. Infine, va notato che un tempo di immersione ridotto (ottenuto aumentando l'accelerazione della griglia e / o la velocità massima) può portare a griglie con ghiaccio più sottile senza effettivamente modificare le caratteristiche di assorbimento della griglia. Tuttavia, poiché anche il tempo di miscelazione dei due campioni sarà ridotto, il tempo di immersione non è un fattore che viene in genere modificato per affrontare l'assorbimento lento. Per affrontare l'assorbimento troppo veloce, con conseguente ghiaccio troppo sottile o assente nei fori della griglia, è possibile adottare l'opposto delle misure sopra descritte.

Spotiton presenta alcuni vantaggi e svantaggi rispetto ad altre tecniche sviluppate per studi risolti nel tempo al di sotto del secondo. Poiché la striscia di campione mista contiene solo 2-4 nL di liquido da ciascun distributore, una singola aliquota di 3 μL di ciascun campione è sufficiente per preparare molte griglie, un vantaggio chiave quando il campione è limitato. Inoltre, l'osservazione della deposizione del campione utilizzando telecamere integrate, sebbene non del tutto esclusiva di Spotiton^17,non è una caratteristica di altri dispositivi di miscelazione e consente alle griglie immerse di essere sottoposte a una valutazione pass/fail grezza, riducendo notevolmente i tempi di screening. Uno svantaggio chiave del sistema è un tempo minimo di miscelazione di 90 ms, limitato dalle limitazioni fisiche dei componenti meccanici, che mette fuori portata l'interrogazione di reazioni biologiche più veloci. In confronto, i tempi inferiori a 10 ms vengono regolarmente raggiunti su sistemi microfluidici esistenti. Sul sistema chameleon basato su Spotiton, disponibile in commercio, i miglioramenti di progettazione e costruzione hanno ridotto il tempo minimo di immersione a 54 ms e aumentato la possibilità che l'aggiunta di un secondo distributore possa consentire tempi di miscelazione più rapidi di quelli attualmente offerti da Spotiton.

Ad oggi, è stata condotta una serie di esperimenti per studiare stati molecolari precoci e di breve durata utilizzando Spotiton, tra cui l'assemblaggio del ribosoma 70S, i cambiamenti conformazionali innescati dal calcio in un canale ionico transmembrana e la costrizione della dinamina in risposta all'idrolisi GTP^15. Dalla pubblicazione di questi risultati, sono state incorporate diverse modifiche al sistema per migliorare il throughput, la riproducibilità e la reportistica delle sessioni di creazione della griglia Spotiton. Questi includono, tra gli altri, il sistema di monitoraggio e controllo automatico dell'umidità a doppia zona, la funzione di visualizzazione dell'esperimento, la funzione di ispezione della punta affiancata e diversi aggiornamenti minori all'interfaccia utente. Il sistema aggiornato supporterà meglio i futuri esperimenti di miscelazione a due campioni simili a quelli precedentemente riportati, nonché i saggi di legame rapido come tra una terapia a piccola molecola e il suo bersaglio proteico o persino la formazione di complessi anticorpo-antigene. Mentre gli esperimenti attuali e futuri risolti nel tempo che coinvolgono due partner interagenti continueranno sicuramente, l'aggiunta di un terzo distributore piezoelettrico e dell'hardware associato potrebbe ampliare ulteriormente la gamma di possibili esperimenti. Ad esempio, la deposizione iniziale di un detergente seguita dalla proteina di interesse, seguita dal ligando interagente o attivante, potrebbe rimuovere qualsiasi potenziale impatto negativo dell'esposizione prolungata al detergente, spesso necessario per prevenire risultati di imaging non ottimali comuni come l'orientamento preferito. Alla luce sia del lavoro già pubblicato che delle potenziali applicazioni future, Spotiton rappresenta uno strumento importante per la comunità crio-EM per facilitare la conduzione di studi risolti nel tempo al di sotto del secondo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer	N/A	N/A
cryogenic grid storage boxes	EMS (Hatfield, PA; USA)	N/A
Cu/Rh 300 mesh EM grids	EMS (Hatfield, PA; USA)	EMS300-Cu-Rh	treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)
ethane gas	TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)	N/A
Grid-handling forceps	EMS (Hatfield, PA; USA)	78320-5B
liquid nitrogen	Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)	N/A
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
Picosystem	Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)	N/A	water purification system
Protein/other sample	N/A	N/A
Solarus 950 plasma cleaner	Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)	N/A