Detecção e Análise Automatizada de Exocistose

Resumo

Desenvolvemos um software automatizado de visão computacional para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensíveis ao pH. Aqui, demonstramos o uso de uma interface gráfica de usuário e RStudio para detectar eventos de fusão, analisar e exibir parâmetros espátulais de fusão e classificar eventos em modos de fusão distintos.

Resumo

A microscopia timelapse TIRF de GFP sensível ao pH (pHluorin) anexada às proteínas SNARE vesículas é um método eficaz para visualizar eventos exocióticos vesículas únicos na cultura celular. Para realizar uma identificação e análise imparcial e eficiente de tais eventos, uma abordagem baseada em visão computacional foi desenvolvida e implementada no MATLAB. O pipeline de análise consiste em um algoritmo de segmentação celular e identificação de eventos exocióticos. A abordagem da visão computacional inclui ferramentas para investigar múltiplos parâmetros de eventos únicos, incluindo a meia-vida da decadência da fluorescência e do pico ΔF/F, bem como a análise de células inteiras da frequência da exocitese. Estes e outros parâmetros de fusão são usados em uma abordagem de classificação para distinguir modos de fusão distintos. Aqui uma GUI recém-construída realiza o pipeline de análise do início ao fim. Uma adaptação adicional da função K de Ripley no R Studio é usada para distinguir entre eventos de fusão agrupados, dispersos ou aleatórios no espaço e no tempo.

Introdução

Construções VAMP-pHluorin ou receptor de transferrina (TfR)-pHuji construções são excelentes marcadores de eventos exocióticos, pois estes fluoroforos sensíveis ao pH são extintos dentro do lúmen vesícula ácido e fluoresce imediatamente após a abertura do poro de fusão entre a vesícula e a membrana plasmática¹. Após a abertura dos poros de fusão, a fluorescência decai exponencialmente, com alguma heterogeneidade que revela informações sobre o evento de fusão. Aqui, um aplicativo de interface de usuário gráfico (GUI) é descrito que detecta e analisa automaticamente eventos exocióticos. Este aplicativo permite que o usuário detecte automaticamente eventos exocióticos revelados pelos marcadores sensíveis ao pH² e gere recursos de cada evento que podem ser usados para fins de classificação³ (Figura 1A). Além disso, a análise do agrupamento de eventos exocióticos usando a função K de Ripley é descrita.

A classificação automatizada de eventos exocióticos em diferentes modos exocióticos foi relatada recentemente³. Dois modos de exocistose, fusão de vesícula completa (FVF) e excitose de fusão de beijo e fuga (KNR) foram descritos anteriormente^4,5,6,7. Durante a FVF, o poro de fusão dilata, e a vesícula é incorporada na membrana plasmática. Durante o KNR, o poro de fusão abre transitoriamente e depois seeals^4,5,8,9,10. Foram identificados quatro modos de exocitose no desenvolvimento de neurônios, dois relacionados à FVF e dois relacionados à KNR. Este trabalho demonstra que tanto fvf quanto KNR podem ser subdivididos em eventos de fusão que procedem imediatamente à decadência de fluorescência (FVFi e KNRi) após abertura de poros de fusão ou eventos exocióticos que exibem um atraso após a abertura do poros de fusão antes da decadência da fluorescência (FVFd e KNRd)(Figura 1B). O classificador identifica o modo de exocitose para cada evento de fusão. Aqui esta análise foi incorporada em uma GUI que pode ser instalada em sistemas operacionais baseados em MATLAB em Windows e Mac. Todos os arquivos de análise podem ser encontrados em https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou
https://github.com/GuptonLab.

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Protocolo

1. Escolha conjuntos de dados e diretórios

1. Para selecionar conjuntos de dados para análise, clique no botão Encontrar Conjuntos de dados (Figura 2A, caixa vermelha 1) para navegar até a pasta onde os dados são depositados (por exemplo, pasta RawData). Os datafiles preencherão automaticamente os Arquivos de Dados como uma lista. Pode haver mais de um conjunto de dados na pasta.
2. Clique no botão Escolher Diretório e selecione o diretório (por exemplo, Teste) onde os arquivos analisados serão depositados(Figura 2A, caixa vermelha 2) . Um conjunto de pastas e arquivos de análise acabados, bem como imagens temporárias intermediárias serão criados neste diretório quando o botão Análise for pressionado. Erros serão produzidos se um diretório não for escolhido.

2. Defina o tamanho do pixel e a taxa de quadro

1. Preencha a taxa de quadros e o tamanho dos pixels apropriados na caixa apropriada "Framerate" ou "pixel size"(Figura 2A,caixa verde). Se não forem fornecidos valores (eles estão definidos como "0" padrão), o programa procurará os metadados associados ao arquivo para o framerate e o tamanho do pixel. Se esses valores não puderem ser encontrados, o programa será padrão para por pixel para medição e por período para pontos de tempo.
   NOTA: No exemplo fornecido, o framerate é de 100, e o tamanho do pixel é de 0,08.

3. Escolha ou faça máscaras

1. Use o botão Fabricante de máscaras para criar automaticamente máscaras celulares para os dados na lista de dataset do arquivo(Figura 2A, caixa azul). Ao usar o botão Mask Maker, uma nova pasta no diretório escolhido será criada chamada MaskFiles. O "indicador executar" ficará amarelo durante a corrida e voltará ao verde quando concluído.
   NOTA: Uma máscara para cada arquivo na lista arquivos de dados será criada a partir dos primeiros 10 quadros do arquivo de imagem (ou de todos os quadros se menos de 10 estiverem no arquivo de imagem) e depositada na pasta MaskFiles usando o esquema de nomeação adequado (descrito abaixo).
2. Certifique-se de que os arquivos da máscara presiram automaticamente a lista Arquivos de máscara. O usuário pode proceder diretamente à análise.
   NOTA: Verifique sempre os arquivos da máscara e confirme que eles capturam toda a região de interesse. O primeiro quadro do arquivo de dados e o arquivo da máscara são exibidos na interface do usuário quando selecionados. (Figura 2B). O Fabricante de Máscaras pode produzir erros no caso de baixo sinal para ruído, por isso a validação de que os arquivos de máscara são apropriados é fundamental para o controle de qualidade.
3. Como alternativa ao uso do Mask Maker, se o sinal de ruído de imagens for insuficiente, crie máscaras manualmente no ImageJ.
   1. Primeiro, abra o arquivo de imagem bruta em ImageJ (Figura 3A).
   2. Clique no botão Seleção de Polígono e clique para desenhar uma máscara ao redor da célula. Uma vez terminado, clique duas vezes no último ponto para completar o polígono.
   3. Uma vez terminado, navegue até Editar | | de seleção Criar máscara (Figura 3B). Uma nova máscara invertida será criada com base no desenho do polígono. Salve máscaras em uma pasta designada MaskFiles no diretório escolhido. O esquema de nomeação de arquivos de máscara deve corresponder aos arquivos de dados individuais correspondentes seguidos de "_mask_file". Por exemplo, se um arquivo de dados for chamado de "VAMP2_488_WT_1.tif", o arquivo de máscara correspondente deve ser chamado de "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
   4. Use o botão Find Maskfiles para navegar até a pasta escolhida de arquivos de máscara personalizados depositados. As máscaras preencherão os Arquivos de Máscaras como uma lista.
      NOTA: É importante ter uma máscara para cada arquivo de dados antes de executar a análise.

4. Análise e extração de recursos

1. Depois que o diretório for escolhido e a lista de arquivos de dados e a lista de arquivos máscaras forem preenchidas, clique no botão Análise (Figura 4A). Se for necessária a classificação dos eventos exocióticos, passe para a etapa 5.
   NOTA: O clique no botão Análise executará uma série de tarefas automatizadas para analisar os dados. Ele criará pastas individuais no diretório escolhido para depositar dados analisados. Durante a execução, o "indicador de execução" mudará de verde para amarelo(Figura 4A, caixa vermelha). Depois que a análise estiver concluída, isso mudará de volta para verde.
2. Encontre uma pasta DataFiles (Figura 4B) com o conjunto completo de arquivos de análise (bem como arquivos de extração de recursos, a serem usados posteriormente) nomeados de acordo com cada arquivo de dados(Figura 4C).
   NOTA: A descrição desses arquivos de análise está incluída abaixo na seção Resultados Representativos.

5. Classificação de eventos exocióticos

1. Para realizar a classificação simultânea de eventos exocióticos com detecção automatizada, verifique a caixa de seleção classificação antes de clicar no botão Análise. Para cada evento exociótico, atribua uma pontuação de probabilidade entre 0-1 para cada classe. Um evento exociótico é considerado classificado como uma das quatro classes se a pontuação de probabilidade para essa classe for > 0,5.
   NOTA: Uma vez concluída a análise, uma nova pasta de arquivo de dados aparecerá dentro do diretório escolhido. A pasta conterá arquivos de análise correspondentes a cada arquivo de imagem.

6. Análise espococrânica da exocistose utilizando os valores K de Ripley

1. Crie um arquivo de máscara "neurite" e "soma" separados. Primeiro, segmentar a soma do neurite. Não há um método imparcial para segmentar a soma dos neurites, de modo que o usuário deve ficar cego ao experimento de condicionamento e usar o melhor julgamento; sugere-se um elipsoide sem extensões neuritas óbvias.
2. Imagem AbertaJ/Fiji.
3. Arraste e solte o arquivo da máscara ou use o Arquivo | Abra e selecione o arquivo da máscara.
4. Use a ferramenta de coleta de cores e clique em qualquer um dos pixels pretos no fundo da máscara para definir a cor para preto.
5. Use a ferramenta de seleção de polígonos ou à mão livre para desenhar um contorno em torno da soma, separando-a dos neurites. Isso requer tomadas de decisão manuais.
6. Clique em Editar | | de seleção Faça máscara. Uma nova imagem será aberta com a soma circulada segmentada do resto da imagem. Isso criará um arquivo de máscara soma.
7. Sem mover a região desenhada, clique no cabeçalho do arquivo de máscara original.
8. Clique em Editar | Preencha para preencher a soma circulada para que apenas os neurites permaneçam a máscara.
9. Uma vez obtidos arquivos de neurite e máscara separados, salve ambos os arquivos da máscara.
10. Abra "neurite_2D_network" em Matlab.
11. No MATLAB, navegue até o diretório com todos os dados de análise.
12. Altere o caminho "nome da máscara" para o nome da máscara de neurite, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. Altere o "csv_file_name" para onde está localizado fluorescent_traces.csv arquivo, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
14. Clique em Executar para esqueletoizar o arquivo da máscara de neurite. Isso cria uma versão esqueletoizada do arquivo da máscara de neurite e deposita-o como um arquivo CSV sob a pasta maskfiles.
15. Em seguida, gere um arquivo CSV para a soma. Abra "CSV_mask_creator.m" em Matlab.
16. Coloque no caminho para o "nome da máscara" para o nome da máscara soma, ou seja, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Altere o "writematrix" para csv filename a ser criado, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. Clique em Executar. Isso cria o novo arquivo VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Repita 6.14 para cada arquivo de máscara.

7. Configuração rstudio

1. Abra rstudio e abra ripleys_k_analysis. Arquivo R.
2. Instale o pacote "spatstat" no RStudio indo para Ferramentas | Instalar pacotes e digitar em "spatstat" seguido de clique em Instalar.
   NOTA: Isso só precisa ser realizado uma vez por instalação de Rstudio.
3. Execute a biblioteca no início de cada sessão.
4. Preste atenção a duas variáveis principais neste caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". A Máscara de Neurônio aponta para o conjunto de arquivos de máscara para executar, ou seja, arquivos de máscara soma."
   NOTA: Execute todos os arquivos de máscara soma juntos, separadamente dos arquivos da máscara de Neurite, e vice-versa.
5. Leia na .csv dos arquivos da máscara para que cada um dos neurônios seja analisado.
6. Execute vários arquivos ao mesmo tempo copiando neuron_mask_n+1 adicionais. Isso permitirá agregar a análise de Ripley, usando o script descrito na seção 8.
7. Agora verifique a segunda variável, "neuron_datapoints".
8. Leia no." X_fluorescent_traces.csv" arquivo gerado pelo programa de análise (por recursos todos os extracted_R arquivo) com as posições x,y,t dos eventos exocióticos, bem como o arquivo específico de neurite das posições x,y para a rede 2D. Isso vai na posição "neuron_datapoints".
9. Em RStudio Select Code | | da Região Run Corra tudo. Isso gera várias tramas, incluindo os valores K agrupados de Ripley, bem como parcelas de densidade.
10. Salve parcelas indo para exportar | Salvar imagem como | Selecione o formato e o diretório de imagem apropriados e insira o nome do arquivo apropriado e clique em Salvar.
    NOTA: A função de plotagem para os heatmaps é chamada no script usando "plot (densidade (soma_data,0,4)". O número "0.4" aqui representa o quão suavizada deve ser a função de densidade. Ele pode ser alterado para se adequar aos dados do usuário de forma significativa, mas se as comparações forem realizadas entre diferentes mapas de calor, o número deve ser o mesmo entre eles.
11. Exportar ou Salvar imagem do Rstudio. Se um mapa de calor exigir uma edição mais aprofundada, escolha um tipo de arquivo apropriado (SVG ou EPS).

8. Análise de Ripley

NOTA: O Ripleys_k_analysis. O arquivo R também gerou automaticamente as parcelas de valor k da Ripley. A execução de todo o script executará automaticamente as funções mencionadas abaixo, mas está incluída em detalhes se desejar executar cada parte do script individualmente ou fazer alterações na análise.

1. Primeiro, execute a função envelope para cada célula. Esta função simulou aleatoriedade espacial completa (RSE) para testar o valor K do Ripley do padrão de ponto de evento exociótico contra.
   Data_envelope_1 = envelope (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = envelope (soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. Em seguida, unindo esses envelopes e criar uma estimativa de RSE para o grupo:
   Pool_csr = piscina (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Em seguida, execute a função K do Ripley para todos os pontos de dados.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, razão = TRUE)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, razão = TRUE)
3. Uma vez concluído, misture os valores K do Ripley e bootstrap seus intervalos de confiança com o seguinte comando:
   Pool de dados = pool (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Bootstrap com o seguinte comando:
   Final_Ripleys_K = varblock (fun = Kest, Data_pool)
5. Trace os dados.
6. Se for necessária uma diferença estatística, o Teste de Permutação Studentizada é incluído no pacote spatstat para testar uma diferença entre grupos de padrões de ponto:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).

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Resultados

Aqui a GUI (Figura 2A) foi utilizada para analisar eventos exocióticos de três neurônios vamp2-pHluorin expressando neurônios a 3 DIV utilizando microscopia DE TIRF (fluorescência de reflexão interna total). Os neurônios corticais E15,5 foram isolados, seguidos de transfecção com VAMP2-pHluorin e chapeamento utilizando os protocolos descritos em Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 2011^11,12. A metodologia dos parâmetr...

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Discussão

Ao usar o software de detecção e análise exocítico, considere que o programa só aceita compactação sem perdas .tif arquivos como entrada. Os arquivos de imagem .tif podem ser imagens de 8 bits, 16 bits ou 32 bits em escala de cinza (canal único). Outros formatos de imagem devem ser convertidos em um desses tipos antes da entrada. Para referência, exemplos usados aqui são imagens em escala de cinza de 16 bits.

Inerentes ao processo de detecção automatizada, os conjuntos de imagens t...

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