Rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un software automatizzato di visione artificiale per rilevare eventi esocitici contrassegnati da sonde fluorescenti sensibili al pH. Qui, dimostriamo l'uso di un'interfaccia utente grafica e RStudio per rilevare eventi di fusione, analizzare e visualizzare i parametri spaziotemporali di fusione e classificare gli eventi in modalità di fusione distinte.

Abstract

La microscopia TIRF timelapse di GFP pH-sensibile (pHluorin) attaccata alle proteine SNARE delle vescicole è un metodo efficace per visualizzare gli eventi esocitici delle singole vescicole in coltura cellulare. Per eseguire un'identificazione e un'analisi imparziali ed efficienti di tali eventi, è stato sviluppato e implementato in MATLAB un approccio basato sulla visione artificiale. La pipeline di analisi è costituita da una segmentazione cellulare e da un algoritmo di identificazione degli eventi esocitici. L'approccio di visione artificiale include strumenti per lo studio di più parametri di singoli eventi, tra cui l'emivita del decadimento di fluorescenza e il picco ΔF / F, nonché l'analisi a cellule intere della frequenza dell'esocitosi. Questi e altri parametri di fusione sono utilizzati in un approccio di classificazione per distinguere modalità di fusione distinte. Qui una GUI di nuova costruzione esegue la pipeline di analisi dall'inizio alla fine. Un ulteriore adattamento della funzione K di Ripley in R Studio viene utilizzato per distinguere tra evento di fusione raggruppato, disperso o casuale sia nello spazio che nel tempo.

Introduzione

I costrutti VAMP-pHluorin o i costrutti del recettore della transferrina (TfR)-pHuji sono eccellenti marcatori di eventi esocitici, poiché questi fluorofori sensibili al pH vengono spenti all'interno del lume della vescicola acida e fluoresceno immediatamente dopo l'apertura del poro di fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica¹. Dopo l'apertura dei pori di fusione, la fluorescenza decade in modo esponenziale, con una certa eterogeneità che rivela informazioni sull'evento di fusione. Qui viene descritta un'applicazione di interfaccia utente grafica (GUI) che rileva e analizza automaticamente gli eventi esocitici. Questa applicazione consente all'utente di rilevare automaticamente gli eventi esocitici rivelati dai marcatori sensibili al pH² e generare caratteristiche da ciascun evento che possono essere utilizzate ai fini della classificazione³ (Figura 1A). Inoltre, viene descritta l'analisi del clustering di eventi esocitici utilizzando la funzione K di Ripley.

La classificazione automatizzata degli eventi esocitici in diverse modalità esocitiche è stata recentemente riportata³. Due modi di esocitosi, fusione completa vescicolare (FVF) ed esocitosi da fusione kiss-and-run (KNR) sono stati precedentemente descritti^4,5,6,7. Durante la fecondazione in vitro, il poro di fusione si dilata e la vescicola viene incorporata nella membrana plasmatica. Durante KNR, il poro di fusione si apre transitoriamente e poi risigilla^4,5,8,9,10. Sono state identificate quattro modalità di esocitosi nello sviluppo dei neuroni, due relative alla FVF e due correlate alla KNR. Questo lavoro dimostra che sia FVF che KNR possono essere ulteriormente suddivisi in eventi di fusione che procedono immediatamente al decadimento della fluorescenza (FVFi e KNRi) dopo l'apertura dei pori di fusione o eventi esocitici che mostrano un ritardo dopo l'apertura dei pori di fusione prima dell'inizio del decadimento della fluorescenza (FVFd e KNRd) (Figura 1B). Il classificatore identifica la modalità di esocitosi per ogni evento di fusione. Qui questa analisi è stata incorporata in una GUI che può essere installata in MATLAB in sistemi operativi basati su Windows e Mac. Tutti i file di analisi sono disponibili all'https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.

Protocollo

1. Scegli set di dati e directory

1. Per selezionare i set di dati da eseguire per l'analisi, fare clic sul pulsante Trova set di dati (Figura 2A, casella rossa 1) per passare alla cartella in cui sono depositati i dati (ad esempio, cartella RawData). I file di dati popoleranno automaticamente i file di dati come elenco. Nella cartella possono essere presenti più set di dati.
2. Fare clic sul pulsante Scegli directory e selezionare la directory (ad esempio, Test) in cui verranno depositati i file analizzati (Figura 2A, casella rossa 2) . Un insieme di cartelle e file di analisi finiti, nonché immagini temporanee intermedie, verranno creati in questa directory quando si preme il pulsante Analisi. Gli errori verranno prodotti se non viene scelta una directory.

2. Imposta la dimensione dei pixel e il framerate

1. Inserisci la frequenza fotogrammi e la dimensione dei pixel appropriate delle immagini nell'apposita casella "Framerate" o "pixel size"(Figura 2A,casella verde). Se non vengono forniti valori (sono impostati su "0" predefinito), il programma cercherà i metadati associati al file per il framerate e la dimensione dei pixel. Se questi valori non vengono trovati, il programma verrà impostato per impostazione predefinita su per-pixel per la misurazione e per fotogramma per i punti temporali.
   NOTA: nell'esempio fornito, il framerate è 100 e la dimensione dei pixel è 0,08.

3. Scegli o crea maschere

1. Utilizzare il pulsante Mask Maker per creare automaticamente maschere di cella per i dati nell'elenco dei set di dati di file (Figura 2A, casella blu). Dopo aver utilizzato il pulsante Mask Maker, verrà creata una nuova cartella nella directory scelta chiamata MaskFiles. L'"Indicatore di esecuzione" diventerà giallo durante l'esecuzione e tornerà in verde al termine.
   NOTA: una maschera per ogni file nell'elenco File di dati verrà creata dai primi 10 fotogrammi del file di immagine (o da tutti i fotogrammi se sono presenti meno di 10 nel file di immagine) e depositata nella cartella MaskFiles utilizzando lo schema di denominazione appropriato (descritto di seguito).
2. Assicurarsi che i file maschera popolano automaticamente l'elenco File maschera. L'utente può procedere direttamente all'analisi.
   NOTA: controllare sempre visivamente i file maschera e confermare che acquisiscano l'intera regione di interesse. Il primo fotogramma del file di dati e il file maschera vengono visualizzati nell'interfaccia utente quando selezionata. (Figura 2B). Mask Maker può produrre errori in caso di basso rapporto segnale-rumore, quindi la convalida che i file maschera siano appropriati è fondamentale per il controllo di qualità.
3. In alternativa all'utilizzo di Mask Maker, se il segnale al rumore delle immagini è insufficiente, creare manualmente le maschere in ImageJ.
   1. Innanzitutto, aprire il file di immagine raw in ImageJ (Figura 3A).
   2. Fare clic sul pulsante Selezione poligono e fare clic per disegnare una maschera attorno alla cella. Una volta terminato, fare doppio clic sull'ultimo punto per completare il poligono.
   3. Una volta terminato, vai a Modifica | | di selezione Crea maschera (Figura 3B). Verrà creata una nuova maschera invertita in base al disegno poligonale. Salvare le maschere in una cartella MaskFiles designata nella directory scelta. Lo schema di denominazione dei file maschera deve corrispondere ai singoli file di dati corrispondenti seguiti da "_mask_file". Ad esempio, se un file di dati è denominato "VAMP2_488_WT_1.tif", il file maschera corrispondente deve essere denominato "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
   4. Utilizzare il pulsante Trova maskfiles per passare alla cartella scelta dei file maschera personalizzati depositati. Le maschere popoleranno i file maschera come elenco.
      NOTA: è importante disporre di una maschera per ogni file di dati prima di eseguire l'analisi.

4. Analisi ed estrazione delle feature

1. Dopo aver scelto la directory e popolato l'elenco File di dati e l'elenco File maschera, fare clic sul pulsante Analisi (Figura 4A). Se è richiesta la classificazione degli eventi esocitici, passare al passaggio 5.
   NOTA: il clic sul pulsante Analisi eseguirà una serie di attività automatizzate per analizzare i dati. Creerà singole cartelle nella directory scelta per depositare i dati analizzati. Durante l'esecuzione, l'"indicatore di corsa" cambierà da verde a giallo (Figura 4A, casella rossa). Al termine dell'analisi, questo tornerà in verde.
2. Trovare una cartella DataFiles (Figura 4B) con il set completo di file di analisi (nonché i file di estrazione delle feature, da utilizzare nella classificazione successiva) denominati in base a ciascun file di dati (Figura 4C).
   NOTA: una descrizione di questi file di analisi è inclusa di seguito nella sezione Risultati rappresentativi.

5. Classificazione degli eventi esocitici

1. Per eseguire la classificazione simultanea degli eventi esocitici con rilevamento automatico, selezionare la casella di controllo Classificazione prima di fare clic sul pulsante Analisi. Per ogni evento esocitico, assegna un punteggio di probabilità compreso tra 0-1 per ogni classe. Un evento esocitico è considerato classificato come una delle quattro classi se il punteggio di probabilità per quella classe è > 0,5.
   NOTA: una volta completata l'analisi, verrà visualizzata una nuova cartella di file di dati all'interno della directory scelta. La cartella conterrà i file di analisi corrispondenti a ciascun file di immagine.

6. Analisi spaziotemporale dell'esocitosi utilizzando i valori K di Ripley

1. Creare un file maschera "neurite" e "soma" separato. In primo luogo, segmentare il soma dal neurite. Non esiste un metodo imparziale per segmentare il soma dai neuriti, quindi l'utente dovrebbe essere accecato dall'esperimento di condizionamento e usare il miglior giudizio; si suggerisce un ellissoide senza estensioni evidenti di neurite.
2. Apri ImageJ/Fiji.
3. Trascinare e rilasciare il file maschera o utilizzare File | Aprire e quindi selezionare il file maschera.
4. Utilizzate lo strumento di selezione colore e fate clic su uno qualsiasi dei pixel neri sullo sfondo della maschera per impostare il colore su nero.
5. Usa lo strumento di selezione dei poligoni o a mano libera per disegnare un contorno attorno al soma, separandolo dai neuriti. Ciò richiede un processo decisionale manuale.
6. Fai clic su Modifica | | di selezione Crea maschera. Si aprirà una nuova immagine con il soma cerchiato segmentato dal resto dell'immagine. Questo creerà un file di maschera soma.
7. Senza spostare la regione disegnata, fare clic sull'intestazione del file maschera originale.
8. Fai clic su Modifica | Riempire per riempire il soma cerchiato in modo che solo i neuriti rimangano la maschera.
9. Una volta ottenuti i file di neurite e maschera separati, salvare entrambi i file maschera.
10. Apri "neurite_2D_network" in Matlab.
11. In MATLAB, vai alla directory con tutti i dati di analisi.
12. Modificare il percorso "nome maschera" con il nome della maschera neurite, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. Modificare il "csv_file_name" in cui si trova fluorescent_traces.csv file, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
14. Fare clic su Esegui per scheletrare il file della maschera di neurite. Questo crea una versione scheletrata del file maschera neurite e lo deposita come file CSV nella cartella maskfiles.
15. Quindi, genera un file CSV per il soma. Apri "CSV_mask_creator.m" in Matlab.
16. Inserisci il percorso per il "nome maschera" al nome della maschera soma, ad es. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Cambia il "writematrix" in nome file csv da creare, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. Fare clic su Esegui. In questo modo viene creato il nuovo file VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Ripetere la 6.14 per ogni file maschera.

7. Configurazione di RStudio

1. Apri Rstudio e apri ripleys_k_analysis. R.
2. Installa il pacchetto "spatstat" in RStudio andando su Strumenti | Installa pacchetti e digita "spatstat" seguito da Installa.
   NOTA: questo deve essere eseguito solo una volta per l'installazione di Rstudio.
3. Eseguire lo spatstat della libreria all'inizio di ogni sessione.
4. Presta attenzione a due variabili principali in questo caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". Neuron Mask punta al set di file maschera da eseguire, cioè file maschera soma.
   NOTA: eseguire tutti i file della maschera soma insieme, separatamente dai file maschera neurite e viceversa.
5. Leggi nella .csv dei file della maschera per ciascuno dei neuroni da analizzare.
6. Esegui più file contemporaneamente copiando neuron_mask_n+1 aggiuntivi. Ciò consentirà di aggregare insieme l'analisi di Ripley, utilizzando lo script descritto nella sezione 8.
7. Ora controlla la seconda variabile, "neuron_datapoints".
8. Leggi nella." X_fluorescent_traces.csv" generato dal programma di analisi (dalle caratteristiche di tutti i extracted_R file) con le posizioni x,y,t degli eventi esocitici, nonché il file specifico del neurite delle posizioni x,y per la rete 2D. Questo va nella posizione "neuron_datapoints".
9. In RStudio selezionare il codice | | dell'area di esecuzione Esegui tutto. Questo genera diversi grafici, inclusi i valori K di Ripley raggruppati e i grafici di densità.
10. Salva i grafici andando su Esporta | Salva immagine con nome | Selezionare il formato immagine e la directory appropriati e immettere il nome file appropriato, quindi fare clic su Salva.
    NOTA: la funzione di plottaggio per le mappe di calore viene chiamata nello script usando "plot(density(soma_data,0.4))". Il numero "0.4" qui rappresenta quanto dovrebbe essere appianata la funzione di densità. Può essere modificato per adattarsi ai dati dell'utente in modo significativo, ma se devono essere eseguiti confronti tra diverse mappe di calore, il numero deve essere lo stesso tra di loro.
11. Esporta o salva l'immagine da Rstudio. Se una mappa di calore richiede ulteriori modifiche, scegli un tipo di file appropriato (SVG o EPS).

8. L'analisi di Ripley

NOTA: il Ripleys_k_analysis. Il file R generava automaticamente anche i grafici del valore k di Ripley. L'esecuzione dell'intero script eseguirà automaticamente le funzioni menzionate di seguito, ma è incluso in dettaglio se si desidera eseguire ogni parte dello script individualmente o apportare modifiche all'analisi.

1. Innanzitutto, eseguire la funzione di inviluppo per ogni cella. Questa funzione ha simulato la randomità spaziale completa (CSR) per testare il valore K di Ripley del modello del punto di evento esocitico rispetto a.
   Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. Quindi, raggruppa queste buste e crea una stima della CSR per il gruppo:
   Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Quindi, eseguire la funzione K di Ripley per tutti i punti dati.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, rapporto = VERO)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)
3. Una volta completato, raggruppare i valori K di Ripley e avviare i relativi intervalli di confidenza con il seguente comando:
   Pool di dati = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Bootstrap con il seguente comando:
   Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
5. Traccia i dati.
6. Se è richiesta una differenza statistica difficile, Studentised Permutation Test è incluso nel pacchetto spatstat per testare una differenza tra gruppi di modelli di punti:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).

Risultati

Qui la GUI (Figura 2A) è stata utilizzata per analizzare gli eventi esocitici di tre neuroni che esprimono VAMP2-pHluorina a 3 DIV utilizzando la microscopia TIRF (total internal reflection fluorescence). I neuroni corticali E15.5 sono stati isolati, seguiti da trasfezione con VAMP2-pHluorin e placcatura utilizzando i protocolli come delineato in Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 2011^11,12. La metodologia dei parametri di im...

Discussione

Quando si utilizza il software di rilevamento e analisi esocitica, si prega di considerare che il programma accetta solo la compressione senza perdita di dati .tif file come input. I file di immagine .tif possono essere immagini in scala di grigi (canale singolo) a 8 bit, 16 bit o a 32 bit. Altri formati di immagine devono essere convertiti in uno di questi tipi prima dell'input. Per riferimento, gli esempi utilizzati qui sono immagini in scala di grigi a 16 bit.

Inerenti al processo di rileva...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/