Avaliando as respostas imunes respiratórias ao Haemophilus influenzae

Resumo

Haemophilus influenzae induz inflamação no trato respiratório. Este artigo se concentrará no uso da citometria de fluxo e microscopia confocal para definir respostas imunes por fagócitos e linfócitos em resposta a essa bactéria.

Resumo

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria prevalente encontrada em uma variedade de condições respiratórias. Uma variedade de diferentes ensaios/técnicas podem ser usados para avaliar a resposta imunológica/inflamatória respiratória a esta bactéria. A citometria de fluxo e a microscopia confocal são tecnologias baseadas em fluorescência que permitem a caracterização detalhada das respostas biológicas. Diferentes formas de antígeno Hi podem ser usadas, incluindo componentes da parede celular, preparações mortas / inativadas e bactérias vivas. Oi é uma bactéria fastidiosa que requer meios enriquecidos, mas geralmente é fácil de cultivar em ambientes laboratoriais padrão. Amostras de tecido para estimulação com Hi podem ser obtidas de sangue periférico, broncoscopia ou pulmão ressecado (por exemplo, em pacientes submetidos à cirurgia para o tratamento do câncer de pulmão). A função dos macrófagos e neutrófilos pode ser avaliada de forma abrangente usando citometria de fluxo com uma variedade de parâmetros medidos, incluindo fagocitose, espécies reativas de oxigênio e produção de citocinas intracelulares. A função dos linfócitos (por exemplo, função das células T e das células NK) pode ser especificamente avaliada usando citometria de fluxo, principalmente para a produção de citocinas intracelulares. A infecção por Hi é um potente indutor da produção de armadilhas extracelulares, tanto por neutrófilos (TNEs) quanto por macrófagos (METs). A microscopia confocal é, sem dúvida, a maneira mais ideal de avaliar a expressão de TNE e MET, que também pode ser usada para avaliar a atividade da protease. A imunidade pulmonar ao Haemophilus influenzae pode ser avaliada usando citometria de fluxo e microscopia confocal.

Introdução

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria comensal normal presente na faringe da maioria dos adultos saudáveis. O Hi pode ter uma cápsula de polissacarídeo (tipos A-F, por exemplo, tipo B ou HiB) ou não ter uma cápsula e ser indigitável (NTHi)¹. A colonização da mucosa com essa bactéria inicia-se na primeira infância, e há uma rotatividade de diferentes cepas colonizadoras². Esta bactéria também é capaz de invasão do trato respiratório superior e inferior; nesse contexto, pode induzir a ativação da resposta imune e a inflamação ^3,4. Essa resposta inflamatória pode causar doença clínica e contribuir para uma variedade de condições respiratórias importantes, incluindo sinusite, otite média, bronquite, fibrose cística, pneumonia e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A maioria dessas condições é devida a cepas NTHi². Este artigo descreverá métodos para avaliar as respostas imunes respiratórias à Hi usando citometria de fluxo e microscopia confocal.

Os métodos descritos a seguir foram adaptados de técnicas bem estabelecidas que foram modificadas para avaliar a resposta inflamatória à Hi. A seleção de uma forma antigênica apropriada de Hi é uma parte fundamental desta avaliação. As preparações antigênicas variam de componentes da parede celular a bactérias vivas. Para estabelecer e padronizar ensaios, o uso de amostras de sangue periférico pode ser muito útil inicialmente.

A citometria de fluxo permite a medição de uma variedade de parâmetros e ensaios funcionais a partir de uma amostra a nível celular. Essa técnica tem a vantagem de que respostas celulares específicas (por exemplo, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou produção intracelular de citocinas) podem ser avaliadas quando comparadas a outros métodos mais gerais, como ensaio imunoenzimático (ELISA) ou ELISspot.

As armadilhas extracelulares são expressas por neutrófilos (TNEs)^5,6,7 e por outras células^, como macrófagos (METs)⁸. São cada vez mais reconhecidos como uma resposta inflamatória chave, particularmente na infecção pulmonar⁹. Eles podem ser avaliados por microscopia de fluorescência confocal. Essa técnica permite a identificação definitiva de TNEs/METs e distingue sua expressão de outras formas de morte celular⁶.

Tanto a citometria de fluxo quanto a microscopia confocal são ensaios baseados em fluorescência. Seu sucesso depende de protocolos de esforço ideais de amostras biológicas. Esses métodos levam algum tempo para aprender e exigem conhecimentos de supervisão apropriados. Os instrumentos envolvidos também são caros tanto para comprar quanto para executar. O cenário ideal para seu uso inclui grandes universidades e hospitais terciários de referência.

Os métodos utilizados neste protocolo são transferíveis para o estudo de outros organismos semelhantes envolvidos em doenças respiratórias (por exemplo, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi também interage com outras bactérias respiratórias comuns¹⁰.

Protocolo

Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa com seres humanos da Monash Health. O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos.

1. Preparação antigénica

NOTA: Três preparações antigênicas diferentes podem ser usadas para avaliar a resposta imune ao Hi. Estes são 1) um componente subcelular (tipicamente da parede celular bacteriana); 2) bactérias mortas e inativadas; e 3) bactérias vivas. Determinar o uso de cada preparação antigênica antes do início de quaisquer experimentos.

1. Componentes subcelulares
   1. Obter componentes subcelulares de fontes, incluindo preparações comerciais, componentes desenvolvidos internamente e/ou de outros investigadores.
      NOTA: Componentes subcelulares geralmente da parede celular bacteriana podem ser utilizados e incluem proteínas da membrana externa, como P6 e lipooligossacarídeo (LOS)^11,12. Esses componentes subcelulares são geralmente derivados em centros especializados. A descrição de como eles são feitos está além do escopo deste artigo. Recomenda-se o contato direto com especialistas neste campo para obter esses componentes.
2. Bactérias mortas/inativadas
   1. Obtenha as bactérias da amostra apropriada (por exemplo, escarro ou broncoscopia). Confirmar a estirpe como H. influenzae utilizando um laboratório de microbiologia adequado. Realizar a tipagem das amostras de H. influenzae para confirmar que elas não são tipáveis (por um laboratório especializado em microbiologia).
   2. Para obter um antígeno representativo, use várias cepas NTHi (pelo menos 5, cada uma com aproximadamente a mesma quantidade) para produzir um antígeno agrupado. Armazenar as cepas a -70 °C em caldo de glicerol em tubos de microcentrífuga.
      NOTA: Neste experimento, dez cepas distintas foram utilizadas.
   3. Descongele as cepas (um tubo de microcentrífuga de cada vez) em placas de ágar chocolate e cresça durante a noite em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂. Adicione as bactérias a 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lave-as duas vezes (gire a 300 x g por 5 min). Use um padrão MacFarland 10 ou um espectrofotômetro¹³ para alíquota NTHi a uma concentração de^{10 8} mL (usando um recipiente de 5 mL ou equivalente).
   4. O calor inativa as bactérias colocando-as em banho-maria a uma temperatura de 56 °C durante 10 minutos.
   5. Sonicate as bactérias usando uma configuração de sonicação contínua em uma velocidade de baixa a média faixa por 30 s.
   6. Aliquotar o volume adequado de amostras em tubos de microcentrífuga. Para uma amostra de 10⁸ mL, use alíquotas de 50 μL (ou seja, 20 amostras por mL), congele-as a -70 °C até que sejam necessárias¹⁴.
3. Bactérias vivas
   1. Primeiro, caracterizar as bactérias vivas, conforme mencionado na etapa 1.2.1. Use uma cepa bem caracterizada. Certifique-se de que a cepa também é armazenada em caldo de glicerol a -70 ° C como reserva.
   2. Cultive as bactérias em meios enriquecidos, como pratos de ágar chocolate ou em caldo.
      1. Para usar placas de ágar de chocolate, espalhe as bactérias por um mínimo de cada 3-4 dias com espalhadores estéreis.
      2. Alternativamente, use caldo de infusão cardíaca cerebral (BHI) enriquecido com fatores X (hemina) e V (dinucleotídeo de adenina β-nicotinamida) para cultivar as bactérias. Inocular NTHi de placas noturnas em 5-10 mL de caldo BHI suplementado com hemina e dinucleotídeo de adenina de β-nicotinamida (ambos 10 μg/mL) e cultura durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
         NOTA: Isso tem a vantagem da reprodutibilidade, maiores contagens de unidades formadoras de colônias (UFC) e todas as bactérias estarem em uma fase semelhante de crescimento logarítmico (em placas, a viabilidade bacteriana pode ser maior dependendo da posição na cultura)^13,15.
   3. Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 bactérias para uma célula para provocar uma forte resposta imune, mantendo a viabilidade celular. Use o MacFarland Standard¹⁰ ou o espectrofotômetro¹³ para avaliar o número de bactérias.
   4. Certifique-se de que o meio usado para ensaios de NTHi ao vivo esteja livre de qualquer soro humano, pois isso matará as bactérias¹⁶. Amostras de soro animal (por exemplo, soro fetal de bezerro) geralmente não causam nenhum problema.
      NOTA: Use os métodos descritos abaixo para analisar amostras de tecido padrão, como sangue periférico, amostras de broncoscopia (particularmente lavagem broncoalveolar (LBA)) e tecido pulmonar ressecado. Incubar as amostras com antígeno Hi de 10 min a 24 h ou mais.

2. Avaliação da função fagocítica por citometria de fluxo

NOTA: Este ensaio requer células em solução e é normalmente feito no sangue total ou usando fluido de LBA. Este ensaio é modificado a partir de um protocolo previamente publicado baseado no uso de preparação inativada de Staphylococcus aureus e Pansorbina¹⁷. O sangue total inativado e o H. influenzae fixo são substituídos pela Pansorbina¹⁷.

1. Misture NTHi (1.2) inativado e morto com iodeto de propídio (PI) a 100 μg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 por 30 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min e, em seguida, lavar em 500 μL de PBS. Gire a 450 x g por 5 min e ressuscite o pellet em 500 μL de PBS.
2. Incubar 450 μL de sangue periférico (a partir de punção venosa de um sujeito humano) com 50 μL de IP inativado marcado com H. influenzae durante 20 minutos em banho-maria a 37 °C num tubo de 5 ml.
3. Retirar as amostras do banho-maria e adicionar 5 μL de diidrorodamina-1,2,3 (DHR). Vórtice por 10 s, e depois coloque-o de volta no banho-maria por mais 10 minutos.
4. Remova as amostras do banho-maria e lise os eritrócitos (500 μL de volume, conforme listado acima na etapa 2.2) com 10:1 (ou seja, 5 mL) de cloreto de amônio a 0,8% (150 mM NH₄Cl, 1 mM NaHCO₃ e 0,1 mM EDTA) solução.
   NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado como o Q-prep pode ser usado.
5. Analise as amostras em um citômetro de fluxo dentro de uma hora. Analisar um mínimo de 3.000-5.000 células (de cada subconjunto de interesse) de cada amostra para obter resultados representativos (Figura 1).
   1. Para analisar as amostras para fagocitose, determine a proporção de células que ingeriram bactérias marcadas (meça a proporção de células com a coloração fluorescente).
   2. Quantificar as EROs pela oxidação do DHR, o que resulta em um sinal fluorescente (a mudança na fluorescência mediana é comparada entre as amostras basais e estimuladas).
      NOTA: Os neutrófilos são mais granulares e têm mais dispersão lateral, enquanto os macrófagos são maiores e têm mais dispersão para a frente.
   3. Distinguir os neutrófilos e macrófagos morfologicamente uns dos outros pelo seu tamanho (macrófagos são maiores) e granularidade (neutrófilos são mais granulares).
      NOTA: Marcadores específicos para neutrófilos e macrófagos geralmente não são usados, embora o CD14 possa ser usado para rotular monócitos sanguíneos. A citometria de fluxo pode potencialmente ser usada para distinguir entre diferentes formas funcionais de monócitos e macrófagos (por exemplo, subconjuntos M1 e M2)¹⁸.
6. Modifique o ensaio conforme apropriado (por exemplo, use NTHi vivo não marcado para estimular os fagócitos e medir a expressão de EROs por clivagem DHR).
   1. Isolar células mononucleares do sangue periférico por centrifugação de gradiente de densidade. Colocar o sangue sobre o polímero designado para centrifugação do gradiente de densidade e fiar a 2300 x g durante 30 min. Remova a camada mononuclear usando uma pipeta, lave-a duas vezes com PBS e ressuspenda as células em PBS a 10⁶ células por mL.
   2. Como alternativa, use macrófagos BAL.
   3. Suspender os monócitos/macrófagos na concentração de 10^{a 6} células/mL no meio de cultura (IRPM). Infecte-os com NTHi vivo a um MOI de 100:1 por 1 h, conforme descrito na etapa 1.3.
   4. Adicione DHR à suspensão conforme descrito na etapa 2.3 por 10 minutos. Realizar a análise de EROs usando citometria de fluxo.

3. Avaliação da função dos linfócitos no sangue periférico

1. Utilizar preparações de sangue total ou de células mononucleares para ensaios de citometria de fluxo¹⁴.
2. Adquira amostras de cada sujeito por punção venosa. Coletar 4 mL de sangue de uma veia periférica em um tubo de heparina de lítio e dividir as amostras em alíquotas para controle e estimulação de antígenos.
3. Adicionar anticorpos costimulatórios (anti-CD28 e CD49d, 1 μL/mL) a ambas as amostras. Adicionar NTHi à amostra de antigénio e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 1 h. Para a preparação de NTHi morta, adicione 200 μL do antígeno a 2 mL de sangue. Para NTHi vivos, adicione células NTHi vivas a um MOI de 100:1 aos glóbulos brancos (conforme medido pelo hemocitômetro).
4. Adicionar o agente bloqueador de Golgi Brefeldina A (10 μL/mL) às amostras e incubá-las por mais 5 h.
   NOTA: O bloqueio do aparelho de Golgi impede que as citocinas sejam exportadas para fora da célula.
5. Se for utilizado sangue total, lise os eritrócitos com cloreto de amónio a 0,8% (passo 2.4) para deixar apenas leucócitos em solução. Fixe os leucócitos usando 500 μL de paraformaldeído a 1%-2% por 1 h.
6. Conte as células por hemocitômetro, permeabilize 10⁶ células com 100 μL de saponina a 0,1% por 15 min e incube as células com anticorpos marcados com fluorescência. Lave as células e analise-as usando um citômetro de fluxo.
   NOTA: A quantidade de anticorpos marcados com fluorescência será específica para cada citocina. Siga as instruções do fabricante. Normalmente, 10⁶ células em 100 μL de solução serão coradas por 1 h. A maioria dos anticorpos obtidos comercialmente será suficiente para realizar 25-100 testes.
7. Determinar a proporção de células que respondem ao antígeno por meio do controle da população de linfócitos relevante (as células são ativadas por CD45, depois por CD3 e, posteriormente, por expressão de CD4 ou CD8), conforme mostrado na Figura 2. Realizar coloração de fundo em células não estimuladas para todas as citocinas a serem analisadas. Rastreie 100.000 células para analisar cada citocina para ambas as células estimuladas e controle.

4. Avaliação da função dos linfócitos/mediadores inflamatórios no tecido pulmonar

1. Geralmente não é possível obter linfócitos suficientes a partir da broncoscopia; portanto, use o tecido pulmonar de amostras de lobectomia. A otimização de amostras de tecido pulmonar requer uma estreita ligação com o serviço de patologia anatômica. Certifique-se de que o tecido tenha uma margem de pelo menos 3 cm do tumor e seja o tecido celular sem enfisema significativo (conforme determinado pelo patologista).
2. Quebre o tecido pulmonar em uma suspensão celular antes que ele possa ser usado para ensaios de citometria de fluxo. Digerir o tecido pulmonar quimicamente (por exemplo, com colagenase) ou desagregá-lo mecanicamente.
   NOTA: A desagregação mecânica do tecido pode ser preferida, pois está associada a uma melhor coloração superficial das células (por exemplo, marcação CD3/4)¹⁹.
   1. Obter amostras de lobectomia de um patologista (geralmente obtidas de pacientes submetidos ao tratamento de câncer de pulmão). Fatie cerca de 20-40 g da amostra em seções de^{3-5 mm 3} . Colocá-los dentro de uma câmara estéril de 50 μL antes de serem mecanicamente fragmentados usando um desagregador apropriado.
   2. Após a desagregação tecidual, lise os glóbulos vermelhos com 0,8% NH 4 Cl, conforme mencionado na etapa_2.4.
   3. Ressuspenda as células em RPMI estéril (o volume dependerá do número de células e geralmente é de 10-20 mL) e, em seguida, filtre-as através de uma malha de nylon estéril de 100 μm. Conte o número de células viáveis usando o método de exclusão azul de tripano.
3. Ensaio de infecção NTHi
   1. Ressuspender as células pulmonares para uma concentração celular final de 4 x 10⁶ células/mL por tubo (amostras de controle e estimuladas).
   2. Use uma suspensão de 4 x 10 6-6 x 10⁶ células em 1 mL de RPMI para o tubo de controle (negativo). Use a mesma quantidade para o tubo NTHi (qualquer amostra adicional pode ser usada como um controle positivo com SEB). Infecte as células no tubo NTHi a um MOI de 100 bactérias por célula. Solte a tampa meia rotação para permitir a transferência de gás nos tubos.
   3. Colocar as células num rotador de tubo e incubá-las a 37 °C enquanto gira a 12 rpm.
   4. Para evitar a exportação extracelular de citocinas, adicionar um bloqueador de Golgi (Brefeldina A) às suspensões celulares 1 h após a estimulação a uma concentração final de 10 μg/mL. Devolver as suspensões celulares para uma incubação adicional de 16-22 horas em rotação (passo 4.3.3).
   5. Lavar a suspensão celular com 500 μL de PBS contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA) e 0,01% de NaN3. Fixar e permeabilizar as células, conforme descrito nas etapas 3.5 e 3.6, respectivamente.
   6. Adicionar os anticorpos para a coloração intracelular de citocinas (a escolha dos anticorpos deve ser determinada pelo investigador, conforme listado na NOTA na etapa 3.6). Coloração da suspensão celular para marcadores específicos da superfície celular de linfócitos humanos (por exemplo, CD45, CD3, etc.) por 1 h. Lave as células com PBS, fixe-as e permeabilize-as conforme descrito nas etapas 3.5-3.6.
   7. Incubar as células com anticorpos intracelulares de coloração de citocinas (por exemplo, IFN-γ e TNF-α ou IL-13 e IL-17A) por 1 h.
      NOTA: Recomenda-se corar os marcadores de superfície primeiro, depois intracelular, pois a fixação pode causar alterações conformacionais nas proteínas de superfície às quais os anticorpos se ligam.
   8. Lavar as células com 500 μL de PBS e ressuspender em 100 μL de PBS antes da aquisição dos dados em citômetro de fluxo.
4. Um ensaio de matriz de contas pode ser usado em conjunto para analisar o sobrenadante descrito na etapa 3.2 (Execute isso sem Brefeldina A). Isso permite a análise de uma ampla variedade de diferentes mediadores inflamatórios (potencialmente até 40-50 mediadores). Recolher o sobrenadante em alíquotas de 100 μL e conservar a -70 °C até estarem prontos para análise. Alternativamente, pode-se usar ensaios quimioluminescentes multiplex²⁰.
   1. Use matrizes de contas multiplex para analisar as amostras descongeladas. Use o sobrenadante armazenado para analisar a produção de citocinas seguindo as instruções do fabricante.
   2. Realizar a aquisição da matriz de esferas multiplex em um citômetro de fluxo. Use o software relevante para executar a análise de dados a jusante.
      NOTA: Este ensaio de matriz de esferas também pode ser realizado em sobrenadantes de sangue periférico e/ou amostras de LBA.

5. Avaliação da proteólise pulmonar por microscopia confocal

NOTA: A microscopia confocal fluorescente é complementar à citometria de fluxo e pode ser usada para avaliar as respostas inflamatórias da protease e das EROs. Armadilhas extracelulares, como TNEs e METs, são compostas de cromatina extracelular (DNA) com outros mediadores inflamatórios, particularmente proteases, como elastase de neutrófilos (NE) e metaloproteinases de matriz (MMP). Eles podem ser avaliados em LBA e tecido pulmonar por meio de microscopia confocal, o que já foi descrito anteriormente por Sharma, R. et ^al.21.

1. Avaliar a expressão direta de protease no tecido pulmonar (conforme descrito na etapa 4.2.1) usando microscopia confocal e zimografia in situ ^15,17.
   1. Use tecido pulmonar fresco ou congelado não fixo. Monte as seções cortadas a uma espessura de 4 μm em lâminas de supergeada/adesão. Pré-aqueça as seções em tampão de reação 1x por 5 min.
   2. Adicione substrato de gelatina marcado com fluoresceína (30 μg/mL por seção) diretamente em lâminas individuais para medir a proteólise através da ação de metaloproteinases.
   3. Colocar as lâminas numa posição horizontal e incubar numa câmara humidificada e protegida contra a luz a 37 °C durante 1 h.
   4. Lave as seções em buffer de reação 1x antes de serem montadas.
   5. Como controle negativo, adicione apenas o tampão de reação sem gelatina fluorescente às seções.
   6. Use um microscópio confocal para testar a lise do substrato por exame. Use ImageJ para determinar a área do pulmão com evidência de proteólise. Para isso, meça a área pulmonar que tem coloração acima do fundo da amostra extinta. Como outro controle, utilizar o tecido pulmonar sem gelatina fluorescente adicionado¹⁵.
      Observação : execute isso em um mínimo de 10 campos de exibição de alta potência (FOV) para cada amostra.
2. Medir a expressão extracelular de EROs no tecido pulmonar por imunorreatividade à 3-nitrotirosina (um produto tóxico de estresse oxidativo)¹³.

Resultados

Os resultados representativos mostram como as respostas imunes inflamatórias à NTHi podem ser avaliadas/quantificadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Uma parte fundamental da interpretação dos resultados é a comparação em fluorescência entre amostras controle e estimuladas. Uma série de experimentos preliminares são geralmente necessários para otimizar a coloração das amostras. Quantas cores diferentes podem ser examinadas simultaneamente dependerá do número de canais disponíveis no citôm...

Discussão

Os métodos aqui listados utilizam citometria de fluxo baseada em fluorescência e técnicas de microscopia confocal que podem ser usadas em conjunto para obter informações detalhadas sobre a resposta inflamatória pulmonar à Hi.

Estabelecer a formulação antigênica apropriada de Hi a ser usada é fundamental, e é aconselhável ter informações específicas de um microbiologista a esse respeito. Live Hi induz uma resposta mais forte, enquanto as preparações de Hi mortas e os component...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Thermofisher	16-0289-81
CD49d	Thermofisher	534048
DAPI prolong gold	Thermofisher	P36931
DHR123	Sigma Aldrich	109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh	Becton Dickinson	340606
Gelatin substrate, Enzchek	Molecular probes	E12055
MACS mix tube rotater	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		Catalogue number not available
Medicons 50 µm	Becton Dickinson	340592
Pansorbin	Sigma Aldrich	507858
Propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Saponin	Sigma Aldrich	8047152
Superfrost slides	Thermofisher	11562203