Оценка респираторных иммунных реакций на Haemophilus Influenzae

Резюме

Haemophilus influenzae вызывает воспаление в дыхательных путях. Эта статья будет посвящена использованию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии для определения иммунных реакций фагоцитов и лимфоцитов в ответ на эту бактерию.

Аннотация

Haemophilus influenzae (Hi) является распространенной бактерией, обнаруженной в ряде респираторных заболеваний. Различные анализы / методы могут быть использованы для оценки респираторного иммунного / воспалительного ответа на эту бактерию. Проточная цитометрия и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными технологиями, которые позволяют детально характеризовать биологические реакции. Могут быть использованы различные формы антигена Hi, включая компоненты клеточной стенки, убитые / инактивированные препараты и живые бактерии. Hi - это привередливая бактерия, которая требует обогащенных сред, но, как правило, легко выращивается в стандартных лабораторных условиях. Образцы тканей для стимуляции Hi могут быть получены из периферической крови, бронхоскопии или резецированного легкого (например, у пациентов, перенесших операцию по лечению рака легких). Функция макрофагов и нейтрофилов может быть всесторонне оценена с использованием проточной цитометрии с различными измеренными параметрами, включая фагоцитоз, активные формы кислорода и внутриклеточную продукцию цитокинов. Функция лимфоцитов (например, функция Т-клеток и NK-клеток) может быть специально оценена с помощью проточной цитометрии, главным образом для внутриклеточной продукции цитокинов. Hi-инфекция является мощным индуктором внеклеточной ловушки, как нейтрофилами (NETs), так и макрофагами (METs). Конфокальная микроскопия, возможно, является наиболее оптимальным способом оценки экспрессии NET и MET, который также может быть использован для оценки активности протеазы. Иммунитет легких к Haemophilus influenzae можно оценить с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.

Введение

Haemophilus influenzae (Hi) является нормальной комменсальной бактерией, присутствующей в глотке большинства здоровых взрослых. Hi может иметь полисахаридную капсулу (типы A-F, например, тип B или HiB) или не иметь капсулы и быть нетипируемым (NTHi)¹. Колонизация слизистой этой бактерией начинается в раннем детстве, и происходит оборот различных колонизирующих штаммов². Эта бактерия также способна к инвазии как в верхние, так и в нижние дыхательные пути; в этом контексте он может вызвать активацию иммунного ответа и воспаление ^3,4. Эта воспалительная реакция может вызвать клиническое заболевание и способствовать различным важным респираторным заболеваниям, включая синусит, средний отит, бронхит, муковисцидоз, пневмонию и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Большинство из этих состояний обусловлены штаммами NTHi². В этой статье будут описаны методы оценки респираторных иммунных реакций на Hi с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.

Методы, описанные ниже, были адаптированы из хорошо зарекомендовавших себя методов, которые были модифицированы для оценки воспалительной реакции на Hi. Выбор подходящей антигенной формы Hi является ключевой частью этой оценки. Антигенные препараты варьируются от компонентов клеточной стенки до живых бактерий. Для установления и стандартизации анализов использование образцов периферической крови может быть очень полезным на начальном этапе.

Проточная цитометрия позволяет измерять различные параметры и функциональные анализы из одного образца на клеточном уровне. Этот метод имеет то преимущество, что специфические клеточные реакции (например, производство активных форм кислорода (АФК) или внутриклеточная продукция цитокинов) могут быть оценены по сравнению с другими более общими методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) или ELISspot.

Внеклеточные ловушки экспрессируются нейтрофилами (NETs)^5,6,7 и другими клетками, такими как макрофаги (METs)⁸. Они все чаще признаются в качестве ключевой воспалительной реакции, особенно при инфекции в легких⁹. Они могут быть оценены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет окончательно идентифицировать НЭТ/МЕТ и отличает их экспрессию от других форм гибели клеток⁶.

Как проточная цитометрия, так и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными анализами. Их успех зависит от оптимальных протоколов процеживания биологических образцов. Эти методы занимают некоторое время для изучения и требуют соответствующего надзорного опыта. Задействованные инструменты также дороги как для покупки, так и для запуска. Оптимальная среда для их использования включает в себя крупные университеты и третичные специализированные больницы.

Методы, используемые в этом протоколе, переносятся для изучения других подобных организмов, участвующих в респираторных заболеваниях (например, Moxarella catarrhalis и Streptococcus pneumoniae). NTHi также взаимодействует с другими распространенными респираторными бактериями¹⁰.

протокол

Эта работа была одобрена комитетом по этике исследований человека Monash Health. Протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований человека.

1. Антигенный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных антигенных препарата могут быть использованы для оценки иммунного ответа на Hi. Это 1) субклеточный компонент (обычно из бактериальной клеточной стенки); 2) убитые и инактивированные бактерии; и 3) живые бактерии. Определить применение каждого антигенного препарата до начала каких-либо экспериментов.

1. Субклеточные компоненты
   1. Получение субклеточных компонентов из источников, включая коммерческие препараты, компоненты собственной разработки и/или от других исследователей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субклеточные компоненты, обычно из бактериальной клеточной стенки, могут быть использованы и включают белки внешней мембраны, такие как P6 и липулигосахарид (LOS)^11,12. Эти субклеточные компоненты обычно выводятся в специализированных центрах. Описание того, как они сделаны, выходит за рамки этой статьи. Для получения этих компонентов рекомендуется прямой контакт со специалистами в этой области.
2. Убитые/инактивированные бактерии
   1. Получите бактерии из соответствующего образца (например, мокроты или бронхоскопии). Подтвердите штамм как H. influenzae с помощью соответствующей микробиологической лаборатории. Выполните типирование образцов H. influenzae , чтобы подтвердить, что они нетипируемы (специализированной микробиологической лабораторией).
   2. Чтобы получить репрезентативный антиген, используйте несколько штаммов NTHi (по крайней мере, 5, каждый примерно одинакового количества), чтобы сделать объединенный антиген. Хранить штаммы при -70 °C в глицериновом бульоне в микроцентрифужных пробирках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте было использовано десять различных штаммов.
   3. Разморозьте штаммы (по одной микроцентрифужной трубке за раз) на тарелках шоколадного агара и выращивайте в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂. Добавьте бактерии в 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и промыть их дважды (открутите при 300 х г в течение 5 мин). Используйте стандарт MacFarland¹⁰ или спектрофотометр¹³ для аликвотирования NTHi до концентрации 10⁸ мл (с использованием контейнера 5 мл или эквивалента).
   4. Тепло инактивирует бактерии, помещая их на водяную баню при температуре 56 °C в течение 10 мин.
   5. Обрабатывайте бактерии ультразвуком, используя непрерывную настройку ультразвуком на низкой и средней скорости в течение 30 с.
   6. Аликвотирование соответствующего объема образцов в микроцентрифужные трубки. Для образца объемом 10⁸ мл используйте аликвоты 50 мкл (т.е. 20 проб на мл), заморозьте их при -70 °C до требуемого¹⁴.
3. Живые бактерии
   1. Во-первых, охарактеризуйте живые бактерии, как указано на этапе 1.2.1. Используйте один хорошо охарактеризованный штамм. Убедитесь, что штамм также хранится в глицериновом бульоне при -70 °C в качестве резерва.
   2. Выращивайте бактерии на обогащенных средах, таких как тарелки шоколадного агара или в бульоне.
      1. Чтобы использовать тарелки шоколадного агара, распространяйте бактерии минимум каждые 3-4 дня стерильными разбрасывателями.
      2. В качестве альтернативы, используйте отвар Brain Heart Infusion (BHI), обогащенный факторами X (гемин) и V (β-никотинамидадениндинуклеотид) для выращивания бактерий. Инокулируют NTHi из ночных пластин в 5-10 мл бульона BHI, дополненного как гемином, так и β-никотинамидадениндинуклеотидом (оба 10 мкг / мл) и культивируют на ночь при 37 ° C в инкубаторе 5% CO₂ .
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество воспроизводимости, более высоких колониеобразующих единиц (КОЕ) и всех бактерий, находящихся в аналогичной фазе роста бревен (на пластинах жизнеспособность бактерий может быть выше в зависимости от положения в культуре)^13,15.
   3. Используйте множественность инфекции (MOI) из 100 бактерий на одну клетку, чтобы вызвать сильный иммунный ответ при сохранении жизнеспособности клеток. Используйте MacFarland Standard¹⁰ или спектрофотометр¹³ для оценки количества бактерий.
   4. Убедитесь, что среда, используемая для живых анализов NTHi, свободна от любой сыворотки человека, так как это убьет бактерии¹⁶. Образцы сыворотки животных (например, сыворотка для телят плода), как правило, не вызывают никаких проблем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте методы, описанные ниже, для анализа стандартных образцов тканей, таких как периферическая кровь, образцы бронхоскопии (в частности, бронхоальвеолярный лаваж (BAL)) и резецированная легочная ткань. Инкубируют образцы с антигеном Hi от 10 мин до 24 ч и более.

2. Оценка фагоцитарной функции методом проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ требует клеток в растворе и обычно проводится в цельной крови или с использованием жидкости BAL. Этот анализ модифицирован по сравнению с ранее опубликованным протоколом, основанным на использовании инактивированного препарата золотистого стафилококка и Пансорбина¹⁷. Инактивированная цельная кровь и фиксированная H. influenzae заменяется Пансорбином¹⁷.

1. Смешайте убитый, инактивированный NTHi (1,2) с йодидом пропидия (PI) при 100 мкг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в соотношении 1:1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Центрифугу при 450 х г в течение 5 мин, а затем промыть в 500 мкл PBS. Открутите при 450 х г в течение 5 мин и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл PBS.
2. Инкубировать 450 мкл периферической крови (из венепунктуры человека) с 50 мкл инактивированного ПИ, меченного H. influenzae , в течение 20 мин на водяной бане при 37 °C в пробирке 5 мл.
3. Извлеките образцы с водяной бани и добавьте 5 мкл дигидрородамина-1,2,3 (DHR). Вихрь в течение 10 с, а затем поместите его обратно на водяную баню еще на 10 минут.
4. Извлеките образцы с водяной бани и лизируйте эритроциты (500 мкл объема, как указано выше на этапе 2.2) раствором 10:1 (т.е. 5 мл) 0,8% хлорида аммония (150 мМ NH₄Cl, 1 мМ NaHCO₃ и 0,1 мМ ЭДТА).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы может использоваться автоматизированная система, такая как Q-prep.
5. Проанализируйте образцы на проточном цитометре в течение часа. Проанализируйте минимум 3000-5000 клеток (из каждого подмножества интересующих) из каждого образца для получения репрезентативных результатов (рисунок 1).
   1. Чтобы проанализировать образцы на фагоцитоз, определите долю клеток, проглотивших меченые бактерии (измерьте долю клеток, имеющих флуоресцентное пятно).
   2. Количественно оценить АФК путем окисления DHR, что приводит к флуоресцентному сигналу (сдвиг медианной флуоресценции сравнивается между исходными и стимулированными образцами).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрофилы более зернистые и имеют больше бокового рассеяния, в то время как макрофаги больше и имеют больше прямого рассеяния.
   3. Различают нейтрофилы и макрофаги морфологически друг от друга по их размеру (макрофаги крупнее) и зернистости (нейтрофилы более зернистые).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специфические маркеры для нейтрофилов и макрофагов обычно не используются, хотя CD14 может использоваться для маркировки моноцитов крови. Проточная цитометрия потенциально может быть использована для различения различных функциональных форм моноцитов и макрофагов (например, подмножеств М1 и М2)¹⁸.
6. Модифицируйте анализ по мере необходимости (например, используйте живые немаркированные NTHi для стимуляции фагоцитов и измерения экспрессии АФК путем расщепления DHR).
   1. Выделяют мононуклеарные клетки периферической крови методом центрифугирования градиента плотности. Нанесите кровь на назначенный полимер для центрифугирования градиента плотности и вращения при 2300 х г в течение 30 мин. Удалите моноядерный слой с помощью пипетки, дважды промыть его PBS и повторно суспендировать ячейки в PBS по 10⁶ клеток в мл.
   2. В качестве альтернативы используйте макрофаги BAL.
   3. Суспендировать моноциты/макрофаги в концентрации 10⁶ клеток/мл в культуральной среде (RPMI). Заразите их живым NTHi при MOI 100:1 в течение 1 ч, как описано в шаге 1.3.
   4. Добавьте DHR к суспензии, как описано на этапе 2.3, в течение 10 мин. Выполните анализ на АФК с помощью проточной цитометрии.

3. Оценка функции лимфоцитов в периферической крови

1. Используют препараты цельной крови или мононуклеарных клеток для проточной цитометрии¹⁴.
2. Получите образцы у каждого субъекта путем венепунктуры. Соберите 4 мл крови из периферической вены в литий-гепариновую трубку и разделите образцы на аликвоты для контроля и стимуляции антигена.
3. Добавьте костимуляторные антитела (анти-CD28 и CD49d, 1 мкл/мл) к обоим образцам. Добавьте NTHi к образцу антигена и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение 1 ч. Для убитого препарата NTHi добавляют 200 мкл антигена к 2 мл крови. Для живых NTHi добавьте живые клетки NTHi при MOI 100: 1 к белым клеткам (измеренным гемоцитометром).
4. Добавьте к образцам блокирующий агент Гольджи Брефельдин А (10 мкл/мл) и инкубируйте их еще 5 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование аппарата Гольджи предотвращает экспорт цитокинов за пределы клетки.
5. Если используется цельная кровь, лизируйте эритроциты 0,8% хлоридом аммония (стадия 2,4), чтобы оставить в растворе только лейкоциты. Фиксируют лейкоциты с помощью 500 мкл 1%-2% параформальдегида в течение 1 ч.
6. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, пронизывайте 10⁶ клеток 100 мкл 0,1% сапонина в течение 15 мин и инкубируйте клетки флуоресцентно мечеными антителами. Промыть клетки и проанализировать их с помощью проточного цитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество флуоресцентно-меченых антител будет специфичным для каждого цитокина. Следуйте инструкциям производителя. Как правило, 10⁶ клеток в 100 мкл раствора окрашиваются в течение 1 ч. Большинства коммерчески полученных антител будет достаточно для выполнения 25-100 тестов.
7. Определите долю клеток, отвечающих на антиген, путем поглощения соответствующей популяции лимфоцитов (клетки ограничены CD45, затем CD3, а затем экспрессией CD4 или CD8), как показано на рисунке 2. Выполните фоновое окрашивание на нестимулированных клетках для всех анализируемых цитокинов. Скрининг 100 000 клеток для анализа каждого цитокина как для стимулированных клеток, так и для контроля.

4. Оценка функции лимфоцитов/медиаторов воспаления в легочной ткани

1. Обычно невозможно получить достаточное количество лимфоцитов с помощью бронхоскопии; поэтому используйте легочную ткань из образцов лобэктомии. Оптимизация образцов легочной ткани требует тесной связи со службой анатомической патологии. Убедитесь, что ткань имеет запас не менее 3 см от опухоли и является клеточной тканью без значительной эмфиземы (как определено патологоанатомом).
2. Разбейте легочную ткань на клеточную суспензию, прежде чем ее можно будет использовать для анализа проточной цитометрии. Переваривайте легочную ткань химически (например, коллагеназой) или дезагрегируйте ее механически.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая дезагрегация тканей может быть предпочтительной, поскольку это связано с лучшим поверхностным окрашиванием клеток (например, маркировка CD3/4)¹⁹.
   1. Получить образцы лобэктомии у патологоанатома (обычно полученные от пациентов, проходящих лечение рака легких). Нарежьте около 20-40 г образца на 3-5 мм³ секции. Поместите их в стерильную камеру объемом 50 мкл перед механической фрагментацией с использованием соответствующего дезагрегатора.
   2. После дезагрегации тканей лизируют эритроциты с 0,8% NH₄Cl, как указано на этапе 2.4.
   3. Повторно суспендировать клетки в стерильном RPMI (объем будет зависеть от количества клеток и, как правило, составляет 10-20 мл), а затем фильтровать их через 100 мкм стерильную нейлоновую сетку. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью метода исключения синего цвета трипана.
3. Анализ инфекции NTHi
   1. Повторное суспендирование клеток легких до конечной концентрации клеток 4 х 10⁶ клеток/мл на пробирку (контрольные и стимулированные образцы).
   2. Используйте суспензию 4 x 10^6-6 x 10⁶ ячеек в 1 мл RPMI для (отрицательной) контрольной трубки. Используйте такое же количество для трубки NTHi (любой дополнительный образец может быть использован в качестве положительного контроля с SEB). Инфицировать клетки в трубке NTHi при MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте колпачок на половину оборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках.
   3. Поместите клетки в трубчатый ротатор и инкубируйте их при 37 °C при вращении со скоростью 12 оборотов в минуту.
   4. Чтобы предотвратить внеклеточный экспорт цитокинов, добавляют блокатор Гольджи (Брефельдин А) к клеточным суспензиям через 1 ч после стимуляции до конечной концентрации 10 мкг/мл. Возврат клеточных суспензий для дальнейшей инкубации 16-22 ч при вращении (этап 4.3.3).
   5. Промыть клеточную суспензию 500 мкл PBS, содержащую 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,01% NaN3. Зафиксируйте и пронизывайте клетки, как описано в шагах 3.5 и 3.6 соответственно.
   6. Добавьте антитела для внутриклеточного окрашивания цитокинов (выбор антител должен быть определен исследователем, как указано в ПРИМЕЧАНИИ на этапе 3.6). Окрашивание клеточной суспензии для специфических маркеров клеточной поверхности лимфоцитов человека (например, CD45, CD3 и т.д.) в течение 1 ч. Промыть клетки с помощью PBS, зафиксировать и пропитать их, как описано в шагах 3.5-3.6.
   7. Инкубируют клетки с внутриклеточными антителами окрашивания цитокинов (например, IFN-γ и TNF-α или IL-13 и IL-17A) в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется окрашивать сначала поверхностные маркеры, затем внутриклеточные, так как фиксация может вызвать конформационные изменения в поверхностных белках, к которым связываются антитела.
   8. Промыть клетки с 500 мкл PBS и повторно суспендировать в 100 мкл PBS перед получением данных на проточном цитометре.
4. Анализ шарикового массива может быть использован в сочетании с анализом супернатанта, описанного на шаге 3.2 (Выполните это без Брефельдина А). Это позволяет анализировать широкий спектр различных медиаторов воспаления (потенциально до 40-50 медиаторов). Соберите супернатант в 100 мкл аликвот и храните при -70 °C до готовности к анализу. В качестве альтернативы можно использовать мультиплексные хемилюминесцентные анализы²⁰.
   1. Используйте мультиплексные шариковые массивы для анализа размороженных образцов. Используйте хранящийся супернатант для анализа производства цитокинов в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Выполните приобретение мультиплексного шарикового массива на проточном цитометре. Используйте соответствующее программное обеспечение для выполнения последующего анализа данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ шарикового массива может быть также выполнен на супернатанте из образцов периферической крови и/или BAL.

5. Оценка протеолиза легких методом конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная конфокальная микроскопия дополняет проточную цитометрию и может использоваться для оценки протеазных и воспалительных реакций АФК. Внеклеточные ловушки, такие как NETs и METs, состоят из внеклеточного хроматина (ДНК) с другими медиаторами воспаления, особенно протеазами, такими как нейтрофильная эластаза (NE) и матриксные металлопротеиназы (MMP). Они могут быть оценены в BAL и легочной ткани с использованием конфокальной микроскопии, и это было описано ранее Sharma, R. et ^al.21.

1. Оценить прямую экспрессию протеазы в легочной ткани (как описано на этапе 4.2.1) с помощью конфокальной микроскопии и зимографии in situ ^15,17.
   1. Используйте свежую или замороженную нефиксированную легочную ткань. Монтируйте секции, вырезанные до толщины 4 мкм, на направляющие сверхмерзлоты/адгезии. Предварительно разогрейте секции в 1x реакционном буфере в течение 5 мин.
   2. Добавьте желатиновую подложку с флуоресцеиновой маркировкой (30 мкг/мл на секцию) непосредственно на отдельные слайды для измерения протеолиза под действием металлопротеиназов.
   3. Поместите горки в горизонтальное положение и инкубируйте в защищенной светом, увлажненной камере при 37 °C в течение 1 часа.
   4. Промывайте секции в 1x реакционном буфере перед установкой.
   5. В качестве отрицательного контроля добавляйте в срезы только реакционный буфер без флуоресцентного желатина.
   6. Используйте конфокальный микроскоп для анализа лизиса субстрата путем исследования. Используйте ImageJ для определения площади легкого с признаками протеолиза. Для этого измерьте область легких, которая имеет окрашивание над фоном закаленного образца. В качестве другого контроля используйте легочную ткань без добавления флуоресцентного желатина¹⁵.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните это как минимум на 10 полях зрения высокой мощности (FOV) для каждого образца.
2. Измеряют внеклеточную экспрессию АФК в легочной ткани по иммунореактивности для 3-нитротирозина (токсического продукта окислительного стресса)¹³.

Результаты

Репрезентативные результаты показывают, как воспалительные иммунные реакции на NTHi могут быть оценены / количественно оценены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Ключевой частью интерпретации результатов является сравнение флуоресценции между контрольными и ?...

Обсуждение

Методы, перечисленные здесь, используют флуоресцентную проточную цитометрию и методы конфокальной микроскопии, которые могут быть использованы в сочетании для получения подробной информации о воспалительной реакции легких на Hi.

Установление соответствующей антигенн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Thermofisher	16-0289-81
CD49d	Thermofisher	534048
DAPI prolong gold	Thermofisher	P36931
DHR123	Sigma Aldrich	109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh	Becton Dickinson	340606
Gelatin substrate, Enzchek	Molecular probes	E12055
MACS mix tube rotater	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		Catalogue number not available
Medicons 50 µm	Becton Dickinson	340592
Pansorbin	Sigma Aldrich	507858
Propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Saponin	Sigma Aldrich	8047152
Superfrost slides	Thermofisher	11562203