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Resumo

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Resumo

Este protocolo descreve o desenho de um modelo de DNA mínimo e os passos para a amplificação enzimática, permitindo a prototipagem rápida de proteínas assayable em menos de 24 h usando a expressão livre de células. Depois de receber DNA de um fornecedor, o fragmento genético é amplificado, cortado, circularizado e crio-bancário. Uma pequena quantidade do DNA bancado é então diluída e amplificada significativamente (até 106x) usando amplificação do círculo de rolamento isotemal (RCA). A RCA pode produzir quantidades de microgramas do modelo de expressão mínima dos níveis de picograma do material inicial (níveis de mg se todos os fragmentos sintéticos iniciais forem usados). Neste trabalho, uma quantidade inicial de 20 pg resultou em 4 μg do produto final. O produto RCA resultante (concatemer do modelo mínimo) pode ser adicionado diretamente a uma reação livre de células sem etapas de purificação. Devido a este método ser inteiramente baseado em PCR, ele pode permitir futuros esforços de triagem de alto rendimento quando juntamente com sistemas automatizados de manuseio de líquidos.

Introdução

A expressão genética livre de células (CFE) emergiu como uma ferramenta poderosa com muitas aplicações. Tais aplicações incluem detecção de doenças1,2,3,4,5,6, micronutrientes e detecção de moléculas pequenas7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, educação19,20,21, fabricação de proteínas difíceis de fabricação17,22,23,24,25,26,27, e triagem variante23,28,29,30,31,32 ,33. Isso se deve à natureza aberta dos sistemas livres de células e à flexibilidade que eles conferem. Muitos artigos de grande revisão oferecem educação histórica e perspectivas futuras sobre a tecnologia34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Uma reação típica sem células consiste em três componentes principais: extrato celular, mistura de energia e modelo genético. O extrato de célula ativa contém todas as máquinas necessárias para transcrição e tradução (TXTL) e pode ser processado de várias maneiras36. Intermediários glicólticos, eletrólitos, aminoácidos e cofatores na mistura de energia suportam o processo TXTL. É uma grande fonte de variabilidade em experimentos sem células45 e pode ser preparado de muitas maneiras34,46. A preparação do modelo genético tem visto menos melhorias desde que os métodos tradicionais de clonagem resultam em plasmídeos com excelentes características de expressão. A desvantagem desses métodos tradicionais é o tempo de reviravolta e a quantidade de conhecimento biológico necessários para construí-los e propagar- los. Os esforços recentes de otimização resultaram em fluxos de trabalho simples de 24 horas para a preparação do extratocelular 47,48 que podem ser realizados em paralelo com a preparação do mix de energia49,50. No entanto, a clonagem tradicional adiciona vários dias à linha do tempo de prototipagem do CFE(Tabela 1)23. Produtos PCR rapidamente amplificados do fragmento genético comercial podem ser usadosdiretamente 51, mas isso limita o número de experimentos de prototipagem à medida que apenas 1 μg de DNA é produzido, o que corresponde a aproximadamente cinco reações (volumes tradicionais de 15 μL). Com essas etapas adicionais de circularização e amplificação isotérmica, quantidades maiores do que miligramas do DNA são possíveis (~5.000 reações por 1 mg). Isso aumenta drasticamente o número de testes que podem ser feitos em triagem de alta produtividade de proteínas ou redes enzimáticas combinatórias (engenharia metabólica livre de células); também permite a preservação efetiva da biblioteca de modelos lineares como DNA de alta concentração. Além disso, uma quantidade aumentada de modelo seria necessária para protótipo de quantidades maiores de proteína necessárias para aplicações científicas materiais (fibras à base de proteínas e hidrogéis). Algumas limitações de modelos lineares podem ser superadas usando um extrato de BL21 DE3 Star ou usando métodos recentemente descobertos para proteger modelos lineares da degradação52,53,54. No entanto, isso não aborda ter estoques limitados de DNA produzido pelo fornecedor para amplificação de PCR ou a questão da perícia biológica e equipamentos necessários para a clonagem.

Este trabalho apresenta um protocolo explicitamente projetado para aumentar a quantidade de modelo de expressão que pode ser obtido a partir de pequenas quantidades de fragmentos genéticos produzidos por fornecedores (tipicamente 500-1000 ng de pó liofilizado). O método descrito não requer as habilidades necessárias para realizar clonagem tradicional em plasmídeos ou transformação e propagação em células vivas. Ao receber um fragmento genético no e-mail, o usuário pode produzir modelos suficientes para muitas reações livres de células, empregando amplificação do círculo de rolamento isoterânmico (RCA) (Figura 1)23. Embora a quantidade de DNA recebida do fornecedor possa ser suficiente para esforços limitados de triagem, ele é rapidamente esgotado, e a recodência de fragmentos genéticos é demorada e cara. O método também é especialmente adequado para genes tóxicos e difíceis de clonar em E. coli.

Protocolo

1. Projetando o fragmento genético

NOTA: O fragmento genético deve ter todos os elementos genéticos necessários para transcrição/tradução, incluindo promotor, site de ligação ribossosome (RBS), codon inicial, gene de interesse e exterminador. Embora o exterminador não seja necessário para um modelo de expressão linear (LET), será importante se o usuário decidir inserir a sequência em um plasmídeo. Estas sequências foram levantadas do pJL1-sfGFP plasmid55 (presente do laboratório de Michael Jewett), que usa um promotor T7. Além desses elementos genéticos necessários, um local de corte de enzima de restrição é adicionado seis pares de base antes do promotor (local de corte de 5') e outros seis pares de base após o exterminador (local de corte de 3'), neste caso usando hindiii (outras enzimas de restrição podem ser usadas, mas é útil padronizar as sequências com uma enzima de restrição de alta fidelidade para reduzir o número necessário para manter na biblioteca). Os sites primer são adicionados dez pares de base a montante do site de corte de 5' e dez pares de base a jusante do local de corte de 3', neste caso usando sequências padronizadas de primer M13 (primers são itens de estoque baratos). O site de enzimas de restrição e os primers utilizados ficam a critério do usuário. No entanto, o usuário deve garantir que as sequências não estejam presentes em nenhum outro lugar do modelo (não quero criar cortes indesejados ou sites de iniciação de amplificação). As sequências dos modelos utilizados neste trabalho são detalhadas no material suplementar. Essas etapas são usadas para modificar a partir deste modelo base.

  1. Determine o gene desejado a ser expresso e obtenha a sequência de aminoácidos ou a sequência genética se tiver sido expresso em E. coli.
  2. Se for uma sequência de aminoácidos, realize a otimização de codon para E. coli usando uma das muitas ferramentas padrão de fornecedor56. Se usar o modelo fornecido no suplemento, certifique-se de que a sequência otimizada não tenha nenhum site de restrição hindiII (AAGCTT). No caso disso, continue a otimizar a sequência até que não haja mais um site hindiii.
  3. Copie a sequência e cole-a no modelo fornecido para a sequência suplementar #1, onde o gene de interesse é indicado. Se expressar sfGFP, use a sequência suplementar #1 como está. Se expressar subtilisina, use a sequência suplementar #2 como está.
  4. Peça o modelo mínimo e os primers necessários do serviço de síntese de DNA preferido.

2. Reutilizar o fragmento genético e os primers

NOTA: Após o recebimento do fragmento genético, siga os protocolos do fabricante para a ressuspensão ou use este guia simples para criar um estoque de DNA.

  1. Centrifugar o tubo (300 x g por 5 s) para coletar a pelota de DNA na parte inferior.
  2. Adicione água destilada dupla (ddH2O) para fazer uma concentração final de 10 ng/μL de modelo de DNA.
  3. Vortex a solução em uma configuração média para 5-10 s.
  4. Dissolva a pelota inteira incubando a 50 °C por 20 min.
  5. Brevemente vórtice novamente
  6. Centrifugar a 300 x g por 5 s para coletar a solução na parte inferior do tubo.
  7. Armazene a -20 °C ou use em PCR.
  8. Prepare um estoque de primer de 100 μM reutilizando os primers em água sem nuclease. Para determinar a quantidade de água a adicionar, multiplique o número de nanomoles de primer liophilizado por 10. Por exemplo, se o tubo contiver 45 nM de primer liofilizado, adicione 450 μL de ddH2O e o vórtice da solução.
  9. Armazene as soluções de estoque de primer a -20 °C ou continue a realizar a amplificação.

3. Amplificando o fragmento genético via PCR

NOTA: Decida qual kit PCR é adequado para o gene de interesse. Genes menores (<1.000 kb) podem ser mais favoráveis a uma polimerase Taq mais barata, enquanto genes maiores (≥1.000 kb) podem se beneficiar de polimerase de alta fidelidade para reduzir erros. É importante notar que essa amplificação inicial do PCR não é necessária se o usuário não estiver preocupado em preservar o fragmento genético inicial (fornece múltiplas tentativas de circularização e permite estudos comparativos do produto LET vs. RCA). Também é importante notar que este LET amplificado pcr pode ser usado diretamente em reações; no entanto, como mencionado na introdução, só permitiria um número limitado de reações se as etapas de amplificação adicionais fossem desconsideradas. A digestão e a ligadura podem ser realizadas no fragmento genético ressuspendeddiretamente 57 (se for certo, eles não precisarão de mais LET para realizar estoques adicionais de circularização). Se este for o caso, pule a seção 3 e continue até a seção 4. Para realizar PCR, siga estas etapas.

  1. Use os estoques de 100 μM da etapa 2.8 para criar soluções de trabalho de 10 μM. Muitos protocolos de kit PCR exigem soluções de 10 μM de primers.
  2. Programe o cicloviário térmico para conduzir a reação de acordo com os protocolos do fabricante do kit. Diferentes kits exigem parâmetros de ciclismo ligeiramente variados. Para o kit listado na Tabela de Materiais,as condições são de 94 °C para 30 s de desnaturação inicial; 30 ciclos de 94 °C para 30 s de desnaturação, 45 °C para 30 s de ressarem e 68 °C para 60 s de extensão; com extensão final a 68 °C por 5 min; e, finalmente, uma espera indefinida de 10 °C.
    1. Certifique-se de selecionar o tempo correto de alongamento (variável dependendo do comprimento do gene a ser amplificado). Tenha um tempo de alongamento de 1 min para cada 1.000 bp.
    2. Certifique-se de inserir a temperatura correta de ressarcial para os primers. Use uma calculadora Tm on-line que usa ambos os primers como entradas para determinar a melhor temperatura de ressarcial58. Uma temperatura de 45 °C é suficiente ao usar primers M13.
    3. Ao determinar o número de ciclos, consulte o protocolo do fabricante, mas 30 ciclos muitas vezes resultarão em amplificação suficiente.
  3. Se estiver executando PCR, descongele e vórtice os dNTPs. Use o buffer PCR fornecido no kit.
  4. Em um único tubo PCR, combine todos os componentes do kit conforme indicado no protocolo do fabricante. Para garantir a amplificação bem sucedida, adicione 1 μL de estoque de DNA resuspendido (etapa 2.6).
  5. Homogeneize suavemente a mistura por vórtice no ajuste médio para 5-10 s. Alternativamente, pipeta metade do volume para cima e para baixo 10-20 vezes para vórtice.
  6. Execute a reação do PCR.
  7. Se o protocolo PCR não incluir uma etapa final de resfriamento, permita que a reação esfrie por 5 min a 10 °C antes de remover para conduzir a condensação para a parte inferior do tubo.
  8. Purifique a reação usando um kit de limpeza pcr seguindo as instruções do fornecedor.
    1. Em um tubo de 1,5 mL, adicione tampão de ligação de DNA e amostra pcr a uma proporção de 5:1, respectivamente.
    2. Transfira esta mistura para a coluna de giro e centrífuga a 16.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
    3. Adicione 200 μL de tampão de lavagem de DNA à coluna e incubar à temperatura ambiente por 1 min.
    4. Centrifugar por 1 min a 16.000 x g e descartar o fluxo.através.
    5. Repetir as etapas 2.8.3 e 2.8.4 sem a etapa de incubação de 1 min.
    6. Centrifugar por um adicional de 1-2 min a 16.000 x g para remover qualquer buffer restante.
    7. Elute o DNA em 46 μL de ddH2O.
  9. Quantifique o DNA purificado usando um espectotômetro.
  10. Armazene o DNA purificado a -20 °C ou prossiga para o próximo passo.

4. Digestão e circularização

NOTA: Uma ampliação adicional pode ser alcançada através da circularização do DNA seguido pela RCA. Digerir o DNA para preparar o modelo para circularização. Isso removerá as sequências de primer e criará extremidades pegajosas nas extremidades de 5' e 3' do modelo. Reanexe estes fins através da reação de ligadura.

  1. Em um tubo PCR, combine 5 μL do buffer necessário, 20 U de HindIII e 45 μL do DNA purificado da etapa 3.8.
  2. Homogeneize suavemente esta mistura com uma pipeta.
  3. Incubar a mistura em um cicloviário térmico por 15 min a 37 °C.
  4. Inativar o calor em hindiii incubando por 20 min a 80 °C.
  5. Deixe a reação esfriar até 10 °C antes de remover para conduzir a condensação para a parte inferior do tubo.
  6. Adicione 5 μL de tampão de ligase T4 e 800 U de liga ligase T4 ao DNA recém-digerido.
    1. Use ligadura T7, se desejar.
  7. Homogeneize suavemente esta mistura com uma pipeta.
  8. Incubar a mistura por 1h a 25 °C para realizar a reação de circularização.
  9. Purifique a reação usando um kit de limpeza pcr seguindo as instruções do fornecedor. Use o mesmo protocolo detalhado na etapa 3.8.
  10. Quantifique o DNA usando um espectrômetro. Os valores esperados são ~20 ng/μL.
  11. Armazene a -20 °C ou prossiga para a próxima etapa.

5. Amplificação do círculo de rolamento isotérmico

NOTA: A amplificação do círculo de rolamento (RCA) pode ser realizada usando um kit comercial ou com componentes adquiridos individualmente. Seguir o protocolo do fabricante garantirá uma amplificação bem sucedida. Os kits geralmente contêm um buffer de amostra, tampão de reação e polimerase de deslocamento de fios, como φ29 polimerase. Múltiplos tubos de reação podem ser combinados para produzir uma grande quantidade de DNA para a expressão livre de células (4 μg a partir de 20 pg de material inicial). O protocolo a seguir funciona de forma eficiente.

  1. Em um único tubo, misture 20 μL do buffer amostral, 20 μL do tampão de reação, 0,8 μL da enzima e 1 μL do modelo de expressão circular (CET) da etapa 4.9.
    NOTA: Este terá uma massa total de DNA de ~20 ng, mas a RCA pode trabalhar com quantidades de picograma, permitindo assim a diluição da CET e amplificação enzimática extrema se houver uma necessidade significativa de material na triagem de alto rendimento.
  2. Homogeneize a mistura com uma pipeta e alíquota de 10 μL da mistura em quatro tubos separados.
  3. Incubar a 30 °C para 4-18 h.
  4. O calor inativa a enzima incubando a 65 °C por 10 minutos. Reduza a temperatura para 12 °C por 5 minutos para incentivar a condensação na parte inferior do tubo.
    NOTA: É mais fácil combinar todas as etapas de temperatura em um protocolo automatizado em um cicloviário térmico.
  5. Diluir a solução resultante adicionando 15 μL de ddH2O a cada tubo.
  6. Combine todos os tubos e adicione diretamente a uma reação livre de células.
  7. Se desejar, use um kit de limpeza PCR para purificar o produto e elute-lo em 36 μL de ddH2O para quantificar. Certifique-se de que a concentração do modelo é ~100 ng/μL.

6. Reação sem células

NOTA: Realize a expressão livre de células combinando buffer de energia, extrato e modelo RCA. Uma reação típica sem células usando o buffer de energia PANOx-SP consiste em 1,2 mM ATP, 0,85 mM cada um de GMP, UMP e CMP, 30 mM phosphoenolpyruvate, 130 mM glutamato de potássio, 10 mM glutamato de amônio, 12 mM glutamato de magnésio, 1,5 mM de espertemidina, 1 mM putrescina, 34 μg/mL de ácido foliônico, 171 μg/mL de mistura de E. coli tRNA, 34 μg/mL de ácido foliônico, 171 μg/mL de mistura de E. coli tRNA, 1 mM 2 mM cada um dos 20 aminoácidos não rotulados, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Coenzyme A (CoA), 4 mM de oxalato de potássio, 57 mM tampão HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% do extrato de E. coli e quantidades variáveis de DNA23,49. O volume de reação pode variar, mas as reações de 15 μL podem economizar no uso de reagentes e são pequenas o suficiente para uso em uma microplacão de parede preta 38449,50.

  1. Se expressar uma proteína fluorescente como o sfGFP, prepare um leitor de placas para ler na excitação/emissão desejada, temperatura e agitação.
  2. Se usar uma placa de 384 poços, aliquot 60 μL de H2O nos poços que beiram uma amostra vazia bem para manter a umidade e reduzir o efeito de borda.
  3. Adicione os vários componentes necessários em um tubo para cada amostra. Adicione o suficiente para realizar triplicados. As réplicas dentro da placa podem ajudar a identificar as causas da variabilidade.
    1. Adicione o extrato, o tampão de energia e, em seguida, o DNA.
    2. Diluir ao volume final desejado com ddH2O.
  4. Misture bem esta solução ao pipetar metade do volume da solução para cima e para baixo 10-20 vezes.
  5. Transfira a mistura de reação em alíquotas de 15 μL para os poços desejados na placa de microtítiter.
  6. Sele a placa com uma máquina de selar incolor para manter a umidade e evitar a evaporação.
  7. Coloque a placa selada no leitor de placas e deixe a reação completa.
    1. Se expressar uma proteína que não tenha a capacidade de ser monitorada ao vivo, use outro aparelho controlado pela temperatura, como um termobloco para incubar a placa.

7. Ensaio de subtilisina

NOTA: Se expressar o gene de subtilisina BPN' (SBT(n)) na Sequência Suplementar n2,siga este protocolo para avaliar a atividade.

  1. Prepare uma solução de estoque de 10 μM de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide em dimetilformamida (DMF).
  2. Defina um leitor de placas para medir a absorvância a 410 nm a cada 20 s por 10 minutos, mantendo uma temperatura de 25 °C.
  3. Em uma placa de fundo plano, incolor de 96 poços, alíquota de 94 μL de ddH2O e 1 μL de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide a partir do passo 7.1.
  4. Adicione 5 μL da reação sem células terminada da etapa 6.7 e leia usando um leitor de placa definido para o protocolo descrito na etapa 7.2.

Resultados

A expressão de sfGFP dos modelos RCA foi comparável à do plasmídeo pJL1 ao usar apenas 0,30 μL de DNA RCA não purificado em uma reação de 15 μL(Figura 2A). Na verdade, duplicar e triplicar a quantidade de modelo parece não oferecer nenhum benefício no extrato BL21 DE3 Star, sugerindo níveis já saturados do modelo a 0,30 μL por reação. Por outro lado, parece haver um benefício para aumentar a quantidade de modelo RCA quando adicionado ao extrato celular originado da cepa SHuf...

Discussão

O gene de interesse pode ser qualquer proteína desejada, mas é melhor começar com uma proteína fluorescente como repórter conveniente para leitura em tempo real ou ponto final em um leitor de placas de poço para novos adotantes deste método. Para novas sequências proteicas, copie a sequência de aminoácidos da proteína desejada e cole-a na ferramenta de otimização de codon desejada61,62. Geralmente existem muitos organismos disponíveis e cepas de

Divulgações

Nigel Reuel atua no conselho científico da BigHat Biosciences Inc., uma empresa que usa sistemas livres de células para o design de anticorpos.

Agradecimentos

Os autores reconhecem que o NIH 1R35GM138265-01 e o NSF 2029532 para apoio parcial deste projeto.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

Referências

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