Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection

Resumo

O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

Resumo

O vírus da tarja de arroz (RSV), que causa perda econômica significativa da agricultura no leste da Ásia, depende inteiramente de vetores de insetos para sua transmissão efetiva entre o arroz hospedeiro. Laodelphax striatellus (pequeno planthopper marrom, SBPH) é o vetor de insetos primário que transmite horizontalmente RSV enquanto suga seiva do phloem. A saliva desempenha um papel significativo no comportamento alimentar dos insetos. Um método conveniente que será útil para pesquisas sobre a saliva de insetos com comportamento de alimentação sugador de piercings é descrito aqui. Neste método, os insetos foram autorizados a se alimentar de uma dieta artificial sanduíche entre duas camadas de filme de parafina esticadas. A dieta contendo a saliva era coletada todos os dias, filtrada e concentrada para análise posterior. Por fim, a qualidade da saliva coletada foi examinada por manchas de proteína e imunoblotting. Este método foi exemplificado pela detecção da presença de RSV e de uma proteína semelhante à mucina na saliva de SBPH. Estes métodos artificiais de alimentação e coleta de saliva estabelecerão uma base para novas pesquisas sobre fatores na saliva de insetos relacionados ao comportamento alimentar e transmissão do vírus.

Introdução

O vírus da tarja de arroz (RSV), um vírus de RNA de ram-tease com fios negativos no gênero Tenuivirus,causa doenças graves na produção de arroz na Ásia Oriental^1,2,3. A transmissão de RSV de plantas de arroz infectadas para as saudáveis depende de vetores de insetos, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite RSV de forma persistente-propagativa. A SBPH adquire o vírus após se alimentar de plantas infectadas pelo RSV. Uma vez dentro do inseto, o RSV infecta a célula epitelial midgut um dia após a alimentação e, em seguida, passa através da barreira....

Protocolo

1. Manutenção da SBPH

1. Crie os viruliferosos e isentas de RSV SBPH em uma incubadora de vidro (65 x 200 mm) com 5-6 mudas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por câmara de vidro no laboratório. Cultivar as plantas de arroz a 25 °C sob uma luz de 16 h / 8 h fotoperíodo escuro.
   NOTA: Os viruliferosos e os indivíduos SBPH livres de RSV foram inicialmente capturados na província de Jiangsu, china.
2. Detecte o RSV no SBPH por um ensaio imunosorbente ligado a enzimas (ponto-ELISA) com um anticorpo policlonal específico rsv de coelho (ver Tabela de Materiais) levantado contra as ribonucleoproteínas RSV (RNPs).
   NOTA: Para gar....

Resultados

Esquemas de instalação de alimentação artificial e coleta de saliva
A Figura 1A retrata o cilindro de vidro (15 cm x 2,5 cm) usado como câmara de alimentação para coletar a saliva. Em primeiro lugar, as larvas SBPH ficaram famintas por várias horas para melhorar a eficiência da coleta e depois imobilizadas por resfriamento por 5 minutos. Depois que os insetos foram transferidos para o cilindro de vidro, ambas as extremidades abertas da câmara foram cobertas com .......

Discussão

A criação bem sucedida de insetos em dietas artificiais foi relatada pela primeira vez em 1962, quando Mittler e Dadd descreveram a técnica de membrana parafina para manter uma dieta artificial^29,30. E esse método tem sido explorado em muitos aspectos da biologia e comportamento de insetos, por exemplo, suplemento de nutrientes, alimentação de dsRNA e aquisição de vírus. Com base nos requisitos da análise da saliva, 5% da sacarose é utilizada como diet.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-KD centrifugal filter	Merck Millipore	R5PA83496	For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet)	macGENE	MP008	Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer	Coolaber	SL1328-500mL×10	Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems	Azure Biosystems	Azure c600	Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder	GenStar	M221-01	Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit	TIANGEN	#PA110	Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies	Sigma	401393-2ML	Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane	Merck Millipore	IPVH00010	Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125	For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES	Bio-Rad	1708891	For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm	Merck Millipore	SLGP033RB	For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels	Bio-Rad	4561043	For SDS-PAGE
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	Detection of protein concentration
Nylon membrane	PALL	T42754	Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane	Sigma	P7793-1EA	Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides	Genstript		Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody	Genstript		Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit	TIANGEN	DP420	For RNA Extraction