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Resumo

O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

Resumo

O vírus da tarja de arroz (RSV), que causa perda econômica significativa da agricultura no leste da Ásia, depende inteiramente de vetores de insetos para sua transmissão efetiva entre o arroz hospedeiro. Laodelphax striatellus (pequeno planthopper marrom, SBPH) é o vetor de insetos primário que transmite horizontalmente RSV enquanto suga seiva do phloem. A saliva desempenha um papel significativo no comportamento alimentar dos insetos. Um método conveniente que será útil para pesquisas sobre a saliva de insetos com comportamento de alimentação sugador de piercings é descrito aqui. Neste método, os insetos foram autorizados a se alimentar de uma dieta artificial sanduíche entre duas camadas de filme de parafina esticadas. A dieta contendo a saliva era coletada todos os dias, filtrada e concentrada para análise posterior. Por fim, a qualidade da saliva coletada foi examinada por manchas de proteína e imunoblotting. Este método foi exemplificado pela detecção da presença de RSV e de uma proteína semelhante à mucina na saliva de SBPH. Estes métodos artificiais de alimentação e coleta de saliva estabelecerão uma base para novas pesquisas sobre fatores na saliva de insetos relacionados ao comportamento alimentar e transmissão do vírus.

Introdução

O vírus da tarja de arroz (RSV), um vírus de RNA de ram-tease com fios negativos no gênero Tenuivirus,causa doenças graves na produção de arroz na Ásia Oriental1,2,3. A transmissão de RSV de plantas de arroz infectadas para as saudáveis depende de vetores de insetos, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite RSV de forma persistente-propagativa. A SBPH adquire o vírus após se alimentar de plantas infectadas pelo RSV. Uma vez dentro do inseto, o RSV infecta a célula epitelial midgut um dia após a alimentação e, em seguida, passa através da barreira midgut para penetrar o hemolífio. Posteriormente, o RSV se espalha em diferentes tecidos através do hemoglifo e, em seguida, se propaga. Após um período latente de cerca de 10-14 dias após a aquisição, o vírus dentro da glândula salivar pode ser transmitido para as plantas hospedeiras saudáveis através da saliva secretada enquanto a SBPH suga a seiva do phloem4,5,6,7,8,9,10 . Um processo de alimentação eficiente e vários fatores na saliva são essenciais para a disseminação do RSV do inseto para a planta hospedeira.

Acredita-se que a saliva de insetos secretada por glândulas salivares media insetos, vírus e plantas hospedeiras. Insetos hemipteranos geralmente produzem dois tipos de saliva: saliva de gelagem e saliva a aguada11,12,13. A saliva de gelagem é principalmente secretada no apoplasmo para sustentar o movimento do estilo entre as células hospedeiras e também está relacionada à superação da resistência vegetal e respostas imunes14,15,16,17. Na fase de sondagem da alimentação, os insetos secretam intermitentemente a saliva de gelagem que imediatamente é oxidada para formar uma flange superficial. Em seguida, baias simples ou ramificadas envolvem o estilo para reservar um canal tubular18,19,20. Presume-se que a flange superficial na epiderme facilite a penetração do estonte com o estopi, servindo como ponto de ancoragem, enquanto as baias ao redor do estilo podem proporcionar estabilidade mecânica e lubrificação16,21,22,23. A NISHP foi identificada como uma proteína essencial para a formação da baia salivar e a alimentação bem sucedida do planthopper marrom (Nilaparvata lugens, BPH). A inibição da expressão da proteína de baia estrutural (PCH) secretada pelo mímpo acyrthosiphon phid reduziu sua reprodução interrompendo a alimentação dos tubos de peneira hospedeira24. Além disso, em algumas espécies de insetos, fatores de saliva de gel devem desencadear respostas imunes às plantas, formando os chamados padrões moleculares associados ao herbívoro (HAMPs). Em N. lugens, NLMLP, uma proteína semelhante à mucina relacionada à formação de baia, induz defesas vegetais contra a alimentação, incluindo morte celular, expressão de genes relacionados à defesa, e callose deposição 25,26. Além disso, alguns fatores de saliva de gel em pulgões têm sido provados para desencadear respostas de defesa vegetal através de interações gene-gene-gene semelhantes aos padrões moleculares associados ao patógeno12,15,27.

Para estudar os fatores salivares essenciais para a alimentação de insetos e/ou transmissão de patógenos, é necessário analisar a saliva secretada. Aqui, métodos de alimentação artificial e coleta para obter quantidades suficientes de saliva são descritos para análise posterior. Utilizando um meio contendo apenas um único elemento nutricional, muitas proteínas salivares foram coletadas e analisadas por manchas de prata e manchas ocidentais. Este método será útil em mais pesquisas sobre fatores na saliva que são essenciais para a transmissão de RSV pela SBPH.

Protocolo

1. Manutenção da SBPH

  1. Crie os viruliferosos e isentas de RSV SBPH em uma incubadora de vidro (65 x 200 mm) com 5-6 mudas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por câmara de vidro no laboratório. Cultivar as plantas de arroz a 25 °C sob uma luz de 16 h / 8 h fotoperíodo escuro.
    NOTA: Os viruliferosos e os indivíduos SBPH livres de RSV foram inicialmente capturados na província de Jiangsu, china.
  2. Detecte o RSV no SBPH por um ensaio imunosorbente ligado a enzimas (ponto-ELISA) com um anticorpo policlonal específico rsv de coelho (ver Tabela de Materiais) levantado contra as ribonucleoproteínas RSV (RNPs).
    NOTA: Para garantir alta eficiência da infecção da prole, as fêmeas viruliferosas foram mantidas separadamente, e 15% de seus descendentes foram testados aleatoriamente para infecção por RSV. Os detalhes do ponto-ELISA são descritos nas etapas 1.3-1.7.
  3. Homogeneize sbph único em 20 μL de tampão de revestimento (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). Local 3 μL de cada uma na membrana de nylon (ver Tabela de Materiais), e depois seque a membrana à temperatura ambiente (RT).
  4. Incubar a membrana com 15 mL de tampão de bloqueio (PBS + 3% de leite desnatado) por 30 min a temperatura ambiente.
  5. Incubar a membrana com anticorpos-coelho primários diluídos contra RSV (1:10000) em 15 mL de PBS por 1 h em RT e lavar a membrana três vezes com PBS para incubação de 5 minutos cada vez.
  6. Incubar a membrana com 1,5 μL de anticorpos anti-coelho conjugados por peroxidase de rabanete (ver Tabela de Materiais) em 15 mL de PBS e lavar três vezes com PBS para incubação de 5 minutos cada vez.
  7. Desenvolver os imunoblots com Kit Cromogênico HRP-DAB Aprimorado (ver Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante.

2. Preparação da câmara de alimentação e dieta artificial

  1. Pese 2 g de pó de sacarose e dissolva-o em 40 mL de ddH2O para preparar 5% de solução aquosa de sacarose como a dieta artificial.
  2. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para remover contaminação bacteriana e impurezas.
  3. Arama 200 3-5ª larvas SBPH por 3-5 h antes de introduzi-las na câmara.
    NOTA: 200 SBPH estão preparados para uma câmara; mais SBPH deve ser preparado para várias câmaras.
  4. Prepare os cilindros de vidro como câmaras de alimentação(Figura 1A). Cubra uma extremidade aberta da câmara com uma membrana de parafina (ver Tabela de Materiais) antes de introduzir os insetos experimentais.
    NOTA: Cada cilindro tem 15,0 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro. Estes cilindros de vidro são feitos sob medida de acordo com a exigência experimental.
  5. Transfira insetos para um cilindro de vidro.
  6. Cubra a outra extremidade da câmara com membrana de parafina esticada (especificamente, Parafilm M). Em seguida, adicione 200 μL de dieta artificial a ele. Por fim, cubra o líquido com outra camada de membrana de parafina esticada.
    NOTA: A membrana de parafina é esticada para cerca de o dobro de sua área original.
  7. Cubra a câmara com papel alumínio, mas deixe a extremidade com o dispositivo de dieta artificial exposto à luz.

3. Coleção de saliva SBPH

  1. Colete dieta artificial da SBPH livre de RSV e viruliferosa separadamente no final do período de 24h.
  2. Esfrie o cilindro a 4 °C para imobilizar os insetos.
  3. Descubra o filme externo e colete o líquido da dieta artificial usando uma pipeta estéril em tubos estéreis de 1,5 mL. Mantenha a saliva coletada a -80 °C até a análise.
    NOTA: A saliva coletada pode ser armazenada a -80 °C durante 1 ano.
  4. Enxágüe a membrana interna com 50 μL de dieta artificial fresca três vezes por pipetar suavemente, e colete a dieta de lavagem artificial como descrito na etapa 3.3. Coloque a nova dieta artificial na membrana interna e mantenha uma membrana parafina recém-esticada por cima.
  5. Repita as etapas 3.2 e 3.3 por 5 dias a 2 semanas.
    NOTA: Conte a taxa de sobrevivência da alimentação artificial SBPH e garanta o suplemento suficiente de SBPH fresco de acordo com a taxa de sobrevivência.
  6. Filtre as amostras coletadas através de uma unidade de filtro de 0,22 μm para remover micróbios e outros contaminantes.

4. Concentração da saliva coletada

  1. Transfira as amostras de saliva coletadas em um filtro centrífugo de 0,5 mL 10 kD (ver Tabela de Materiais) e gire a 5.500 x g a 4 °C por 20 min. Colete o supernante e faça o volume final a 100 μL.
  2. Meça a concentração da saliva coletada utilizando um espectrofotômetro UV-Vis apropriado seguindo as etapas 4.3-4.6.
  3. Ligue o espectrômetro e lave os pedestais três vezes com ddH2O.
  4. Selecione as seguintes opções na tela em ordem adequada: Proteínas | Proteína A280 | Selecione | tipo 1 Abdômen = 1 mg/mL. Em seguida, verifique a caixa de seleção Correção de linha de base 340 nm.
  5. Carregar 2 μL de solução aquosa de 5% de sacarose como em branco, toque em branco na parte inferior da tela.
  6. Após a definição dos padrões, carregue 2 μL da saliva coletada para medição. Leia e regisse a concentração de proteínas.
    NOTA: 1 mg de proteínas salivares foram finalmente coletadas no total, pelo menos.

5. Coloração de prata de proteínas salivares

  1. Extrair proteína das amostras de saliva de inseto usando tampão de carga de amostra (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS, 0,1% azul bromofenol e 1% β-mercaptoethanol). Em seguida, fracione-o em 10% de SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais). Carregue a solução sucrosesa de 5% tratada da mesma forma que um controle negativo.
  2. Carregue uma alíquota de 20 μL da amostra em um gel SDS-PAGE ao lado de um marcador presumado. Corra o gel por 15 min a 90 Volt, e depois 50 min a 140 Volt.
  3. Fixar o gel em 30% (vol/vol) de etanol, 10% (vol/vol) ácido acético por pelo menos 30 minutos após a eletroforese.
  4. Enxágüe o gel duas vezes com 20% (vol/vol) de etanol e água separadamente por 10 minutos cada vez.
  5. Sensibilize o gel em 0,8 mM de tiossulfito de sódio por 1 min e enxágue duas vezes em água por 1 min cada vez.
  6. Mergulhe o gel em nitrato de prata de 12 mM por pelo menos 1 h, e depois mergulhe-o em água desionizada por 10 s antes de transferi-lo para a solução do desenvolvedor.
  7. Quando o fundo do gel estiver ficando escuro, mergulhe o gel em uma solução stop (5% de ácido acético) por pelo menos 30 minutos para parar a reação.
  8. Lave o gel duas vezes com água por 30 minutos cada vez. Desenvolver a imagem com o Sistema de Detecção (ver Tabela de Materiais).

6. Detecção de proteínas por manchas ocidentais

  1. Detecte a proteína saliva semelhante à mucina de SBPH (LssgMP) e RSV por manchas ocidentais usando anticorpos específicos, respectivamente.
  2. Trate amostras de saliva de insetos após o passo 5.1.
  3. Carregue uma alíquota de 20 μL da amostra em um gel SDS-PAGE de 10% ao lado de um marcador prestained e uma amostra de saliva não infectada de 20 μL RSV como um controle negativo. Corra o gel por 15 min a 90 Volt, e depois por 50 min a 140 Volt.
  4. Misture 100 mL de tampão de transferência de proteína de 10x (molhado) (ver Tabela de Materiais) com 900 mL de ddH2O para uma solução de trabalho (1x), e depois transfira proteínas para uma membrana de difluoreto polivinídeno usando tampão de transferência de proteína (1x).
  5. Bloqueie a membrana em 5% de leite desnatado com soro fisiológico tamponado por 0,01 M Tris com 0,05% Tween 20 (TBST) à temperatura ambiente (RT) por 1 h.
    NOTA: Neste protocolo, misture 100 mL de 10x TBST (ver Tabela de Materiais) com 900 mL de ddH2O na solução de trabalho.
  6. Incubar a membrana com anticorpos de coelho primário contra RSV ou LssgMP (ambos 1:10000) diluídos em TBST no RT por pelo menos 2 h.
    NOTA: A produção de anticorpos primários contra o RSV foi mencionada acima. Uma empresa de biotecnologia produziu o anticorpo policlonal anti-LssgMP contra o peptídeo LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lave a membrana três vezes com TBST por 10 minutos de incubação cada vez.
  8. Incubar a membrana com anticorpos anti-coelho conjugados por peroxidase conjugados de rabanete diluídos em 1:10000 TBST.
  9. Desenvolva os imunoblots com o sistema de detecção de manchas ocidentais de chemiluminescência aprimorada.

7. Detecção do padrão de expressão LssgMP no SBPH

  1. Imobilize os insetos a 4 °C por 5 min.
  2. Lave os insetos com 75% de etanol e ddH2O um por um, e depois disseca os insetos em TBS pré-refrigerado (salina tampão de tris de 0,01 M).
  3. Dissecar os insetos do abdômen enquanto corta as pernas dianteiras da SBPH na articulação coxa-trochanter por fórceps; lave o midgut e as glândulas salivares duas vezes em TBS para remover qualquer contaminação do hemisfão.
  4. Coloque cinco tecidos em um tubo de 1,5 mL RNase livre para extrair RNA. Considere cada tubo como uma amostra.
  5. Realize a extração de RNA de acordo com os protocolos do fabricante e PCR transcricional reverso (RT-PCR) (ver Tabela de Materiais).
  6. Realize pcr quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para investigar os níveis relativos de expressão da transcrição de LssgMP em extratos de todo o corpo ou vários tecidos de L. striatellus.
    NOTA: Os pares de primer utilizados para amplificação genética foram LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. O nível de transcrição do fator de alongamento da tradução L. striatellus 2 (ef2) foi quantificado com par de primer ef2-q-F/ef2-q-R para a normalização dos modelos cDNA. E as sequências de primer estão anexadas abaixo:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Resultados

Esquemas de instalação de alimentação artificial e coleta de saliva
A Figura 1A retrata o cilindro de vidro (15 cm x 2,5 cm) usado como câmara de alimentação para coletar a saliva. Em primeiro lugar, as larvas SBPH ficaram famintas por várias horas para melhorar a eficiência da coleta e depois imobilizadas por resfriamento por 5 minutos. Depois que os insetos foram transferidos para o cilindro de vidro, ambas as extremidades abertas da câmara foram cobertas com ...

Discussão

A criação bem sucedida de insetos em dietas artificiais foi relatada pela primeira vez em 1962, quando Mittler e Dadd descreveram a técnica de membrana parafina para manter uma dieta artificial29,30. E esse método tem sido explorado em muitos aspectos da biologia e comportamento de insetos, por exemplo, suplemento de nutrientes, alimentação de dsRNA e aquisição de vírus. Com base nos requisitos da análise da saliva, 5% da sacarose é utilizada como diet...

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2019YFC1200503), pela Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072385) e pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10-KD centrifugal filterMerck MilliporeR5PA83496For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet)macGENEMP008Transfer buffer for western blotting
10x TBST bufferCoolaberSL1328-500mL×10Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladderGenStarM221-01Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic KitTIANGEN#PA110Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodiesSigma401393-2MLPolyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membraneMerck MilliporeIPVH00010Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µmMerck MilliporeSLGP033RBFor filtration
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043For SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WDetection of protein concentration
Nylon membranePALLT42754Membrane for dot-ELISA
Parafilm M MembraneSigmaP7793-1EAMaking artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptidesGenstriptRabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibodyGenstriptRabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro KitTIANGENDP420For RNA Extraction

Referências

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