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요약

본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.

초록

동아시아에서 농업의 상당한 경제적 손실을 일으키는 쌀 줄무늬 바이러스 (RSV),는 전적으로 숙주 쌀 사이에서 효과적인 전송을위한 곤충 벡터에 의존한다. Laodelphax striatellus (작은 갈색 식물호퍼, SBPH)는 phloem에서 수액을 빨아들이면서 RSV를 수평으로 전송하는 1 차 곤충 벡터입니다. 타액은 곤충의 먹이 행동에 중요한 역할을합니다. 피어싱-빠는 먹이 기법으로 곤충의 타액에 대한 연구에 유용한 편리한 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법에서 곤충은 두 개의 뻗은 파라핀 필름 층 사이에 끼어있는 인공 식단을 먹을 수있었습니다. 타액을 함유한 식단은 매일 수집, 여과, 농축등을 통해 추가 분석을 위해 집중되었다. 마지막으로, 수집된 타액의 질은 단백질 염색 및 면역 블로팅에 의해 검사되었다. 이 방법은 SBPH의 타액에서 RSV 와 무신 과 같은 단백질의 존재를 검출함으로써 예시되었다. 이러한 인공 공급 및 타액 수집 방법은 먹이 행동과 바이러스 전송과 관련된 곤충 타액의 요인에 대한 추가 연구를위한 기초를 마련할 것입니다.

서문

테누이바이러스속의 네거티브 좌초 RNA 바이러스인 쌀줄무늬 바이러스(RSV)는 동아시아1,2,3에서쌀 생산에 심각한 질병을 일으킨다. 감염된 쌀 식물에서 건강한 식물로 RSV를 전송하는 것은 곤충 벡터에 따라 달라집니다, 주로 라오델파엑스 스트트리아텔루스, 이는 지속적인 전파 방식으로 RSV를 전송. SBPH는 RSV 감염 식물에 먹이 후 바이러스를 취득. 곤충 내부에 들어가면 RSV는 먹이기 하루 후 미드구트 상피 세포를 감염시키고 중간 구트 장벽을 통과하여 혈류를 관통합니다. 그 후, RSV는 혈몰리프를 통해 다른 조직으로 퍼지고 전파합니다. 약 10-14일 후의 잠정 기간 후, 침샘 내부의 바이러스는 분비타액을 통해 건강한 숙주 식물로 전염될 수 있으며, SBPH는 플록4,5,6,7,8,9,10에서 수액을 빨아들이는 동안 . 효율적인 공급 과정과 타액의 다양한 요인은 곤충에서 숙주 식물로 RSV의 확산에 필수적입니다.

타액선으로 분비되는 곤충 타액은 곤충, 바이러스 및 숙주 식물을 중재하는 것으로 추정됩니다. Hemipteran 곤충은 일반적으로 타액의 두 가지 유형을 생산 : 타액겔링 과 물 타액11,12,13. 겔링 타액은 주로 숙주 세포 들 사이에서 스타일운동의 움직임을 유지하기 위해 아포플라즘으로 분비되며 식물 성 저항및 면역반응(14,15,16,17)을극복하는 데도 관련이 있다. 먹이기의 탐사 단계에서 곤충은 간헐적으로 겔화 타액을 분비하여 즉시 산화되어 표면 플랜지를 형성합니다. 그런 다음 단일 또는 분기 된 칼집은스타일채널(18,19,20)을예약하도록 스타일이 감싸고 있다. 표피의 표면 플랜지는 앵커 포인트역할을 하여 스타일화의 침투를 용이하게 하는 것으로 추정되며, 스타일주위의 칼집은 기계적 안정성과윤활(16,21,22,23)을제공할 수 있다. Nlshp는 타액 칼집 형성과 갈색 식물호퍼(닐라파르바타 루겐스,BPH)의 성공적인 공급에 대한 필수 단백질로 확인되었다. 진딧물 아시르토시폰 피섬에 의해 분비되는 구조적 칼집 단백질(SHP)의 발현억제는 숙주체튜브(24)로부터의수유를 방해함으로써 번식을 감소시켰다. 더욱이, 몇몇 곤충 종에서는, 젤 타액 요인은 소위 초식동물 관련 분자 패턴 (HAMPs)를 형성해서 식물 면역 반응을 촉발하기 위하여 가정됩니다. N. lugens에서,NlMLP, 칼집 형성과 관련된 mucin 같은 단백질은 세포 사멸, 방위 관련 유전자의 발현 및 칼로스 증착(25,26)을포함하여 공급에 대한 식물 방어를 유도한다. 또한, 진딧물에서 일부 젤 타액 인자는 병원체-관련 분자 패턴12,15,27과유사한 유전자 대 유전자 상호 작용을 통해 식물 방어 반응을 유발하는 것으로 입증되었다.

곤충 수유 및/또는 병원균 전달에 필수적인 타액 인자를 연구하기 위해서는 분비타를 분석할 필요가 있습니다. 여기서, 충분한 양의 타액을 얻기 위한 인공 공급 및 수집 방법은 추가 분석을 위해 설명된다. 단 하나의 영양 원소만 을 함유한 배지를 사용하여, 많은 타액 단백질은 은 염색및 서양 얼룩에 의해 수집되고 분석되었다. 이 방법은 SBPH에 의한 RSV 전송에 필수적인 타액의 요인에 대한 추가 연구에 도움이 될 것입니다.

프로토콜

1. SBPH 유지 보수

  1. 실험실의 유리 챔버 당 5-6 쌀(Oryza sativa cv. Nipponbare) 모종유리 인큐베이터 (65 x 200mm)에 viruliferous 및 RSV가없는 SBPH 개인을 후면하십시오. 16h 광/8h 다크 포토기간 하에서 쌀 식물을 25°C로 성장시다.
    참고: 비수명과 RSV가 없는 SBPH 개인은 처음에는 중국 장쑤성에서 잡혔습니다.
  2. RSV 리보뉴클레오단백질(RNP)에 대해 제기된 토끼 RSV 특이적 폴리클론 항체(재료표참조)를 가진 점 효소-연결된 면역소벤트 분석(dot-ELISA)에 의해 SBPH에서 RSV를 검출한다.
    참고: 높은 자손 감염 효율을 보장하기 위해, viruliferous 여성은 별도로 유지되었고, 그들의 자손의 15%는 RSV 감염을 위해 무작위로 시험되었습니다. dot-ELISA의 세부 사항은 1.3-1.7 단계에 설명되어 있습니다.
  3. 코팅 버퍼 의 20 μL에서 단일 SBPH를 균질화 (0.05 M Na2CO3-NaHCO3,pH 9.5). 나일론 멤브레인에 각각 3 μL을 점(재료 표참조), 실온(RT)에서 멤브레인을 건조시킵니다.
  4. 15mL의 블로킹 버퍼(PBS + 3% 탈지 우유)로 멤브레인을 실내 온도에서 30분 동안 배양합니다.
  5. RSV에 대한 희석 된 1 차 토끼 항체로 멤브레인을 배양 (1:10000) PBS의 15 mL에서 1 시간 동안 RT에서 1 시간 동안 하 고 매번 5 분 배양에 대 한 PBS와 멤브레인을 세 번 세척.
  6. 1.5 μL의 고추냉이 과산화소시다제-공주 염소 항토끼 항체(재료표참조)로 멤브레인을 15mL의 PBS로 3회 세척하고 PBS로 매번 5분 간 잠복한다.
  7. 제조업체가 제공하는 프로토콜에 따라 향상된 HRP-DAB 염색체 키트(재료 표참조)를 사용하여 면역blot를 개발합니다.

2. 먹이 챔버와 인공 식단 준비

  1. 자당 분말 2 g의 무게와 인공 식단으로 5 % 자당 수액을 준비하기 위해 ddH2O의 40 mL에 용해.
  2. 세균 오염 및 불순물을 제거하기 위해 0.22 μm 필터(재료 표참조)를 통해 용액을 필터링합니다.
  3. 3-5 회SBPH 애벌레 200 3 rd -5th SBPH 애벌레를 3-5 h로 마신 후 챔버에 도입하십시오.
    참고: 200 SBPH는 하나의 챔버에 대 한 준비; 더 많은 SBPH는 여러 챔버에 대한 준비되어야한다.
  4. 유리 실린더를 먹이챔버(도1A)로준비합니다. 실험 곤충을 소개하기 전에 파라핀 멤브레인 (재료의 표참조)로 챔버의 한 번 의 열린 끝을 덮습니다.
    참고: 각 실린더의 길이는 15.0cm, 직경 2.5cm입니다. 이 유리 실린더는 실험 요구 사항에 따라 사용자 정의됩니다.
  5. 곤충을 유리 실린더로 옮킨다.
  6. 뻗어 파라핀 멤브레인 (특히, 파라 필름 M)챔버의 다른 끝을 덮어. 그런 다음 인공 식단 의 200 μL을 추가하십시오. 마지막으로, 뻗어 파라핀 멤브레인의 또 다른 층으로 액체를 덮습니다.
    참고: 파라핀 멤브레인은 원래 면적의 약 2배로 늘어납니다.
  7. 알루미늄 호일로 챔버를 덮지만 빛에 노출된 인공 식이 장치로 끝을 남깁니다.

3. SBPH 타액 컬렉션

  1. 24 시간 기간의 끝에 별도로 RSV 무료 및 viruliferous SBPH에서 인공 식단을 수집합니다.
  2. 4°C에서 실린더를 식히면 곤충을 고정시하십시오.
  3. 외부 필름을 발견하고 멸균 파이펫을 사용하여 1.5mL 멸균 튜브로 인공 식단 액체를 수집합니다. 수집된 타액을 분석할 때까지 -80°C로 유지합니다.
    참고: 수집된 타액은 1년 동안 -80°C로 보관할 수 있었다.
  4. 내부 멤브레인을 50 μL의 신선한 인공 식단으로 3회 부드럽게 배관하여 헹도, 3.3단계에서 설명한 바와 같이 인공 세척 식단을 수집한다. 새로운 인공 식단을 내부 막에 놓고 갓 뻗은 파라핀 멤브레인을 위에 두십시오.
  5. 5일에서 2주 동안 3.2 및 3.3 단계를 반복합니다.
    참고: 인공 공급 SBPH의 생존율을 계산하고 생존율에 따라 신선한 SBPH의 충분한 보충제를 보장합니다.
  6. 수집된 샘플을 0.22 μm 필터 유닛을 통해 필터링하여 미생물 및 기타 오염 물질을 제거합니다.

4. 수집된 타액의 농도

  1. 수집된 타액 샘플을 0.5mL 10 kD 원심 필터(재료 표참조)로 옮기고 20분 동안 4°C에서 5,500 x g에서 회전합니다. 상체를 수집하고 최종 부피를 100 μL로 만듭니다.
  2. 4.3-4.6단계 다음 적절한 UV-Vis 분광광계를 사용하여 수집된 타액의 농도를 측정한다.
  3. 분광계를 켜고 ddH2O로 받침대를 세 번 씻으십시오.
  4. 적절한 순서로 화면에 다음 옵션을 선택 : 단백질 | 단백질 A280 | | 유형 선택 1 복근 = 1 mg / mL. 그런 다음 확인란 기준 수정 340 nm를 확인합니다.
  5. 5%의 자당용용을 5%의 2 μL로드하고 화면 하단에 블랭크를 터치합니다.
  6. 표준을 설정한 후 수집된 타액의 2 μL을 적재하여 측정합니다. 읽고 단백질 농도를 기록합니다.
    참고: 타액 단백질 1 mg은 적어도 총으로 마침내 수집되었습니다.

5. 타액 단백질의 은색 염색

  1. 샘플 로딩 버퍼를 이용한 곤충 타액 샘플로부터 단백질을 추출한다(50m Tris-HCl pH 6.8, 글리세롤 10%, SDS 2%, 0.1% 브로모페놀 블루, 1% β-메르카포에탄올). 그런 다음 10% SDS-PAGE로 분수합니다(재료 표참조). 음의 제어와 동일한 방식으로 처리된 5% 자당용액을 로드합니다.
  2. 시료의 20 μL 알리쿼트를 SDS-PAGE 젤에 미리 스테인드 마커와 함께 적재합니다. 90 볼트에서 15분, 140볼트에서 50분 동안 젤을 실행합니다.
  3. 젤을 30% (vol/vol) 에탄올, 10% (vol/vol) 아세트산으로 고정하여 전기포고증 후 최소 30분 동안 고정합니다.
  4. 젤을 20%(vol/vol) 에탄올로 두 번 헹구고 매번 10분 동안 별도로 물을 헹구는다.
  5. 젤을 0.8 mM 나트륨 티오툴파테에서 1분 동안 민감화한 다음 매번 1분 동안 두 번 물에 헹구는 다.
  6. 젤을 12m 실버 질산염에 1시간 이상 담근 다음, 10s의 탈이온화된 물에 담근 다음 개발자 솔루션으로 옮기세요.
  7. 젤의 배경이 어두워지면, 겔을 스톱 용액(5% 아세트산)에 적어도 30분 동안 담그어 반응을 멈춥니다.
  8. 매번 30분 동안 물로 젤을 두 번 씻으시다. 감지 시스템으로 이미지를 개발합니다(재료 표참조).

6. 서부 블로팅에 의한 단백질 검출

  1. 특정 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의해 SBPH (LssgMP) 및 RSV의 타액 머신 과 같은 단백질을 각각 검출한다.
  2. 5.1 단계 다음 곤충 타액 샘플을 치료하십시오.
  3. 시료의 20 μL 알리쿼트에 10% SDS-PAGE 젤에 미리 스테인드 마커와 20 μL RSV 비감염 타액 샘플을 음의 대조군으로 적재한다. 젤을 90볼트에서 15분 동안 실행한 다음 140볼트에서 50분 동안 젤을 실행합니다.
  4. 10x 단백질 전달 버퍼(wet)의 100mL(재료표 참조)를 900mL의 ddH2O와 작업 용액(1x)에 혼합한 다음 단백질 전달 버퍼(1x)를 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 단백질을 전달한다.
  5. 실온(RT)에서 0.05% Tween 20(TBST)로 0.01 M Tris 완충식염수로 5% 탈지 우유로 멤브레인을 차단합니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 10x TBST의 100mL(재료 표참조)를 900mL의 ddH2O를 작업 솔루션에 혼합합니다.
  6. RSV 또는 LssgMP (둘 다 1:10000)에 대한 기본 토끼 항체로 멤브레인을 2 시간 이상 RT에서 TBST에서 희석시킵니다.
    참고: RSV에 대한 1차 항체의 생산은 위에서 언급되었다. 생명 공학 회사는 LssgMP 펩타이드 GIQFDSYSASDLTRC에 대한 토끼 안티 LssgMP 폴리 클론 항체를 생산했다.
  7. 매번 10분 동안 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으시면 됩니다.
  8. 1:10000 TBST에서 희석된 고추냉이 과록시다제-공주 염소 안티-토끼 항체로 멤브레인을 배양한다.
  9. 향상된 화학 발광 서부 블로팅 검출 시스템으로 면역 블롯을 개발합니다.

7. SBPH에서 LssgMP 발현 패턴 감지

  1. 곤충을 4°C에서 5분 동안 고정합니다.
  2. 곤충을 75% 에탄올과 ddH2O로 하나씩 씻은 다음 미리 차가운 TBS(0.01 M Tris 완충식식선)로 곤충을 해부합니다.
  3. 집게에 의해 콕사 트로챈터 관절에서 SBPH의 앞다리를 분리하는 동안 복부에서 곤충을 해부; 혈청림프에서 오염을 제거하기 위해 TBS에서 중간 구트와 타액 땀샘을 두 번 씻으십시오.
  4. RNA를 추출하기 위해 1.5 mL RNase가없는 튜브에 5 개의 조직을 넣습니다. 각 튜브를 하나의 샘플로 고려하십시오.
  5. 제조업체의 프로토콜 및 역전사 PCR(RT-PCR)에 따라 RNA 추출을 수행합니다(재료 표참조).
  6. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 수행하여 전신 또는 L. striatellus의다양한 조직에서 LssgMP의 상대적 성적증명서 발현 수준을 조사한다.
    참고: 유전자 증폭에 사용되는 프라이머 쌍은 LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, SYBR 그린 기반 qPCR이 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. L. striatellus 번역 연도 계수 2(ef2)의 성적증명서 수준은 cDNA 템플릿의 정규화를 위해 프라이머 쌍 ef2-q-F/ef2-q-R으로정량화되었다. 그리고 프라이머 시퀀스는 아래에 첨부되어 있습니다:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGGGGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

결과

인공 공급 설치 및 타액 수집의 회로도
도 1A는 타액을 수집하는 먹이 챔버로 사용되는 유리 실린더(15cm x 2.5cm)를 묘사한다. 첫째, SBPH 애벌레는 수집 효율을 향상시키기 위해 몇 시간 동안 굶주린 다음 5 분 동안 냉각하여 고정되었습니다. 곤충이 유리 실린더로 옮겨진 후, 챔버의 두 개의 열린 끝은 뻗은 파라핀 멤브레인으로 덮여 있었다. 한쪽 끝에서, 5% 자당?...

토론

인공 식단에 곤충의 성공적인 양육은 1962년에 미틀러와 Dadd가 인공 식단29,30을보유하기 위해 파라핀 막 기술을 설명했을 때 처음 보고되었습니다. 그리고이 방법은 곤충 생물학 및 행동의 많은 측면에서 탐구 되었습니다., 예를 들어, 영양소 보충, dsRNA 공급, 그리고 바이러스 수집. 타액 분석의 요구 사항에 따라, 5% 자당은 이 연구에서 SBPH의 타액을 수집...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 중국 국립과학재단(2019YFC1200503호)과 청소년혁신진흥협회 32072385(2021084)가 지원했다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10-KD centrifugal filterMerck MilliporeR5PA83496For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet)macGENEMP008Transfer buffer for western blotting
10x TBST bufferCoolaberSL1328-500mL×10Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladderGenStarM221-01Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic KitTIANGEN#PA110Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodiesSigma401393-2MLPolyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membraneMerck MilliporeIPVH00010Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µmMerck MilliporeSLGP033RBFor filtration
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043For SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WDetection of protein concentration
Nylon membranePALLT42754Membrane for dot-ELISA
Parafilm M MembraneSigmaP7793-1EAMaking artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptidesGenstriptRabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibodyGenstriptRabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro KitTIANGENDP420For RNA Extraction

참고문헌

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