Abordagem Genética Reversa para Identificar Reguladores de Pigmentação usando Zebrafish

Resumo

Reguladores das funções dos melanócitos governam diferenças visíveis no resultado da pigmentação. Decifrar a função molecular do gene de pigmentação candidato representa um desafio. Neste trabalho, demonstramos o uso de um sistema modelo de peixe-zebra para identificar candidatos e classificá-los em reguladores do conteúdo de melanina e número de melanócitos.

Resumo

Os melanócitos são células especializadas derivadas da crista neural presentes na pele epidérmica. Essas células sintetizam pigmento de melanina que protege o genoma das radiações ultravioletas nocivas. Perturbações no funcionamento dos melanócitos levam a distúrbios pigmentares como piebaldismo, albinismo, vitiligo, melasma e melanoma. O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para entender as funções dos melanócitos. A presença de melanócitos pigmentados conspícuos, a facilidade de manipulação genética e a disponibilidade de linhagens fluorescentes transgênicas facilitam o estudo da pigmentação. Este estudo emprega o uso de linhagens de zebrafish selvagens e transgênicas que conduzem a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) sob promotores mitfa e tyrp1 que marcam vários estágios de melanócitos.

O silenciamento morfolinoso de genes candidatos é obtido para avaliar o resultado fenotípico na pigmentação larval e é aplicável à triagem de reguladores de pigmentação. Este protocolo demonstra o método desde a microinjeção até a dissecção de fenótipos baseada em imageamento e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando dois genes candidatos, anidrase carbônica 14 (Ca14) e uma variante de histona (H2afv), para avaliar de forma abrangente o resultado da pigmentação. Além disso, este protocolo demonstra a segregação de genes candidatos em especificadores e diferenciadores de melanócitos que alteram seletivamente o número de melanócitos e o conteúdo de melanina por célula, respectivamente.

Introdução

Embora o uso da melanina para fotoproteção tenha evoluído várias vezes em todo o reino animal, os vertebrados aparentemente aperfeiçoaram o processo. Células dedicadas produtoras de pigmentos com uma elaborada maquinaria para sintetizar e conter melanina são conservadas de peixes para humanos¹. No entanto, o resultado da pigmentação é dramaticamente variado, variando da cor à recipiência e apresenta-se como padrões vívidos nos tegumentos, na pele e no cabelo². Apesar da diversidade, o repertório de genes envolvidos na resposta à pigmentação é marcadamente conservado. Os componentes centrais da maquinaria de síntese de melanina, tais como as enzimas-chave de síntese de melanina, os componentes dos melanossomas e a conectividade a montante com a via de sinalização, permanecem essencialmente idênticos entre os organismos. Diferenças genéticas sutis provocam mudanças dramáticas nos padrões de pigmentação observados entre as espécies³. Assim, uma abordagem genética reversa em um organismo vertebrado inferior, o peixe-zebra (Danio rerio), oferece uma excelente oportunidade para decifrar o envolvimento de genes na transformação do estado^pigmentado4.

Os embriões de peixe-zebra desenvolvem-se a partir de um zigoto fertilizado unicelular para uma larva dentro de um período de ~24 h após a fertilização (hpf)⁵. Surpreendentemente, as células equivalentes aos melanócitos - os melanóforos - são células grandes que estão presentes na derme e são conspícuas devido ao conteúdo escuro de melanina⁶. Essas células derivadas da crista neural emanam ~11 hpf e começam a pigmentar ~24 hpf ^6,7. Módulos conservados de expressão gênica permitiram a identificação de fatores-chave que orquestram as funções dos melanócitos e levaram ao desenvolvimento de linhagens fluorescentes transgênicas Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) e Tg(ftyrp1:GFP)^8,9,10 que marcam estágios seletivos do desenvolvimento de melanócitos. O uso dessas linhagens de peixes transgênicos permite a interrogação da biologia celular de melanócitos em nível de organismo no contexto tecidual com pistas apropriadas de acordo com as linhas do tempo de desenvolvimento. Esses repórteres complementam a quantificação de melanócitos baseada em pigmentos e permitem uma avaliação distinta do número de melanócitos, independentemente do conteúdo de melanina.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para decifrar a biologia dos melanócitos através da avaliação de dois parâmetros críticos, a saber, o conteúdo de melanina e o número de melanócitos. Enquanto a primeira é uma leitura funcional comum emanada de uma resposta de hipopigmentação, a segunda está associada a uma redução na especificação ou sobrevivência dos melanócitos e é frequentemente associada a condições genéticas ou adquiridas de despigmentação. A estratégia geral deste rastreamento genético reverso é silenciar genes selecionados usando um morfolino e investigar os desfechos específicos dos melanócitos. O conteúdo de melanina é analisado usando quantificação baseada em imagem dos valores médios de cinza seguido de confirmação usando um ensaio de conteúdo de melanina. O número de melanócitos em vários estágios de maturação é analisado usando quantificação baseada em imagem e posteriormente confirmado usando a análise FACS. Aqui, o protocolo de triagem é demonstrado usando dois genes candidatos, a anidrase carbônica 14, envolvida na melanogênese, e uma variante de histona H2AFZ.2 envolvida na especificação de melanócitos da população precursora da crista neural. Enquanto o primeiro altera o conteúdo de melanina e não o número de melanócitos, o segundo altera o número de melanócitos especificados e, consequentemente, o conteúdo de melanina no embrião. Em todos, este método fornece um protocolo detalhado para identificar o papel de um gene candidato na pigmentação e distinguir seu papel no controle do número de melanócitos versus o conteúdo de melanina.

Protocolo

Os experimentos com zebrafish foram realizados em estrita conformidade com a aprovação institucional de ética animal (IAEC) do CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Índia (Proposta nº 45a). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

1. Injeção de morfolino em embriões de peixe-zebra

1. Usando um puxador de agulha padrão, desenhe pipetas muito afiadas e de ponta fechada.
2. Carregar a solução contendo morfolino nas micropipetas usando uma ponta de microcarregador e inseri-la no aparelho microinjetor. Aperte o parafuso corretamente para travar a micropipeta.
   NOTA: A padronização da dosagem de morfolinos é necessária. A dosagem adequada tem uma taxa de sobrevivência de >70% e um fenótipo específico em 24 hpf.
3. Corte a ponta da micropipeta com pinça fina e calibre-a¹¹.
4. Para calibrar, injetar 1 volume de solução de morfolino no tubo capilar a partir da micropipeta, mantendo o tempo de injeção em 1 s. Repita isso cinco vezes. Usando o volume padrão, 1 mm = 30 nL, encontre o volume injetado em 5 s mantendo o tubo capilar contra uma balança de medição. Usando as informações acima, calcule o tempo (em segundos) necessário para injetar 1-3 nL por injeção¹².
   NOTA: O padrão, 1 mm = 30 nL, é específico para as configurações de pressão do microinjetor e diâmetro do capilar usado para calibração. Idealmente, a injeção deve ser feita na interface gema-célula, que é formada dentro de 15-20 minutos após a fertilização. Para facilitar injeções múltiplas, o desenvolvimento pode ser ligeiramente atrasado pela manutenção dos embriões a uma temperatura mais baixa (18 °C). No entanto, isso deve ser mantido a um mínimo e não estendido além de 30 min devido ao efeito composto da temperatura mais baixa sobre as alterações de expressão gênica.
5. Monte os embriões em uma placa de Petri fundida em agarose (60 mm). Empilhe os embriões firmemente dentro das cristas. Usando pipetas de vidro polido a fogo, alinhe-as na orientação adequada para injeção.
6. Sob um microscópio, use manipuladores para aproximar a micropipeta do embrião e injete dentro da interface gema-célula pressionando o pedal.
7. Injetar todos os embriões da mesma forma; coletá-los em uma placa de Petri contendo água fresca do embrião e incubar a 28 °C.
8. Verifique os embriões injetados após 6-8 h. Remova todos os embriões mortos identificáveis devido à sua alta opacidade e continue trocando a água do embrião pelo menos uma vez por dia para evitar a infecção.

2. Análise da pigmentação

1. Preparo para contagem de melanóforos da linha média lateral em embriões de peixe-zebra 3 dpf
   1. Tratar embriões com anestésico neuromuscular a 0,016% para imobilizá-los.
   2. Para montar os embriões para obtenção de imagens, adicione alguns mililitros de metilcelulose a 1,5-2% na placa de Petri (60 mm) para que ela forme uma camada fina. Usando uma pipeta de Pasteur, pegue os embriões e posicione-os suavemente em metilcelulose para restringir ainda mais os movimentos durante a imagem.
   3. Ajuste sua posição para obter imagens ideais laterais (listras dorsais, faixas ventrais, listras vitelínicas e melanóforos da linha média) ou dorsais (melanóforos na parte dorsal da cabeça). Para melhor resolução dos melanóforos adjacentes, imagem em maior aumento (>5x)
2. Imagem de campo brilhante
   NOTA: A imagem de campo brilhante é realizada usando um estereomicroscópio com aumento de 8-10x.
   1. Coloque a placa de Petri contendo os embriões de peixe-zebra sob o microscópio. Com o uso de um manipulador, ajustar os peixes nessa orientação de modo que todas as cinco listras embrionárias de melanócitos sejam visíveis simultaneamente (dorsal, ventral, duas laterais, gema) (Figura 1C). Capture imagens rapidamente usando o software de aquisição. Caso o animal recupere o movimento antes de ser fotografado, mergulhe-o novamente em anestésico e prossiga com a imagem assim que estiver suficientemente imobilizado.
   2. Repita isso com todos os peixes e certifique-se de que a ampliação permaneça a mesma para todas as imagens.
3. Calculando o valor médio de cinza usando o software ImageJ
   1. Tome imagens dorsais e laterais de embriões de peixe-zebra dpf.
   2. Abra a imagem a ser quantificada no ImageJ usando a ferramenta Abrir . Use a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área a ser analisada. Vá para a opção Definir medidas e selecione Valor cinza médio | área. Pressione M (ou Analisar | Measure) para calcular o valor médio de cinza para a área selecionada.
   3. Mantendo constante a área a ser analisada, calcule a área cinzenta média de cada animal separadamente.
   4. Plote um gráfico de barras com os dados adquiridos (Figura 2F).
4. Ensaio de teor de melanina
   1. A 2 dpf, use uma pipeta de vidro Pasteur para coletar ~25 embriões de peixe-zebra.
   2. Realizar a descorionação manual com agulhas de insulina de 1 mL e adicioná-las a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Eliminar cuidadosamente o meio embrionário e adicionar 1 ml de tampão de lise gelado (fosfato de sódio 20 mM (pH 6,8), Triton X-100 a 1%, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM) com cocktail inibidor de protease e preparar lisados proteicos por sonicação.
   4. Dissolver os lisados em 1 mL de NaOH 1 N e incubar as amostras a 100 °C por 50 min em banho-maria. Vórtice intermitentemente para homogeneizar completamente os lisados.
   5. Fazer leituras de absorbância das amostras a 490 nm usando um espectrofotômetro.
   6. Calcular o conteúdo de melanina comparando a absorbância da amostra com uma curva padrão de concentrações conhecidas de melanina sintética (Figura 2G).

3. Contagem de melanóforos

NOTA: A análise de fluorescência em embriões transgênicos de Zebrafish pode ser feita por dois métodos: 1) contagem de células GFP-positivas; 2) mensuração da intensidade da fluorescência.

1. Preparação para contagem de células GFP-positivas baseadas em FACS em embriões de peixe-zebra precoce
   1. Colete 200-250 embriões ftyrp:GFP e lave-os em um filtro usando água pura do embrião. Como controle negativo, processar embriões selvagens (Assam Wildtype) negativos para GFP e compatíveis com estágio¹².
   2. Com base no estágio de interesse, transferir os embriões para uma placa de Petri contendo 0,6 mg/mL de pronase. Após 5-10 min, usando uma pipeta de Pasteur, transfira os embriões descorionados para uma placa de Petri fresca contendo água pura do embrião. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, colete ~100 embriões e transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
   3. Descarte o meio com cuidado e adicione 200 μL de solução de Ringer gelada (tampão de desyolking). Mantendo o tubo no gelo, pipetar o conteúdo para cima e para baixo ~20 vezes até que a gema seja dissolvida. Centrifugar os tubos a 100 × g durante 1 min numa centrífuga de mesa a 4 °C. Centrifugar novamente e descartar cuidadosamente o sobrenadante.
   4. Usando uma pipeta de 1 mL, transferir os embriões desgemados para uma placa de Petri contendo 10 mL de solução de tripsina (tampão de dissociação celular). Execute-o em várias placas de Petri para evitar superlotação dos embriões e tripsinização ineficiente. Utilizar uma pipeta de 1 ml, misturar a solução que contém os corpos embrionários uma ou duas vezes para diminuir a agregação.
   5. Incubar as placas de Petri à temperatura ambiente durante 15 min (embriões <24 hpf) ou 30 min (embriões 24-30 hpf). Aspirar e dispensar a suspensão ocasionalmente usando uma pipeta de 1 mL para ajudar na desintegração das células.
   6. Durante o período de incubação, inicialize a máquina de citômetro de fluxo para contagem celular.
   7. Coloque um filtro celular de 70 μm acima de um tubo cônico de 50 mL e passe a suspensão tripsinizada através do filtro para obter uma suspensão de célula única. Lave as placas de Petri com a mesma suspensão algumas vezes para remover as células aderidas à superfície.
   8. Gire as amostras a 450 × g, 4 °C por 5 min em um rotor de caçamba oscilante.
   9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1mL de solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) gelada.
   10. Gire novamente a 450 × g, 4 °C durante 5 min e elimine o sobrenadante.
   11. Por fim, ressuspenda o pellet em PBS + 5% de soro fetal bovino e mantenha-o no gelo até o FACS correr.
2. Preparação do citômetro de fluxo
   1. Ligue o citômetro de fluxo e inicie a inicialização.
      NOTA: Antes de ligar a máquina, esvazie o caixote do lixo e encha o tanque de fluido da bainha.
   2. Normalizar o fluxo do fluxo para um bocal de 70 μm (ou 85 μm). Deixe-o intacto por 10-15 minutos se estiver instável.
3. Contagem de células marcadas fluorescentemente usando citômetro de fluxo
   1. Inicialize uma nova pasta de experimento e faça um gráfico de dispersão de dispersão direta versus dispersão lateral e um histograma de intensidade de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
   2. Carregue as células do tipo selvagem primeiro para definir as portas de dispersão frontal e lateral (para excluir duplicidades e detritos) e o limite FITC.
   3. Depois que as comportas estiverem definidas, remova a amostra e carregue as células isoladas de embriões Tg(ftyrp1:GFP) para contar melanócitos.
      NOTA: Aqui, como ftyrp1:GFP rotula especificamente melanócitos maduros, o número de células positivas para GFP sob a porta FITC corresponderá ao número de melanócitos.
   4. Repita o passo acima com amostras injetadas com morfolinos para estimar e comparar o número de melanócitos com o controle.
4. Mensuração da intensidade de fluorescência em embriões de peixe-zebra
   1. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, colete de 100 a 120 embriões e transfira-os para uma placa de Petri contendo água pura do embrião.
   2. Em ~10-12 hpf, transferir os embriões para 0,003% 1-fenil-2-tiouréia para inibir a pigmentação.
   3. Realizar descorionação manual usando agulhas de insulina para obtenção de imagens <48 hpf embriões.
   4. Para imobilizar embriões, tratá-los com tricaína 0,016%.
   5. Para montar embriões para aquisição de imagens, coloque alguns mL de metilcelulose a 1,5-2% na placa de Petri (60 mm) para que ela forme uma camada fina. Adicione os embriões à metilcelulose para restringir qualquer movimento adicional durante a aquisição de imagens. Coloque a placa de Petri contendo as amostras sob o microscópio. Usando uma ponta de pipeta, ajuste o animal na orientação desejada.
   6. Adquira imagens utilizando o software de aquisição. Para embriões <24 hpf, capturar todo o embrião de uma só vez sob aumento de 10x. Para estágios de >24 hpf, adquira vários campos de varredura e, posteriormente, monte-os (costurar) juntos.
   7. Repita isso com todos os peixes e certifique-se de que a configuração para aquisição permaneça constante durante todo o experimento.
5. Quantificação
   1. Analise ainda mais a imagem usando o software ImageJ.
   2. Abra a imagem a ser quantificada no ImageJ usando a ferramenta Abrir .
   3. Use a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área de análise (Figura 3E).
   4. Pressione M (ou Analisar | Medida) para adquirir uma medida de intensidade de área selecionada.
   5. Mantendo constante a área a ser analisada, calcule a intensidade média por área para cada animal separadamente.

Resultados

O fluxo de trabalho descrito na Figura 1 foi usado para realizar a perturbação genética baseada em morfolinos no estágio unicelular do peixe-zebra. A análise da pigmentação foi realizada por vários métodos, conforme mencionado a seguir. Para ilustrar os resultados representativos, volumes padronizados de morfolino antisenso visando os genes h2afv e ca14 foram injetados na gema ou no estágio unicelular do embrião do peixe-zebra. A fenotipagem inicial baseada na im...

Discussão

O fenótipo de pigmentação manifesta-se frequentemente como alterações no conteúdo de melanina ou no número de melanócitos portadores de pigmento. O método aqui descrito permite a dissecção dessa dicotomia e permite avaliar qualitativamente e quantitativamente o conteúdo de melanina e o número de melanóforos por embrião, independentemente do conteúdo de melanina. A alta fecundidade do peixe-zebra, a natureza visível dos melanócitos pigmentados e a falta de transferência de melanossomos permitem a dissec...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization