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Resumo

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Resumo

Drogas quimioterápicas podem induzir danos irreparáveis de DNA em células cancerosas, levando à apoptose ou senescência prematura. Ao contrário da morte celular apoptótica, a senescência é uma máquina fundamentalmente diferente que restringe a propagação de células cancerígenas. Décadas de estudos científicos revelaram os efeitos patológicos complexos das células cancerígenas senescentes em tumores e microambientes que modulam células cancerígenas e células estromais. Novas evidências sugerem que a senescência é um fator prognóstico potente durante o tratamento do câncer e, portanto, a detecção rápida e precisa de células senescentes em amostras de câncer é essencial. Este artigo apresenta um método para visualizar e detectar senescência induzida por terapia (TIS) em células cancerosas. Linhas celulares difusas de grandes células B (DLBCL) foram tratadas com mafosfamida (MAF) ou daunorubicina (DN) e examinadas para o marcador de senescência, β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal), o marcador de síntese de DNA 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU), e o marcador de dano de DNA gama-H2AX (γH2AX). A imagem do citómetro de fluxo pode ajudar a gerar imagens unicelulares de alta resolução em um curto período de tempo para visualizar e quantificar simultaneamente os três marcadores em células cancerosas.

Introdução

Uma variedade de estímulos pode desencadear senescência celular, fazendo com que as células entrem em um estado de parada estável do ciclo celular. Esses estímulos incluem alterações intrínsecas de sinalização ou tensões extrínsecas. Sinais intrínsecos incluem encurtamento progressivo do telômero, alterações na estrutura do telômero, modificação epigenética, distúrbios da proteostase, disfunção mitocondrial e ativação de oncogênicos. As tensões extrínsecas incluem sinais inflamatórios e/ou de danos teciduais, radiação ou tratamento químico e privação nutricional 1,2,3,4. Entre os tipos distintos de senescência, os mais comumente vistos e bem estudados são senescência replicativa, senescência induzida por oncogênico (OIS), senescência induzida por radiação e senescência induzida pela terapia (IS). OIS é uma resposta celular aguda aos danos genotoxicos causados pelo estresse replicativo gerado pela ativação do oncogene aberrante e pode, em certa medida, impedir a progressão patológica de uma lesão pré-inoplástica para um tumor completo. O TIS acontece quando as células tumorais são estressadas por drogas quimioterápicas ou radiação ionizante 5,6.

Senescência é considerada uma espada de dois gumes em patologia devido à sua natureza altamente dinâmica. Foi inicialmente descrito como um mecanismo benéfico para remover células danificadas da piscina circulante de células divisórias, salvaguardando a função normal dos órgãos e inibindo o crescimento do tumor 7,8,9. No entanto, evidências emergentes sugerem um lado negro da senescência. As células senescentes secretam citocinas proinflamatórias, conhecidas como fenótipo secreto associado à senescência (SASP), levando à fibrose e órgãos defeituosos e promovendo a iniciação e progressão do tumor10. Além disso, as células cancerígenas senescentes passam por reprogramação epigenética e de expressão genética em paralelo com a remodelação da cromatina e ativação de uma resposta sustentada de danos de DNA (DDR)11,12, recém-adquirindo novas propriedades de células-troncocancerosas 3. Embora os tumores capazes de senescência respondam melhor à intervenção terapêutica em comparação com os indeferidores de senescência13, a persistência das células senescentes pode levar a um prognóstico de longo prazo ruim se não forem efetivamente identificados e eliminados por drogas senolíticas5. De qualquer forma, um método confiável para avaliar a senescência é de interesse clínico significativo, não apenas para o prognóstico do tratamento terapêutico, mas também para o desenvolvimento de novas estratégias voltadas para células senescentes.

Independentemente de diferentes gatilhos, as células senescentes apresentam algumas características comuns, incluindo morfologia ampliada, achatada, multinucleada com grandes vacúolos, núcleos significativamente expandidos, formação de heterocromatina associada à senescência h3K9me3 (SAHF) no núcleo, acúmulo persistente de focos de dano de DNA γH2AX, ativação p53-p21CIP1 e RB-p16INK mecanismos regulatórios do ciclo celular, detenção estável do ciclo celular G1, indução maciça de SASP e atividade de β-galactosidase associada à senescência elevada (SA-β-gal)atividade 14. Uma vez que nenhum marcador único é suficiente para definir senescência, a coloração enzimática para a atividade SA-β-gal, que é considerada o padrão ouro para detecção de senescência, é geralmente combinada com coloração imunohistoquímica para H3K9me3 e Ki67 para detectar TIS15. No entanto, a sa-β-gal de base cromogênica química é difícil de quantificar. Aqui, combinamos 5-dodecanoylaminofluoresceín-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) baseado em fluorescência SA-β-gal (fSA-β tecção de imunofluorescentes para γH2AX e DNA incorporado edu para identificar células senescentes C12FDG+EdU-ΓH2AX+ usando o sistema avançado de citômetro de fluxo de imagem, que combina a velocidade, sensibilidade e imagens detalhadas unicelulares com informações espaciais que não podem ser fornecidas por citometria de fluxo e microscopia. Este método permite a rápida geração de imagens de alta resolução permitindo o posicionamento e quantificação de sinais fluorescentes dentro das células, ao mesmo tempo em que licencia a análise rápida de várias amostras através da construção de dutos padrão.

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Protocolo

1. Linhas celulares DLBCL com tratamento de mafosfamida ou daunorubicina para induzir senescência celular

NOTA: O protocolo também funciona para células cancerígenas aderentes. Dependendo do tamanho da célula, a semente 1-2 × 105 células em um poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante a noite antes do tratamento. As etapas do protocolo são as mesmas das células de suspensão, mas com duas exceções. Primeiro, as células precisam ser experimentadas fora da placa após a etapa 3.4. Em segundo lugar, as etapas de lavagem são realizadas sem centrifugação antes da experimentação.

  1. Conte células DLBCL e sementes 1 × 106 células/mL em 4 mL de médio por poço em uma placa de cultura de 6 poços. Cultivar células DLBCL em RPMI-1640 médio suplementado com soro bovino fetal de 10% (FBS) e penicilina/estreptomicina de 100 U/mL.
  2. Adicione MAF (5 μg/mL) ou DN (20 ng/mL) na cultura celular e balance suavemente a placa para misturar.
    NOTA: MAF e DN não estão estáveis. Após a dissolução no DMSO, a solução de estoque deve ser aliquoted e armazenada a -20 °C. Os ciclos de congelamento/degelo devem ser evitados.
  3. Incubar a placa em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante 3 dias.
  4. Após uma incubação de 3 dias, colete as células DLBCL em tubos de centrífugas estéreis de 15 mL e gire a 100 × g, 4 °C por 5 min.
  5. Descarte o supernatante, resuspenque as pelotas celulares com 4 mL de meio fresco e adicione as suspensões de volta na placa de 6 poços.
  6. Cultive a placa celular em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C por mais 2 dias antes da colheita para análise.

2. Prepare soluções para coloração (Tabela 1)

3. Colora células DLBCL com diferentes marcadores de senescência

NOTA: As amostras de células manchadas com marcadores individuais (ou seja, pacific blue-EdU, C12FDG ou Alexa Fluor 647-γH2AX) estão preparadas para gerar uma matriz de compensação para corrigir o derramamento de fluorescência durante a medição. Embora altamente sugerido, esta etapa poderia ser suspensa quando houver uma sobreposição omitível (valor de coeficiente de compensação ≤ 0,1) do espectro de emissões entre diferentes fluoroforos. No entanto, os usuários devem determinar etapas padronizadas de compensação ao usar diferentes instrumentos e painéis fluorescentes.

  1. Adicione a solução EdU de 10 mM a uma proporção de 1:1.000 na cultura celular DLBCL gerada a partir da etapa 1.6 (a concentração final de EdU é de 10 μM). Balance suavemente a placa para misturar e incubar em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C por 3h.
  2. Tire a placa da incubadora e adicione a solução de cloroquina de 100 mM a uma concentração final de 75 μM (ver discussão). Balance suavemente a placa para misturar e incubar em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C por 30 min.
  3. Retire a placa da incubadora e adicione 20 mM C12FDG solução a 1: 1.000 a uma concentração final C12FDG de 20 μM. Abale suavemente a placa para misturar e incubar em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C por 1 h.
  4. Tire a placa da incubadora e adicione a solução de 100 mM 2-feniltil-β-D-thiogalactoside (PETG) às 13:50 para parar a mancha fSA-β-gal (concentração final petg de 2 mM). Gire suavemente a placa para misturar.
  5. Transfira as células para tubos de centrífuga estéril de 15 mL e gire a 100 × g, 4 °C por 5 min. Descarte o supernatante e lave as células com 4 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS).
  6. Repita a etapa de lavagem do PBS. Descarte o supernatante e resuspenque as pelotas celulares em 500 μL de solução de fixação de paraformaldeído de 4%.
  7. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente por 5 min. Descarte as células supernascidas e lave com 4 mL de PBS.
  8. Repita a etapa de lavagem do PBS. Descarte o supernatante, resuspenja a pelota celular em 200 μL de tampão de permeabilização de saponina e transfira a suspensão para um novo tubo de 1,5 mL. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente por 5 min.
  9. Descarte o supernatante e resuspenque as pelotas celulares em 200 μL de solução de anticorpos primários (1:500 anticorpos γH2AX na solução de incubação de anticorpos). Incubar a 4 °C durante a noite no escuro.
  10. Centrifugar os tubos a 250 × g, 4 °C por 5 min. Descarte o supernatante e lave com 100 μL de solução de lavagem de saponina.
  11. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes. Descarte o supernasce e resuspenque as pelotas de célula em 500 μL de coquetel de detecção de EdU.
  12. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Centrifugar a 250 × g, temperatura ambiente por 5 min. Descarte o supernatante e lave com 1 mL de solução de lavagem de saponina.
  13. Repita o passo de lavagem duas vezes. Descarte o supernasce e resuspenque as pelotas celulares em 20-50 μL de PBS. Prossiga para a seção 4 para medição da amostra.

4. Marcadores de senescência de imagem usando o sistema de citômetro de fluxo de imagem

  1. Esvazie a garrafa de fluido de resíduo. Verifique os níveis de contas de velocidade, esterilizador, limpador, depurador, bainha e reagentes de lavagem (água desionizada) para garantir fluidos suficientes antes de ligar o instrumento (ver a Tabela de Materiais).
  2. Ligue o instrumento e o software de imagem (veja a interface de software na Figura 1A).
  3. Clique no botão Iniciar para inicializar fluidez e calibração do sistema.
    NOTA: Este procedimento leva aproximadamente 45 min.
  4. Defina a ampliação em 40x, defina a velocidade fluidica para baixo e ligue os lasers necessários no experimento. Ligue lasers de 405 nm, 488 nm e 642 nm para medir edu-pacífico azul, C12FDG e Alexa Fluor 647-γH2AX (ou Alexa Fluor 647-Ki67), respectivamente. Defina Ch6 para o canal de dispersão, e Ch1 e Ch9 para brightfield.
  5. Comece com a amostra esperada para ter a maior fluorescência para configurar a intensidade dos lasers. Gire suavemente o tubo de amostra para misturar. Abra a tampa do tubo e insira o tubo de amostra na doca. Clique em Carregar para iniciar.
  6. Abra um gráfico de dispersão e selecione as características Area_M01 e Aspect Ratio_M01 para os eixos X e Y, respectivamente. Defina um portão acima da proporção de 0,5 para excluir doublets e agregados celulares abaixo e no lado direito, e a população de contas de velocidade no lado esquerdo (Figura 1B).
  7. Abra um plot histograma e selecione o recurso Gradiente RMS_M01_Ch01 para o eixo X. Escolha a população singlet e defina o portão para selecionar para células focadas (Figura 1C).
    NOTA: O sistema de imagem usará automaticamente contas de velocidade para ajustar o foco para imagens. No entanto, recomenda-se selecionar a metade certa do pico do histograma para a população mais focada.
  8. Abra um plot histograma e selecione Intensidades de Pixel Raw Max para eixo X para cada canal de cores (Ch2, 7 e 11). Ajuste os poderes laser (ou seja, 488 nm, 405 nm e lasers de 642 nm para Ch2, 7 e 11, respectivamente), de modo que cada fluorocromo tem um valor Raw Max Pixel entre 100 e 4.000 para evitar a supersaturação.
    NOTA: Para este experimento, a configuração de potência laser é de 50 mW, 200 mW e 50 mW para lasers de 488 nm, 405 nm e 642 nm, respectivamente.
  9. Escolha a população focada para gravar e clicar em Adquirir para medir as amostras de DLBCL com configurações consistentes. Ao alterar amostras para medição, clique em Retornar para recuperar o tubo de amostra. Pressione a carga para descartar a amostra.
  10. Depois que todas as amostras forem medidas, desligue o campo brilhante e espalhe laser. Meça amostras de controle de cor única para gerar uma matriz de compensação.
  11. Clique em Shutdown para fechar o sistema de imagem.
  12. Analise os dados no software de análise de imagens.
    1. Use a ferramenta Spot Wizard do software de análise de imagens para contar e quantificar os focos nucleares γH2AX em imagens de células vivas. Selecione duas populações de células (uma com alta e outra com baixa contagem de pontos) para treinar o assistente spot para uma análise adicional automática da contagem de pontos.

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Resultados

Uma matriz de compensação foi gerada por meio de software de análise de imagem, carregando dados gravados de amostras de controle de cor única. Como mostrado na Figura Suplementar S1, foi detectado um derramamento de luz não desprezível (coeficiente ≥ 0,1) de EdU para C12FDG com valor de coeficiente de crosstalk 0,248, enquanto o crosstalk entre outros canais não foi significativo. Quatro diferentes linhas celulares DLBCL foram tratadas com 5 μg/mL MAF ou 20 ng/mL DN para induzir sen...

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Discussão

Este método examinou a capacidade de entrada de senescência de quatro diferentes linhas celulares DLBCL após o tratamento quimioterápico, com imagem de campo brilhante e quantificação baseada em citometria de fluxo. Em um nível unicelular, detectamos com sucesso populações senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ em células KARPAS422 e WSU-DLCL2 tratadas, e em menor grau nas células OCI-LY1, enquanto a linha celular SU-DHL6 era resistente ao tratamento. A diferença na capacidad...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para Yong Yu da Universidade Johannes Kepler Linz (BERM16108001).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) AntibodyBiolegend613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)Fisher Scientific11590276
Chloroquin -diphosphatSigma aldrichC6628
Cleanser (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay KitThermo ScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)LuminexCN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) Sigma aldrichP4902
saponinSigma aldrich47036
SheathMilliporeBSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStreamLuminex400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

Referências

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