Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

Resumo

Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.

Resumo

Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.

Introdução

Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos¹. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença², rastreamento de drogas e terapia celular.

A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação³. Embora os sistemas de cultura organoide cerebral tenham alcançado grande sucesso, eles ainda enfrentam desafios críticos que limitam sua aplicação. Por exemplo, o cultivo manual envolve etapas complicadas de manipulação e introduz obstáculos para alcançar aplicações em larga escala. Além disso, em cada estágio de desenvolvimento na cultura dos organoides cerebrais, são necessárias mudanças em diferentes mídias e citocinas⁴. No entanto, no estágio inicial, os organoides ou EBs têm tamanhos minúsculos (aproximadamente 200 μm a 300 μm) e são quase visualmente inacessíveis sem aparelhos apropriados. Inevitavelmente, uma certa quantidade de amostras organoides preciosas são lavadas quando o meio é alterado. Muitas técnicas têm sido exploradas para superar isso em outros tipos de culturas organoides, e alguns exemplos incluem a imersão de chips organoides inteiros em um meio de cultura por 3 dias sem intervenção⁵; adicionando um meio fresco através do deslizamento de tampas depois que o meio antigo é absorvido usando papel absorvente⁵; ou aplicar dutos microfluidos complexos para troca de fluidos ^6,7,8. Outro obstáculo encontrado no estágio inicial do cultivo organoide é a dificuldade de alcançar observações diretas a olho nu, o que pode causar más operações que levam a danos organoides e perda durante as etapas de transferência organoide. Portanto, é necessário estabelecer um protocolo mais viável que facilite a mudança média e a transferência organoide para gerar organoides.

Propõe-se uma operação otimizada correspondente com base nos princípios da engenharia para superar esses problemas, o que facilita significativa e convenientemente muitos procedimentos organoides. Na natureza, quando o sol brilha em uma casa através de uma abertura de janela, o olho nu pode ver a poeira dançando no feixe de luz. Devido ao reflexo difuso da luz solar sobre a poeira, alguma luz é refratada no globo ocular para produzir uma imagem visual. Inspirado no princípio desse fenômeno ^9,10, este estudo fez uma lâmpada de luz macia e iluminou os EBs lateralmente. Verificou-se que os EBs poderiam ser visualmente claros sem afetar o escopo de visualização. Um fluxo secundário apontando para o centro é gerado no líquido girando a placa de cultura devido às correntes de eddy¹¹. EBs originalmente dispersos se acumulam no centro da placa. Com base nisso, e no fenômeno de que a velocidade de sedimentação dos organoides é mais rápida que a das células, propõe-se um método de operação fácil de mudança média e transferência organoide sem centrifugação. Os organoides no meio da cultura podem ser efetivamente separados de células livres e fragmentos de células mortas através desta operação de transferência.

Aqui, um protocolo de fácil funcionamento é proposto para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A tecnologia de operação foi otimizada aplicando o princípio da engenharia, tornando as operações na cultura 3D tão simples e viáveis quanto as da cultura 2D. O método de troca de líquidos melhorado e a operação de transferência organoide também são úteis para outros tipos de cultura organoide e o projeto de máquinas de cultura automática.

Protocolo

O protocolo foi conduzido após a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (Revisão Médica e Ética [2021] Nº 022). Antes do experimento, cada meio foi preparado de acordo com a fórmula¹² de Juergen A. Knoblich (Tabelas Suplementares 1-4), ou um Kit Organoide Cerebral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Os iPSCs utilizados neste estudo foram previamente estabelecidos pelo nosso laboratório e obtiveram isenção informada. Os SCA3-iPSCs foram gerados a partir de uma ataxia spinocerebellar fêmea de 31 anos de idade genótipo 3 (SCA3) genótipado como abrigando 26/78 CAG repetições no gene ATXN3¹³ (Figura Suplementar 1A). Os iPSCs humanos normais mencionados em artigo anterior foram selecionados como NC-iPSCs¹⁴, e o gene ATXN3 foi identificado como tendo repetições de CAG 14/14 (Figura Suplementar 1B).

1. Preparação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)

1. Coletar 3 mL de sangue periférico por venipuntura com o consentimento informado de voluntários e pacientes.
2. Isole as células mononucleares periféricas de acordo com o método Ficoll-Paque¹⁵.
3. Estabelecer iPSCs de acordo com o protocolo do Kit de Reprogramação Sendai (ver Tabela de Materiais).
   1. Cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em placas de Petri de 35 mm cobertas com Matrigel (uma matriz de membrana de porão, ver Tabela de Materiais). Mude o meio todos os dias. A densidade de crescimento do IPSC não deve exceder 75%.
   2. Digerir as células com solução de dissociação de PSC (ver Tabela de Materiais) e subcultura-las a uma razão de 1:5 a cada 3-5 dias.
      ATENÇÃO: O vírus Sendai é usado aqui. Deve ser operado no gabinete de biossegurança, e medidas de autoproteção devem ser tomadas. Deve ficar claro se pode ser usado legalmente no país local. As leis e regulamentos locais de biossegurança devem ser rigorosamente seguidos quando utilizados.

2. Preparação do EB (dias 0-1)

1. Retire o meio mTeSR1 dos iPSCs com uma pipeta e lave-o 2x com 1 mL de 1x PBS.
2. Remova o PBS com uma pipeta e adicione 300 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) para digerir os iPSCs em células únicas por 3-4 min a 37 °C.
3. Resuspenda as células em 2 mL de meio de formação de EB (Tabela Suplementar 1) e, em seguida, centrifugar a amostra por 5 min a 300 x g (temperatura ambiente).
4. Pré-tre a placa especializada de 24 poços com solução anti-adesão enxaguante (500 μL/well) por 5 min (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A solução de lavagem anti-adesão é essencial para a formação ideal de EB e esferoide.
5. Resuspentive as células em meio de formação de EB contendo Y-27632 (concentração final, 10 μM, ver Tabela de Materiais), com densidade celular de 1,5 x 10⁶ células/mL.
6. Remova a solução anti-adesão e enxágue cada poço com 2 mL de meio de formação de EB.
7. Adicione as células às placas especializadas de 24 poços a uma densidade de 3 x 10⁶ células/bem (Figura 1A, à esquerda).
   NOTA: Normalmente, 300 EBs podem ser preparados em cada poço. Este método pode preparar grandes quantidades de EBs do mesmo tamanho.
8. Centrifugar a placa a 100 x g por 2 min a temperatura ambiente. Distribua uniformemente as células em cada câmara na parte inferior da placa (Figura 1A, à direita).
   NOTA: Se não houver centrífuga adequada, a placa também pode ser diretamente colocada na incubadora para cultura estática, mas o tempo de formação da bola EB será várias horas mais tarde do que o sob centrifugação normal.
9. Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h. Se a centrifugação não foi utilizada na etapa anterior, incubar por 36 h. Mantenha a amostra estável e não a tire da incubadora durante esse período.

3. Preparação da lâmpada de luz macia (dia 1)

1. Use uma placa de acrílico transparente com uma espessura de 0,3-0,5 cm no tamanho do papel A5. Cole almofadas brancas na frente e atrás da placa acrílica.
   1. Instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo (Figura Suplementar 2A-F, Figura 1B).
      NOTA: Como os diâmetros dos EBs no estágio inicial são de aproximadamente 200 μm a 300 μm, é difícil observá-los claramente a olho nu sob a lâmpada fluorescente de bancos limpos. Em contraste, devido ao aprimoramento da reflexão difusa, podemos detectar claramente os EBs usando luz suave iluminada lateralmente (Figura 1B, C). Uma placa de 6 poços é recomendada para culturas EB em experimentos subsequentes. No entanto, para mostrar melhor o efeito visual da luz suave, os pratos às vezes são usados para tirar fotos e vídeos neste estudo em vez de pratos, por isso, por favor, não entenda mal. A lâmpada de luz macia iluminada lateralmente também pode ser usada para a placa de 6 poços.

4. Transferência de EB e substituição média (dias 2-5)

1. Prepare uma nova placa de adesão de 6 poços e adicione 2 mL de meio de formação EB a cada poço.
2. Remova os EBs junto com o meio com uma ponta de pipeta de 1000 μL (ver Tabela de Materiais) e transfira-os para a placa de adesão de 6 poços (~100 EBs/well).
   NOTA: O processo de operação adota uma lâmpada de luz macia (mencionada na etapa 3.) para tornar os EBs mais fáceis de observar. Desligue outras fontes de luz interior para obter melhor o efeito visual da luz suave.
3. Substitua pelo mesmo volume de meio de formação de EB fresco todos os dias. Use o fluxo secundário para reunir os EBs para o centro e alterar o meio.
   1. Aspire o velho meio por pipetar até a borda do poço lentamente. Não chupe muito forte; caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione meio fresco para resuspensar os EBs.
      NOTA: O fluxo secundário de princípio (Figura 1D). Induzir um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Devido ao fluxo de redemoinho, um fluxo secundário é induzido direcionado para o centro. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado através da rotação, após o qual a mudança média ou a transferência embrionária podem ser executadas prontamente.

5. Verificar a pluripotência rotulando com marcador de pluripotência OCT4 (dia 4)

NOTA: Quando o diâmetro dos EBs for superior a 300 μm, leve vários EBs para coloração de imunofluorescência marcador OCT4 para detectar sua pluripotência.

1. Fixar os EBs em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 30 min, seguido de lavagem em 1x PBS 3x por 10 min cada vez.
2. Transfira os EBs para PBS de temperatura ambiente contendo 0,3% Triton X-100 e 3% BSA por 2 h, seguido de lavagem em PBS 3x por 10 min cada vez.
   NOTA: Após serem tratados com o TR X-100, os EBs flutuam na superfície líquida e podem ser facilmente sugados com o líquido durante a limpeza. Recomenda-se a operação sob um estereótipo.
3. Diluir o anticorpo primário OCT4 (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de 1x PBS contendo 1% de BSA a uma proporção de 1:200 e adicionar aos EBs para incubação a 4 °C durante a noite, em seguida, lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
4. Diluir o respectivo anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS às 1:500 e adicionar 1 mL aos EBs.
5. Depois de incubar à temperatura ambiente por 2h, lave as células em 1x PBS 3x por 10 minutos cada vez.
6. Retire o PBS, adicione 2 mL de solução PBS 1x contendo 1 μg/mL DAPI, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois lavar em PBS 3x por 10 minutos cada vez.
7. Mova o EB contendo uma pequena quantidade de líquido no slide, sele o slide com um vidro de cobertura revestido com geleia de petróleo comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) na borda e, em seguida, observe e colete a imagem sob o microscópio confocal de fluorescência.
   NOTA: A expressão OCT4 representa a pluripotência EB¹². Quando a expressão de OCT4 for inferior a 90%, os EBs devem ser descartados, e os EBs devem ser preparados novamente.

6. Indução neural (dias 5-7)

1. Prepare uma nova placa de 6 poços com baixa adesão e adicione 3 mL de meio de indução neural (Tabela Suplementar 2) a cada poço.
2. Ligue a luz suave lateral (mencionada na etapa 3.) e desligue outras fontes de luz interior.
3. Transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado (~100 EBs/bem). Adicione o mínimo possível do meio original ao novo poço.
   NOTA: Introduza habilidades simples de transferência oforganoid. Naturalmente, sob gravidade e com uma densidade relativamente maior do que o médio, os EBs resuspended afundarão gradualmente aplicando a operação mostrada na Figura 1E. Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Uma vez que, em comparação com os EBs, células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos através deste método de sedimentação (Figura 1F).
4. Incubar as amostras a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h.
   NOTA: Sob o microscópio, o diâmetro dos EBs era de aproximadamente 500 μm, e a borda era translúcida, indicando que uma camada neuroepitelial se formou.
5. Prossiga para o próximo passo.

7. Incorporação na matriz de membrana do porão (dias 7-10)

1. Coloque a matriz de membrana em uma geladeira de 4 °C com 60 minutos de antecedência para dissolver. Calcule a quantidade da matriz necessária com antecedência. Aproximadamente 100 EBs foram incorporados em 1,5 mL da matriz de membrana.
2. Ligue a luz lateral e desligue a fonte de luz na parte superior do console.
3. Mantenha a matriz de membrana no gelo para evitar a solidificação.
4. Transfira uma pequena quantidade de EBs para um prato de 60 mm contendo meio de expansão fresco (Tabela Suplementar 3) cada vez. Reduza o número de EBs para facilitar a remoção de um único EB.
5. Em seguida, use uma nova placa de adesão de 6 poços baixos. Chupe um único EB (contendo aproximadamente 10 μL médio) com uma ponta de pipeta de 200 μL (ver Tabela de Materiais) cada vez, e depois adicione-o ao fundo da placa de 6 poços para fazer gotículas. Use cinco gotículas por poço.
   NOTA: A chave é ajustar o alcance da arma pipeta para 50 μL e chupar um EB e, em seguida, referir-se ao funcionamento da Figura 1E. Quando o EB se acomoda ao furo da ponta da pipeta, a ponta toca rapidamente o fundo da placa e empurra aproximadamente 10 μL de líquido para formar uma gota.
6. Adicione 15 μL da matriz de membrana a cada gota contendo EB e misture-a rapidamente. Incorpore a bola EB no centro da gota.
   NOTA: Os EBs não devem ser aspirados com uma ponta de pipeta padrão, que danifica o EB. A ponta de pipeta de 200 μL precisa ser usada em seu lugar.
7. Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos e solidifique as gotículas da matriz de membrana que contêm EBs.
8. Adicione 3 mL do meio de expansão a cada poço e exploda suavemente os EBs incorporados pela matriz para suspendê-los.
9. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 3 dias.
   NOTA: Se a brotação na superfície da EB for observada, significa que um neuroepithelium expandido foi formado¹⁶.

8. Maturação organoide (dias 10-40)

1. Retire suavemente o meio original e adicione 3 mL de meio de maturação (Tabela Suplementar 4) a cada poço.
2. Coloque a placa organoide em um agitador horizontal em uma incubadora de 37 °C.
3. Continue a girar a cultura horizontalmente. Coloque o agitador na velocidade apropriada.
   NOTA: Ao esculpir organoides cerebrais em uma placa de 6 poços, uma força centrífuga relativa (RCF) de 0,11808 x g é mais apropriada, de acordo com o fabricante do agitador horizontal (ver Tabela de Materiais). De acordo com a conversão entre a força centrífuga relativa e a velocidade rotativa^17,18, RCF = 1,118 x ^10-5 × R × rpm², onde RCF = força centrífuga relativa (g), rpm = revoluções por minuto (r/min) e R = raio de rotação (cm), também conhecido como arremesso de tremor. Os parâmetros de arremesso de diferentes shakers podem ser diferentes. Portanto, pode-se estimar que a velocidade rotativa seja rpm = 299 x (RCF/R)^1/2.
4. Mude o meio de maturação fresco a cada 2-3 dias.
5. Após 20-30 dias, gradualmente cultura os organoides cerebrais até a maturidade.
   NOTA: Durante esse período, os organoides podem ser usados para experimentos e detecção, como detecção de marcadores neurais e sequenciamento de transcriptome 19,20,21.

9. Seções congeladas e imunofluorescência de organoides cerebrais

1. Fixar os organoides em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 16 h e depois lavá-los 3x com 1x PBS por 10 min cada vez.
2. Remova o PBS e mergulhe os organoides em 30% de sacarose a 4 °C durante a noite.
3. Incorpore os organoides em 10%/7,5% de gelatina/sacarose a 37 °C por 1h e, em seguida, transfira rapidamente para o molde de incorporação.
4. Adicione gelo seco a 100% etanol para preparar um chorume seco de gelo/etanol, e coloque as amostras organoides nele para congelamento rápido.
5. Armazene as amostras congeladas em um congelador de −80 °C. Quando necessário, faça seções congeladas com uma espessura de 20 μm.
6. Consulte as etapas 5.3.-5.5. para imunofluorescência. Use o anticorpo PAX6 para rotular células progenitoras apical, o anticorpo TUJ1 (ver Tabela de Materiais) para rotular células neuronais 22,23,24 e DAPI para coloração de DNA nuclear.

Resultados

O presente estudo induziu iPSCs (Figura 2B) em organoides cerebrais (Figura 2C). Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 (Figura 2A), que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros (Figura 2D). A pesquisa cultivou iPSCs de indivíduos saudáveis normais e pacientes SCA3 em organoides cerebrais (Fi...

Discussão

Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas²⁸. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/