Fácil preparação e fotoativação de nanomontagens de pró-fármaco-corante

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação e caracterização de um nanoconjunto fotorresponsivo de corante pró-fármaco. A metodologia para liberação de fármacos a partir das nanopartículas por desmontagem desencadeada por luz, incluindo a configuração da irradiação luminosa, é explicitamente descrita. Os fármacos liberados das nanopartículas após irradiação luminosa exibiram excelentes efeitos antiproliferativos em células tumorais colorretais humanas.

Resumo

A automontagem é um método simples, mas confiável, para a construção de sistemas de liberação de fármacos em nanoescala. Os pró-fármacos fotoativáveis permitem a liberação controlável de fármacos a partir de nanocarreadores em locais-alvo modulados pela irradiação luminosa. Neste protocolo, um método fácil para a fabricação de nanopartículas fotoativáveis de pró-fármaco corante via automontagem molecular é apresentado. Os procedimentos para síntese de pró-fármacos, fabricação de nanopartículas, caracterização física da nanomontagem, demonstração de fotoclivagem e verificação de citotoxicidade in vitro são descritos em detalhes. Um pró-fármaco fotoclimovível boro-dipirrometeno-clorambucil (BC) foi sintetizado pela primeira vez. BC e um corante de infravermelho próximo, IR-783, em uma proporção otimizada, poderiam se auto-montar em nanopartículas (IR783/BC NPs). As nanopartículas sintetizadas apresentaram tamanho médio de 87,22 nm e carga superficial de -29,8 mV. As nanopartículas se desmontaram após irradiação luminosa, o que pôde ser observado por microscopia eletrônica de transmissão. A fotoclivagem da CB foi concluída em 10 min, com eficiência de recuperação de 22% para clorambucil. As nanopartículas apresentaram maior citotoxicidade sob irradiação luminosa a 530 nm em comparação com as nanopartículas não irradiadas e o pró-fármaco BC livre irradiado. Este protocolo fornece uma referência para a construção e avaliação de sistemas de liberação fotorresponsiva de fármacos.

Introdução

A quimioterapia é um tratamento comum do câncer que emprega agentes citotóxicos para matar as células cancerosas e, assim, inibe o crescimento tumoral¹. Entretanto, os pacientes podem sofrer efeitos colaterais como cardiotoxicidade e hepatotoxicidade devido à absorção fora do alvo dos quimioterápicos ^2,3,4. Portanto, a liberação localizada de fármacos por meio do controle espaço-temporal da liberação/ativação de fármacos em tumores é essencial para minimizar a exposição a fármacos em tecidos normais.

Os....

Protocolo

1. Síntese do pró-fármaco boro-dipirrometeno-clorambucil (BC) (Figura 2)²²

1. Síntese de BODIPY-OAc
   1. Pesar 1,903 g de 2,4-dimetilpirrol e dissolvê-lo em 20 ml de diclorometano anidro (DCM) num balão de fundo redondo sob atmosfera de azoto. Pesar 1,638 g de cloreto de acetila acetóxi e adicioná-lo gota a gota na solução. Continuar a mexer durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, refluir a solução durante 1 h a 40 °C.
   2. Arrefecer a mistura até à temperatura ambiente. Pesar 5,170 g de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) e adicioná-lo gota a gota na m....

Resultados

NPs IR783/BC foram fabricados com sucesso neste estudo usando um método de precipitação flash. As NPs IR783/BC sintetizadas apresentaram-se como solução roxa, enquanto a solução aquosa de IR783 foi azul (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, os NPs IR783/BC exibiram um tamanho médio de aproximadamente 87,22 nm com um índice de polidispersidade (PDI) de 0,089, demonstrando uma distribuição de tamanho estreita. A carga superficial das IR783/NPs foi de.......

Discussão

Este protocolo descreve um método fácil de precipitação por flash para a fabricação de nanopartículas de corante pró-fármaco, que oferece uma abordagem simples e conveniente para a formação de nanopartículas. Há várias etapas críticas nesse método. Em primeiro lugar, para todas as etapas de síntese, fabricação e caracterização, recipientes como microtubos devem ser cobertos com papel alumínio para evitar fotoclivagem desnecessária do pró-fármaco BC pela luz ambiental. Além disso, na etapa de pre.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1260 Infinity II HPLC	Agilent Technologies
2,4-Dimethyl pyrrole	J&K Scientific	315305
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)	Gibco	M6494
4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP)	J&K Scientific	212279
90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile	SPL	11090
96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile	SPL	30096
Acetoxyacetyl chloride	J&K Scientific	192001
Boron trifluoride diethyl etherate	J&K Scientific	921076
Büchner funnel	AS ONE	3-6466-01
Chlorambucil	J&K Scientific	321407-1G
CM100 Transmission Electron Microscope	Philips
CombiFlash RF chromatography system	Teledyne ISCO
Dichloromethane	DUKSAN Pure Chemicals	JT9315-88
Dimethyl sulfoxide	DUKSAN Pure Chemicals	2762
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	DTS1070	Zeta potential measurement
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	ZEN0040
Empty Disposable Sample Load Cartridges	Teledyne ISCO	693873225	can hold up to 65 g
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Filtering flask	AS ONE	3-7089-03
Hexane	DUKSAN Pure Chemicals	4198
Holey carbon film on copper grid	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd	BZ10023a
HPLC column (InfinityLab Poroshell 120)	Agilent Technologies	695975-902T
Integrating sphere photodiode power sensor	Thorlabs	S142C
IR783	Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd	I1031
LED	Mightex	LCS-0530-15-11
LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software)	Mightex
Lithium Hydroxide Anhydrous	TCI	L0225
Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether	Aladdin	M140783
N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA)	J&K Scientific	203402
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC)	J&K Scientific	275928
penicillin–streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate-buffered saline (10×)	Sigma-Aldrich	P5493
Power and energy meter	Thorlabs	PM100 USB
Rotavapor	BUCHI Rotavapor R300
RMPI 1640	Gibco	21870076
Separatory funnel (125 mL)	Synthware	F474125L
Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g	Teledyne ISCO	692203340
Sodium sulfate, anhydrous	Alfa Aesar	A19890
SpectraMax M4	Molecular Devices LLC
Tetrahydrofuran (THF), anhydrous	J&K Scientific	943616
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Vortex	DLAB Scientific Co., Ltd	MX-S
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instrument