Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Resumo

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Resumo

As células hepáticas humanas podem formar uma estrutura tridimensional (3D) capaz de crescer em cultura por algumas semanas, preservando sua capacidade funcional. Devido à sua natureza de se agrupar nos pratos de cultura com características adesivas baixas ou nenhumas, eles formam agregados de múltiplas células hepáticas que são chamadas de esferoides hepáticos humanos. A formação de esferoides hepáticos 3D depende da tendência natural das células hepáticas de se agregarem na ausência de um substrato adesivo. Essas estruturas 3D possuem melhores respostas fisiológicas do que as células, que estão mais próximas de um ambiente in vivo. O uso de culturas de hepatócitos 3D tem inúmeras vantagens quando comparado com culturas bidimensionais clássicas (2D), incluindo um microambiente mais biologicamente relevante, morfologia arquitetônica que remonta órgãos naturais, bem como uma melhor predição sobre o estado da doença e respostas in vivo a drogas. Várias fontes podem ser usadas para gerar esferoides, como tecido hepático primário ou linhas celulares imortalizadas. O tecido hepático 3D também pode ser modificado usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) para derivar hepatócitos. Obtivemos esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) geradas a partir de sangue periférico não manipulado pela ativação de proteínas ligadas à GPI ligadas à membrana humana e diferenciadas aos hepatócitos humanos. As células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs e os esferoides hepáticos humanos foram analisados por microscopia de luz e imunofenotipagem usando marcadores de hepatócitos humanos.

Introdução

Nos últimos anos, os sistemas de cultura esferoides tridimensionais (3D) tornaram-se uma ferramenta importante para estudar várias áreas de pesquisa sobre o câncer, descoberta de medicamentos e toxicologia. Tais culturas despertam grande interesse porque preenchem a lacuna entre as monocamadas de cultura celular bidimensional (2D) e os órgãos complexos¹.

Na ausência de uma superfície adesiva, em comparação com a cultura de células 2D, a formação de esferoides é baseada na afinidade natural dessas células para se agruparem na forma 3D. Essas células se organizam em grupos que consistem em um ou mais tipos de células maduras. Livres de materiais estranhos, essas células interagem umas com as outras como em seu microambiente original. As células em cultura 3D são muito mais próximas e têm uma orientação adequada entre si, com maior produção de matriz extracelular do que as culturas 2D, e constituem um ambiente próximo ao natural ².

Modelos animais têm sido utilizados há muito tempo para estudar a biologia humana e doenças³. A este respeito, existem diferenças intrínsecas entre humanos e animais, o que torna esses modelos não inteiramente adequados para estudos extrapolativos. Os esferoides e organoides de cultura 3D representam uma ferramenta promissora para estudar a arquitetura, a interação e o crosstalk semelhantes a tecidos entre diferentes tipos de células que ocorrem in vivo e podem contribuir para reduzir ou mesmo substituir modelos animais. Eles são de particular interesse para o estudo da patogênese das doenças hepáticas, bem como das plataformas de triagem de medicamentos⁴.

A cultura esferoide 3D é de particular importância para a pesquisa do câncer, pois pode eliminar a descontinuidade entre as células e seu ambiente, reduzindo a necessidade de tripsinização ou tratamento com colagenase necessário para preparar as monocamadas de células tumorais para culturas 2D. Os esferoides tumorais permitem o estudo de como as células normais versus malignas recebem e respondem aos sinais de seus arredores⁵ e são uma parte importante dos estudos de biologia tumoral.

Em comparação com a monocamada, as culturas 3D que consistem em vários tipos de células se assemelham a tecidos tumorais em suas propriedades estruturais e funcionais e, portanto, são adequadas para estudar metástases e invasão de células tumorais. É por isso que tais modelos esferoides estão contribuindo para acelerar a pesquisa sobre o câncer⁶.

Os esferoides também estão ajudando a desenvolver a tecnologia para criar organoides humanos, porque a biologia de tecidos e órgãos é muito difícil de estudar, particularmente em humanos. O progresso na cultura de células-tronco possibilita o desenvolvimento de culturas 3D como organoides constituídos por células-tronco e progenitores teciduais, bem como diferentes tipos de células maduras (teciduais) de um órgão com algumas características funcionais, como um órgão real, que pode ser usado para modelar o desenvolvimento de órgãos, doenças, mas também podem ser considerados úteis na medicina regenerativa⁷.

Os hepatócitos humanos primários são geralmente usados para estudar a biologia in vitro dos hepatócitos humanos, a função hepática e a toxicidade induzida por drogas. As culturas de hepatócitos humanos têm duas desvantagens principais, em primeiro lugar, a disponibilidade limitada de tecido primário, como os hepatócitos humanos, e, em segundo lugar, a tendência dos hepatócitos a se desdiferenciarem rapidamente em cultura 2D, perdendo assim sua função específica de hepatócitos⁸. As culturas hepáticas 3D são superiores a esse respeito e foram recentemente realizadas a partir de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs)⁹. Os esferoides 3D hepáticos de bioengenharia são de particular interesse para estudar o desenvolvimento, a toxicidade, as doenças genéticas e infecciosas do fígado, bem como na descoberta de medicamentos para o tratamento de doenças hepáticas¹⁰. Por fim, também têm potencial para serem utilizados clinicamente, sabendo que as doenças hepáticas agudas têm uma taxa de mortalidade de quase 80%, os esferoides hepáticos e/ou hepáticos bioartificiais poderiam potencialmente resgatar esses pacientes, fornecendo função hepática parcial até que um doador adequado possa ser encontrado¹¹.

Estabelecemos um protocolo para a geração de esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) para preparar esferoides de tamanhos diferentes contendo 4000 a 1 x 10⁶ células e analisá-los por meio de microscopia de luz e imunofluorescência. Também testamos a capacidade da função específica dos hepatócitos, avaliando a expressão das enzimas do citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) pertencentes à família do citocromo P450 que têm papéis importantes no metabolismo celular e de drogas através do processo de desintoxicação¹².

Protocolo

Obteve-se aprovação ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para a realização desses experimentos e o termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado por todos os doadores antes da extração do sangue, em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Preparação de células mononucleares (MNCs) a partir do sangue periférico humano (PB)

1. Extraia 30 mL de sangue de doadores saudáveis com a ajuda de pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.
2. Isolar PBMNCs utilizando meios de gradiente de densidade de acordo com o protocolo publicado por Becker-Kojić et ^al.13. Isolar, por pipetagem, a camada interfásica entre o plasma e os meios de gradiente de densidade e usar solução salina tampão fosfato estéril (PBS) para lavar as células isoladas.
3. Use uma câmara de contagem e conte o número de células usando métodos padrão.

2. Desdiferenciação das multins após a ativação com glicoproteína humana ancorada no GPI

1. Colocar 6 x 10⁶ células mononucleares em PBS/1% de albumina sérica bovina (BSA) em tubo de poliestireno (15 mL) e incubar com o anticorpo específico por 30 min a 37 °C de acordo com Becker-Kojić et ^al.13.
2. Centrifugar as células a 300 x g à temperatura ambiente e substituir PBS/BSA pelo meio Dulbecco modificado de Iscove suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
3. Cultivar as células em tubos de poliestireno de 15 mL em incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C por 8-10 dias, conforme descrito em Becker-Kojić et ^al.13. No dia 5 (D5), adicione 1-2 mL de meio de Iscove suplementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.

3. Classificação de células desdiferenciadas recém-geradas

1. Centrífuga de suspensão celular cultivada à temperatura ambiente por 10 min a 300 x g e aspirar com pipeta estéril o sobrenadante resultante de acordo com Becker-Kojić et ^al.13.
2. Ressuspender o pellet obtido por centrifugação em 90 μL de tampão PBS frio (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA e EDTA 2 mM) e adicionar 10 μL de esferas magnéticas de tamanho nanométrico CD45 positivo e incubar no gelo por 15 min.
3. Lavar a suspensão celular com 2 ml de tampão PBS, centrifugar-a a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e adicionar 500 μL de tampão PBS às células e ressuspender completamente.
4. Pipetar 500 μL de tampão PBS pré-resfriado na coluna para lavá-lo e colocá-lo no campo magnético usando um suporte magnético.
5. Lavar as células colocadas na coluna, duas vezes com 500 μL de tampão PBS e recolher o fluxo contendo células CD45 negativas no meio de Iscove suplementado com 10% de FBS.
6. Use uma câmara de contagem para determinar o número de células reprogramadas.

4. Preparação de coberturas de vidro para a geração de hepatócitos humanos

1. Separe as tampas de vidro (14 mm) e incube-as em detergente não iônico por 10 min. Lavar as lâminas de vidro em água deionizada até que não restem bolhas e incubá-las em HCl 1M por 30 min (adaptado de Marchenko et ^al.14).
2. Lave as tampas de vidro com água deionizada pelo menos 3x e seque-as durante a noite à temperatura ambiente. Tampas de vidro secas em autoclave em um recipiente adequado.

5. Revestimento de placas de cultura celular com biolaminina para diferenciação hepática 2D de BD-PSCs

1. Coloque as tampas de vidro autoclavadas com um par estéril de pinças em 4 placas de poço e acenda as luzes UV por 30 minutos para garantir condições estéreis.
2. Descongele as alíquotas de biolaminina e adicione 120 μL de 5 μg/mL de biolaminina a cada folha de tampa de vidro. Deixar as tampas de vidro revestidas durante a noite a 4 °C.
3. Remova o excesso de biolaminina e adicione 200 μL de meio de diferenciação de hepatócitos, conforme descrito abaixo.

6. Preparação dos meios de diferenciação dos hepatócitos

1. Fazer 500 mL de meio de reposição sérica knockout de hepatoblasto (KSR)/dimetilsulfóxido (DMSO) consistindo de 76,4% de DMEM KNOCKOUT (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 0,1% de β-mercaptoetanol, 1% de DMSO e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strepto).
2. Preparar 500 mL de meio de maturação de hepatócitos contendo 1% de L-glutamina, 10 μM de sal de sódio de hidrocortisona 21-hemisuccinato (CHC) e 1% de Pen/Strep.
3. Aliquotar o meio do estoque e adicionar fator de crescimento de hepatócitos frescos (HGF) e oncostatina M (OSM) em concentrações finais de 10 ng/mL e/ou 20 ng/mL para cada mudança de meio.
   NOTA: A oncostatina M é uma citocina pertencente ao grupo de citocinas interleucina 6, importante para a hematopoiese, bem como para o desenvolvimento hepático.

7. Cultivo de células hepáticas diferenciadas de BD-PSCs

1. Coloque 3 x 10⁵ células BD-PSCS em cada poço de uma placa de 4 poços revestida com biolaminina.
2. Colocar as placas de 4 poços na incubadora a 37 °C e a 5% de CO₂. Cultive as células por 5 dias em meio hepatoblástico KSR/DMSO que suporta a diferenciação endodérmica e altere o meio a cada dois dias.
3. Mudar para o meio de maturação dos hepatócitos no dia 5 e cultivar as células durante mais 7-10 dias na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂. Mude o meio a cada 48 h.

8.3D diferenciação hepática esferoide

1. Conte células usando uma câmara de contagem.
2. Centrífuga de suspensão de células desdiferenciadas BD a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células BD-desdiferenciadas em meio KSR/DMSO a 2 x 10⁶ células/mL.
3. Passe as células através de um filtro celular de 40 μm para garantir uma suspensão de célula única e remover quaisquer detritos adicionais.
4. Conte as células usando uma câmara de contagem e prepare um volume suficiente para cada densidade de semeadura celular, a fim de dispensar o volume necessário por poço. Prepare um gradiente com semeadura superior de 1 x 10⁶ células para uma baixa densidade de semeadura de 4000 células.
5. Dispensar 100 μL de meio KSR/DMSO em 96 placas de fixação bem baixas e adicionar 100 μL de diluição de semeadura celular.
6. Coloque a placa de fixação baixa na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ e cultive-a por 5 dias.
7. Altere 50% do meio dos dias 3-4 após a semeadura, quando os esferoides estiverem suficientemente compactos.
8. No dia 5, mude o meio para o meio de maturação dos hepatócitos e cultive as células por mais 7-10 dias para uma maturação adicional. Mude o meio a cada dois dias.

9. Análise de imunofluorescência de culturas de células hepáticas 2D recém-geradas

1. Cultive as células de acordo com o método de diferenciação descrito acima por 4, 8, 15 e 24 dias e remova os meios.
2. Incubar células com fixador pré-aquecido constituído por paraformaldeído a 4% em PBS por 10 min. Descarte o fixador e lave as células 2x com PBS por 5 min cada. Adicione imediatamente a solução de tritão X-100 a 0,1% e permeabilize as células por 5 min. Lave 2x com PBS.
3. Adicione a solução de bloqueio feita de PBS e BSA a 5% e coloque na placa do balancim por 1 h à temperatura ambiente.
4. Diluir anticorpos primários em tampão de diluição 1% BSA/PBS da seguinte forma: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteína (AFP) 1:250, citoqueratina 18 (CK18) 1:50, fator nuclear de hepatócitos 4 alfa (HNF4α) 1:1000 e transtirretina (TTR) 1:50. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço.
5. Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, descarte a solução de anticorpos, lave as células por 5 minutos e repita a etapa de lavagem 3x.
6. Prepare os seguintes anticorpos secundários em tampão de diluição: IgG anti-frango de coelho (vermelho Texas) 1:1000, IgG anti-rato de cabra (488) 1:1000 e anti-coelho de cabra (488) 1:500. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço e incube as células por 30 minutos à temperatura ambiente.
7. Lave as células 3x com PBS por 5 min cada e monte as tampas com meios de montagem contendo DAPI para análise microscópica.

10. Coloração viva de esferoides hepáticos recém-formados

1. Descarte cuidadosamente os meios de cultura sem tocar nos esferoides, adicione PBS recém-feito com solução de tritão X-100 a 0,1% e incube por 5 minutos para permeabilizar as células.
2. Lave os esferoides com o meio pipetando lentamente por 5 min, repita 2x.
3. Incubar os esferoides com os anticorpos primários ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) e CYP3A4 (1:200) preparados em PBS com 1% de BSA por 1 h em 5% de CO₂ incubadora a 37 °C. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço.
4. Remova cuidadosamente o excesso de solução de anticorpos e lave os esferoides com meio 3x.
5. Preparar os anticorpos secundários correspondentes IgG anti-rato de cabra (Cy3), IgG de cabra anti-rato (488) e IgG de coelho anti-frango (Texas red) numa diluição de 1:1000 e 1:500 para cabra anti-coelho (488) em PBS em 1% de BSA. Utilizar 50 μL de diluição de anticorpos por alvéolo e incubar durante 20 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
6. Lave cuidadosamente 3x com meio e deixe a placa por 30 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ antes de realizar a microscopia de fluorescência.

11. Exame de esferoides usando um microscópio de fluorescência

1. Ligue a fonte de luz de fluorescência 10 minutos antes do uso, ligue o computador e abra o software de imagem.
2. Use um objetivo com ampliação de 4x, clique no botão 4x na barra de ferramentas para selecionar a barra de escala correta e, em seguida, coloque a placa de 96 poços na placa central do palco.
3. Ligue a fonte de luz LED, use o filtro de campo brilhante e posicione a placa no poço de interesse usando o botão de ajuste de estágio do eixo x-y.
4. Mude para o caminho da luz da câmera, clique no botão Viva no software de imagem para visualizar a imagem na tela e verifique se o esferoide está centralizado usando os botões do eixo x-y e o foco usando o botão de foco grosso/fino.
   NOTA: A forma dos esferoides permanece constante após a aplicação de coloração ao vivo.
5. Escolha o método de Observação de campo brilhante na barra de ferramentas, coloque as configurações de exposição como automáticas e clique no botão Instantâneo no painel de controle da câmera para tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como arquivo .vsi usando o nome apropriado na pasta de interesse.
6. Coloque a placa de proteção da luz ambiente para desligar a luz LED, mude para filtrar a excitação B, escolha o método de observação 488 na barra de ferramentas, abra o obturador, tire uma foto clicando no botão Instantâneo, feche o obturador e salve o arquivo conforme descrito acima.
7. Repita isso com um filtro para excitação G usando o método de observação apropriado (vermelho Texas ou CY3). Em seguida, reitere todo o procedimento para cada poço de interesse.
8. Devolver a placa à incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C e cultivá-la conforme descrito acima.

Resultados

Diferenciamos com sucesso as BD-PSCs humanas em células progenitoras endodérmicas/hepáticas e hepatócitos aplicando um protocolo de duas etapas. As alterações morfológicas durante o processo de diferenciação hepática são mostradas na Figura 1. Os BD-PSCs se diferenciam em hepatócitos que passam por três estágios diferentes. O primeiro estágio representa a diferenciação em células endodérmicas L4, o segundo, a diferenciação em células progenitoras hepáticas (hepatoblast...

Discussão

O fígado é um órgão importante no corpo humano com muitas funções biológicas essenciais, como a desintoxicação de metabólitos. Devido a falhas hepáticas graves, como cirrose e / ou hepatite viral, há quase 2 milhões de mortes por ano em todo o mundo. Os transplantes hepáticos ocupam o segundo lugar em transplantes de órgãos sólidos em todo o mundo, mas apenas cerca de 10% da necessidade atual é atendida²².

Hepatócitos humanos primários (PHH) são fre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%