Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени

Резюме

Здесь мы представляем негенетический метод получения аутологичных сфероидов печени человека с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из стационарной периферической крови.

Аннотация

Клетки печени человека могут образовывать трехмерную (3D) структуру, способную расти в культуре в течение нескольких недель, сохраняя свою функциональную способность. Из-за своей природы группироваться в культуральных чашках с низкими или отсутствующими адгезионными характеристиками они образуют агрегаты из нескольких клеток печени, которые называются сфероидами печени человека. Формирование 3D-сфероидов печени зависит от естественной склонности печеночных клеток к агрегации в отсутствие адгезивного субстрата. Эти 3D-структуры обладают лучшими физиологическими реакциями, чем клетки, которые ближе к среде in vivo . Использование 3D-культур гепатоцитов имеет множество преимуществ по сравнению с классическими двумерными (2D) культурами, включая более биологически значимое микроокружение, архитектурную морфологию, которая воссобирает естественные органы, а также лучшее прогнозирование состояния болезни и реакций in vivo на лекарства. Для получения сфероидов могут использоваться различные источники, такие как первичная ткань печени или иммортализированные клеточные линии. 3D-ткань печени также может быть сконструирована с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) для получения гепатоцитов. Мы получили сфероиды печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), полученных из необработанной периферической крови путем активации связанного с мембраной GPI-связанного белка человека и дифференцированного в гепатоциты человека. Клетки печени человека, полученные из BD-PSCs, и сфероиды печени человека были проанализированы с помощью световой микроскопии и иммунофенотипирования с использованием маркеров гепатоцитов человека.

Введение

В последние годы трехмерные (3D) системы культивирования сфероидов стали важным инструментом для изучения различных областей исследований рака, открытия лекарств и токсикологии. Такие культуры вызывают большой интерес, поскольку они устраняют разрыв между двумерными (2D) монослоями клеточных культур и сложными органами¹.

При отсутствии адгезивной поверхности, по сравнению с 2D-культурой клеток, образование сфероидов основано на естественном сродстве этих клеток к кластеризации в 3D-форме. Эти клетки организуются в группы, состоящие из одного или нескольких типов зрелых клеток. Свободные от чужеродных материалов, эти клетки взаимодействуют друг с другом, как в своем первоначальном микроокружении. Клетки в 3D-культуре намного ближе и имеют правильную ориентацию друг к другу, с более высокой продукцией внеклеточного матрикса, чем в 2D-культурах, и представляют собой близкую к естественной среду ².

Модели на животных уже давно используются для изучения биологии и болезней человека³. В связи с этим существуют внутренние различия между людьми и животными, что делает эти модели не совсем пригодными для экстраполятивных исследований. Сфероиды и органоиды 3D-культур представляют собой многообещающий инструмент для изучения тканеподобной архитектуры, взаимодействия и перекрестных помех между различными типами клеток, которые происходят in vivo и могут способствовать уменьшению или даже замене моделей животных. Они представляют особый интерес для изучения патогенеза заболеваний печени, а также платформ скрининга лекарств⁴.

3D-сфероидная культура имеет особое значение для исследований рака, поскольку она может устранить разрыв между клетками и их окружением, уменьшая потребность в трипсинизации или лечении коллагеназой, необходимой для подготовки монослоев опухолевых клеток к 2D-культурам. Опухолевые сфероиды позволяют изучать, как нормальные и злокачественные клетки получают и реагируют на сигналы из своего окружения⁵ , и являются важной частью исследований биологии опухолей.

По сравнению с монослоем 3D-культуры, состоящие из различных типов клеток, по своим структурным и функциональным свойствам напоминают опухолевые ткани и поэтому подходят для изучения метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Вот почему такие сфероидные модели способствуют ускорению исследований рака⁶.

Сфероиды также помогают разрабатывать технологию создания органоидов человека, потому что биология тканей и органов очень сложна для изучения, особенно у людей. Прогресс в культивировании стволовых клеток позволяет разрабатывать 3D-культуры, такие как органоиды, состоящие из стволовых клеток и тканевых предшественников, а также различные типы зрелых (тканевых) клеток из органа с некоторыми функциональными характеристиками, такими как реальный орган, которые могут быть использованы для моделирования развития органов, заболеваний, но их также можно считать полезными в регенеративной медицине⁷.

Первичные гепатоциты человека обычно используются для изучения in vitro биологии гепатоцитов человека, функции печени и лекарственно-индуцированной токсичности. Культуры гепатоцитов человека имеют два основных недостатка, во-первых, ограниченную доступность первичной ткани, такой как гепатоциты человека, и, во-вторых, склонность гепатоцитов к быстрой дедифференцировке в 2D-культуре, тем самым теряя свою специфическую функцию гепатоцитов⁸. 3D-культуры печени превосходят в этом отношении и недавно были изготовлены из дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)⁹. Биоинженерные печеночные 3D-сфероиды представляют особый интерес для изучения развития, токсичности, генетических и инфекционных заболеваний печени, а также при открытии лекарств для лечения заболеваний печени¹⁰. Наконец, они также могут быть использованы клинически, зная, что острые заболевания печени имеют уровень смертности почти 80%, биоискусственная печень и / или сфероиды печени потенциально могут спасти этих пациентов, обеспечивая частичную функцию печени до тех пор, пока не будет найден подходящий донор¹¹.

Мы разработали протокол генерации сфероидов печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), для получения сфероидов разного размера, содержащих от 4000 до 1 x 10⁶ клеток, и проанализировали их с помощью световой микроскопии и иммунофлуоресценции. Мы также проверили способность гепатоцит-специфической функции, оценив экспрессию ферментов цитохрома P450 3A4 (CYP3A4) и 2E1 (CYP2E1), принадлежащих к семейству цитохрома P450, которые играют важную роль в клеточном и лекарственном метаболизме в процессе детоксикации¹².

протокол

Было получено этическое одобрение (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) для проведения этих экспериментов, и информированное согласие было подписано всеми донорами перед извлечением крови в соответствии с руководящими принципами учреждения.

1. Получение мононуклеарных клеток (ТНК) из периферической крови человека (ПБ)

1. Извлеките 30 мл крови от здоровых доноров с помощью обученного медицинского персонала по стандартному протоколу.
2. Изолируйте PBMNC с использованием сред с градиентом плотности в соответствии с протоколом, опубликованным Becker-Kojić et ^al.13. Изолируют с помощью пипетки межфазный слой между плазмой и средой с градиентом плотности и используют стерильный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) для промывки изолированных клеток.
3. Используйте счетную камеру и подсчитайте количество ячеек стандартными методами.

2. Дедифференцировка МНК при активации гликопротеином, закрепленным на GPI человека

1. Поместите 6 x 10⁶ мононуклеарных клеток в PBS / 1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в полистирольную пробирку (15 мл) и инкубируйте со специфическим антителом в течение 30 мин при 37 ° C в соответствии с Becker-Kojić et ^al.13.
2. Центрифугируйте клетки при 300 x g при комнатной температуре и замените PBS/BSA модифицированной средой Дульбекко от Iscove, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS).
3. Выращивайте клетки в полистирольных пробирках объемом 15 мл в инкубаторе с 5% CO₂ при 37 ° C в течение 8-10 дней, как описано в Becker-Kojić et ^al.13. На 5-й день (D5) добавьте 1-2 мл среды Iscove с добавлением 10% FBS в каждую пробирку объемом 15 мл.

3. Сортировка вновь образованных дедифференцированных клеток

1. Центрифугу культивируют клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 10 мин при 300 х г и аспирируют стерильной пипеткой полученную надосадочную жидкость по Becker-Kojić et ^al.13.
2. Ресуспендируют гранулы, полученные центрифугированием, в 90 мкл холодного буфера PBS (рН PBS 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) и добавляют 10 мкл положительных наноразмерных магнитных шариков CD45 и инкубируют на льду в течение 15 мин.
3. Промойте клеточную суспензию 2 мл буфера PBS, центрифугируйте ее при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, добавьте 500 мкл буфера PBS в клетки и тщательно ресуспендируют.
4. Пипетка 500 мкл предварительно охлажденного буфера PBS в колонку для промывки и поместить ее в магнитное поле с помощью магнитной подставки.
5. Промойте клетки, помещенные на колонку, дважды 500 мкл буфера PBS и соберите проточные клетки, содержащие отрицательные клетки CD45, в среду Iscove, дополненную 10% FBS.
6. Используйте счетную камеру для определения количества перепрограммированных ячеек.

4. Подготовка стеклянных покровных листов для генерации гепатоцитов человека

1. Отделите стеклянные покровные стекла (14 мм) и инкубируйте их в неионогенном моющем средстве в течение 10 минут. Промойте стекла в деионизированной воде до тех пор, пока не останется пузырьков, и инкубируйте их в 1M HCl в течение 30 минут (адаптировано из Marchenko et ^al.14).
2. Вымойте стеклянные покровные стекла деионизированной водой не менее 3 раз и высушите их в течение ночи при комнатной температуре. В автоклаве высушите стеклянные покровные стекла в подходящей таре.

5. Покрытие планшетов для клеточных культур биоламинином для 2D-дифференцировки печени BD-PSC

1. Поместите автоклавные стеклянные покровные стекла стерильным пинцетом в 4-луночные пластины и включите ультрафиолетовое излучение на 30 минут, чтобы обеспечить стерильные условия.
2. Разморозьте аликвоты биоламинина и добавьте 120 мкл 5 мкг/мл биоламинина в каждый стакан. Оставьте покровные стекла с покрытием на ночь при температуре 4 °C.
3. Удалите избыток биоламинина и добавьте 200 мкл среды для дифференцировки гепатоцитов, как описано ниже.

6. Приготовление сред для дифференцировки гепатоцитов

1. Сделайте 500 мл среды для замены сыворотки с нокаутом гепатобласта (KSR)/диметилсульфоксида (ДМСО), состоящей из 76,4% нокаута DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-глютамина, 1% заменимых аминокислот (NEAA), 0,1% β-меркаптоэтанола, 1% DMSO и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Streptoring).
2. Приготовьте 500 мл среды для созревания гепатоцитов, содержащей 1% L-глютамина, 10 мкМ гидрокортизона-21-гемисукцината натриевой соли (ГЦК) и 1% Pen/Strep.
3. Аликвотируйте среду из запаса и добавляйте свежий фактор роста гепатоцитов (HGF) и онкостатин М (OSM) в конечных концентрациях 10 нг/мл и/или 20 нг/мл для каждой смены среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Онкостатин М представляет собой цитокин, принадлежащий к группе цитокинов интерлейкина 6, важный для кроветворения, а также для развития печени.

7. Культивирование печеночных клеток, дифференцированных из BD-PSC

1. Поместите 3 x 10⁵ клеток BD-PSCS в каждую лунку 4-луночной пластины, покрытой биоламинином.
2. Поместите 4-луночные планшеты в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO₂. Культивируйте клетки в течение 5 дней в среде гепатобласта KSR/DMSO, которая поддерживает энтодермальную дифференцировку, и меняйте среду через день.
3. Переключитесь на среду для созревания гепатоцитов на 5-й день и культивируйте клетки еще 7-10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Меняйте среду каждые 48 ч.

8.3D сфероидная дифференцировка печени

1. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры.
2. Центрифуга BD-дедифференцированная клеточная суспензия в 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать BD-дедифференцированные клетки в среде KSR/DMSO в дозе 2 x 10⁶ клеток/мл.
3. Пропустите клетки через сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы обеспечить суспензию одной ячейки и удалить дополнительный мусор.
4. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры и подготовьте достаточный объем для каждой ячейки плотности посева, чтобы распределить необходимый объем на лунку. Подготовьте градиент с верхним посевом 1 x 10 6 ячеек до низкой плотности посева 4000^ячеек .
5. Распределите 100 мкл среды KSR/DMSO в 96 пластинах с низкой посадкой и добавьте 100 мкл разбавления ячеек.
6. Поместите пластину с низкой насадкой в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO₂ и культивируйте их в течение 5 дней.
7. Меняйте 50% среды с 3-4 дня после посева, когда сфероиды достаточно уплотняются.
8. На 5-й день смените среду на среду созревания гепатоцитов и культивируйте клетки еще 7-10 дней для дальнейшего созревания. Меняйте носитель через день.

9. Иммунофлуоресцентный анализ вновь генерируемых 2D-культур клеток печени

1. Культивируют клетки в соответствии с описанным выше методом дифференцировки в течение 4, 8, 15 и 24 дней и удаляют среду.
2. Инкубируют клетки с предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 4% параформальдегида, в PBS в течение 10 мин. Откажитесь от фиксатора и промойте клетки 2 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая. Немедленно добавьте 0,1% раствор тритона X-100 и проведите в клетках 5 мин. Стирайте 2 раза с помощью PBS.
3. Добавьте блокирующий раствор из ПБС и 5% БСА и поместите на коромысло на 1 час при комнатной температуре.
4. Разбавляют первичные антитела в буфере разбавления 1% BSA/PBS следующим образом: альбумин (ALB) 1:50, альфа-1-фетопротеин (AFP) 1:250, цитокератин 18 (CK18) 1:50, ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа (HNF4α) 1:1000 и транстиретин (TTR) 1:50. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
5. Инкубируют клетки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем выбросьте раствор антител, промойте клетки в течение 5 минут и повторите шаг промывки 3 раза.
6. Приготовьте следующие вторичные антитела в буфере для разведения: кролик против куриного IgG (техасский красный) 1:1000, козий антимышиный IgG (488) 1:1000 и козий антикролик (488) 1:500. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте клетки в течение 30 минут при комнатной температуре.
7. Промойте ячейки 3 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая и установите покровные стекла с монтажными носителями, содержащими DAPI, для микроскопического анализа.

10. Живое окрашивание новообразованных сфероидов печени

1. Осторожно выбросьте питательные среды, не касаясь сфероидов, добавьте свежеприготовленный PBS с 0,1% раствором тритона X-100 и инкубируйте в течение 5 минут, чтобы проникнуть в клетки.
2. Промойте сфероиды средством, медленно пипетируя в течение 5 минут, повторите 2 раза.
3. Инкубируют сфероиды с первичными антителами ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) и CYP3A4 (1:200), приготовленными в PBS с 1% BSA в течение 1 ч в 5%_CO2 инкубаторе при 37 °C. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
4. Тщательно удалите излишки раствора антител и промойте сфероиды средой 3х.
5. Приготовьте соответствующие вторичные антитела козьего антимышиного IgG (Cy3), козьего антимышиного IgG (488) и кролика антикуриного IgG (техасский красный) в разведении 1:1000 и 1:500 для козьего антикролика (488) в PBS в 1% BSA. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте в течение 20 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂.
6. Тщательно промойте 3 раза средой и оставьте планшет на 30 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ перед проведением флуоресцентной микроскопии.

11. Исследование сфероидов с помощью флуоресцентного микроскопа

1. Включите источник флуоресцентного света за 10 минут до использования, включите компьютер и откройте программное обеспечение для обработки изображений.
2. Используйте объектив с 4-кратным увеличением, нажмите кнопку 4x на панели инструментов, чтобы выбрать правильную масштабную линейку, затем поместите 96-луночную пластину на центральную пластину сцены.
3. Включите светодиодный источник света, используйте фильтр светлого поля и поместите пластину в интересующий колодец с помощью ручки регулировки ступени по оси x-y.
4. Измените путь освещения камеры, нажмите кнопку Live in Программное обеспечение для обработки изображений, чтобы визуализировать изображение на экране, и убедитесь, что сфероид центрирован с помощью ручек оси X-Y, и сфокусируйтесь с помощью ручки грубой/точной фокусировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Форма сфероидов остается постоянной после нанесения живого окрашивания.
5. Выберите метод наблюдения за светлым полем на панели инструментов, установите автоматические настройки экспозиции и нажмите кнопку «Снимок» на панели управления камерой, чтобы сделать снимок . Затем сохраните картинку в виде файла .vsi, используя соответствующее имя в интересующей папке.
6. Поместите экранирующую пластину окружающего света, чтобы выключить светодиодную подсветку, переключитесь на фильтр для B-возбуждения, выберите метод наблюдения 488 на панели инструментов, откройте затвор, сделайте снимок, нажав кнопку «Снимок», закройте затвор, затем сохраните файл, как описано выше.
7. Повторите это с фильтром для G-возбуждения, используя соответствующий метод наблюдения (техасский красный или CY3). Затем повторите всю процедуру для каждой интересующей скважины.
8. Верните планшет в инкубатор с 5% CO₂ при 37 ° C и культивируйте его, как описано выше.

Результаты

Мы успешно дифференцировали BD-PSC человека в клетки-предшественники энтодермы / печени и гепатоциты, применяя двухэтапный протокол. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показаны на рисунке 1. BD-PSC дифференцируются в гепатоциты, проходящие три разл...

Обсуждение

Печень является основным органом в организме человека со многими важными биологическими функциями, такими как детоксикация метаболитов. Из-за тяжелой печеночной недостаточности, такой как цирроз печени и/или вирусный гепатит, во всем мире ежегодно умирает около 2 миллионов человек. Тр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%