Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Resumo

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Resumo

A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.

Introdução

A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares¹. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato². Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca ^2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.

As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação ^4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso⁷. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos⁸. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.

Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios⁹. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins^10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica¹². Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.

Protocolo

O trabalho in vivo foi aprovado e supervisionado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida e em conformidade com as diretrizes atuais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Para este protocolo, o procedimento não difere dependendo da tensão, peso, idade e sexo do rato. O tipo de calcificação que está sendo estudada, dietas e tratamentos podem alterar a duração do estudo e o peso do camundongo usado e podem ser dependentes de uma cepa específica e do sexo do camundongo usado no estudo. Para este protocolo, foram utilizados camundongos C57BL/6J machos e fêmeas, que foram alimentados com uma dieta de calcificação. Os ratos foram sacrificados entre 20 semanas e 24 semanas de idade.

1. Isolamento e excisão da aorta

1. Marcadores fluorescentes
   1. Quarenta e oito horas antes da eutanásia, injetar os ratos com 20 μM OsteoSense 680, um agente de imagem fluorescente, na dose recomendada de 100 μL por 25 g através de uma injeção intravenosa.
   2. Sob o exaustor, coloque uma placa de isopor com quatro pinos-t, um balde forrado com uma toalha de papel, um tubo de 50 mL recheado com uma toalha de papel, um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, ferramentas de dissecação (consulte a Tabela de Materiais) e etanol em um frasco de spray. Coloque copos com PBS no gelo.
2. Coleta de sangue
   1. Adicione 2 mL de isoflurano em um tubo cônico de 50 mL recheado com o papel toalha. Coloque o tubo no balde e feche-o com a tampa.
      CUIDADO: O isoflurano deve ser manuseado em um espaço bem ventilado sem recirculação do ar de exaustão devido à toxicidade da exposição a curto prazo.
   2. Transfira um mouse para o bucket de cada vez. Uma vez sedado, coloque o rato sobre o papel toalha na posição dorsal. Segurando o mouse com a palma da mão não dominante, coloque as orelhas para trás usando o polegar e o dedo indicador.
   3. Usando a pinça, extirpe um dos olhos. Segure o rato acima do tubo de 1,5 ml para iniciar a colheita de sangue, durante o qual 1 ml de sangue deve ser recolhido. Quando o sangue parar de escorrer, coloque o rato de volta no balde para uma sedação adicional.
3. Eutanásia
   1. Coloque uma toalha de papel no tapete de dissecação. Uma vez que o rato esteja sedado, coloque-o no tapete em posição supina. Prenda o rato na posição supina usando um pino t para segurar cada membro.
   2. Pulverize o abdômen do rato com álcool. Usando a pinça, levante a pele na região do peito. Com a tesoura, corte a linha medial na cavidade torácica. Uma vez que o esterno tenha sido cortado no centro, corte o diafragma em ambos os lados da caixa torácica.
   3. Se necessário, corte a porção frontal da caixa torácica para expor o coração e os pulmões.
4. Remoção de órgãos
   1. Usando pinças, levante a pele e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Remova os órgãos reprodutivos e a bexiga, bem como qualquer gordura fora da linha média.
   2. Mova os órgãos gastrointestinais (GI) para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago.
   3. Excise os rins, levantando-os para longe da linha média. Corte o mais próximo possível do rim.
   4. Em seguida, comece a remoção do fígado, levantando os lóbulos e cortando a linha média.
   5. Perfundir o coração e a aorta. Usando uma seringa de 10 mL, injete PBS frio no ventrículo direito. Espere os pulmões inflarem e ficarem brancos. Remova os pulmões, bem como qualquer excesso de diafragma ou caixa torácica.
5. Remoção óssea
   1. Abra uma tesoura larga e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda. Corte para baixo e comece a levantar a coluna da pele. Remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Se estiver transportando para um estereoscópio, coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo.
   2. Mova a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação. Encha com PBS gelado. Prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas.
   3. Sob o microscópio de dissecção, use pinças para levantar o coração com cuidado e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido. Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho.
6. Microdissecção
   1. A partir da área logo abaixo do coração, identifique as três estruturas tubulares: esôfago, veia cava e aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.
   2. Usando a pinça de microdissecção e a tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Certifique-se de não cortar a aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta, bem como as artérias femorais estejam expostas.
   3. No coração, remova todo o tecido adiposo, expondo os três ramos no arco aórtico. Remova a raiz aórtica do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta.
   4. Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular.
   5. Use o script MATLAB personalizado (Arquivo Suplementar 1) para quantificar o sinal total do marcador de cálcio, que é normalizado para a área total da aorta digitalizada. O script MATLAB funciona usando o suplemento Bioinformática toolbox. O MATLAB é primeiro direcionado para o local dos arquivos TIFF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, os arquivos individuais são abertos e os valores de intensidade de pixel são extraídos dos arquivos TIFF.
      1. Uma vez que a imagem é apresentada ao usuário com um mapa de cores, selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima.
      2. Quando o MATLAB perguntar "Quantos espécimes estão na imagem?" na janela de comando, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma. Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará uma imagem binária com uma máscara da área total da aorta e outra imagem binária com uma máscara da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada.
      3. Para selecionar uma aorta, faça uma caixa ao redor da aorta de interesse na figura mais recente na tela, selecionando quatro cantos com um clique esquerdo e criando uma caixa ao redor da imagem. Para fechar a caixa, clique duas vezes no primeiro canto.
         NOTA: O limiar pode ser diferente dependendo do modelo de calcificação utilizado. Cabe ao usuário determinar qual valor determina um sinal positivo para a calcificação vascular. Uma vez que o limite é definido para um experimento, ele deve permanecer o mesmo durante toda a duração do experimento.
   6. Uma vez extraídos os dados quantitativos, realize-se uma ANOVA one-way com o teste post-hoc de Tukey para mostrar significância entre os grupos.

2. Isolar e extrair EVs das aortas

NOTA: Uma vez que as aortas tenham sido isoladas e removidas, os EVs podem ser extraídos do tecido. Usando uma solução digestiva e múltiplos ciclos de centrífuga, os EVs podem ser coletados e utilizados para muitas técnicas diferentes, incluindo ensaios de calcificação, eletroforese em gel e immunoblotting¹³. O protocolo para isolar e extrair EVs é o seguinte:

1. Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.
2. Preparar uma solução digestiva contendo 0,25 M de sacarose, 0,12 M de cloreto de sódio (NaCl), 0,01 M de cloreto de potássio (KCl), 0,02 M de cloridrato de Tris e 600 U/mL de colagenase¹³.
3. Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mL de solução digestiva por 2 h a 37 °C. Colete a solução. Centrifugar a solução a 1.000 × g durante 15 minutos para remover os detritos celulares.
4. Centrifugar o sobrenadante por mais 30 min a 33.000 × g para remover microvesículas. Recolher e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação (ver secção 3).
   NOTA: Siga os passos subsequentes se a eletroforese em gel e a imunoblotting proteica dos EVs devem ser realizadas.
5. Ultracentrífuga do sobrenadante a 100.000 × g por 1 h para isolar os EVs de interesse.
6. Enquanto o sobrenadante estiver em fase de ultracentrifugação, prepare a lise do RIPA e o tampão de extração (consulte a Tabela de Materiais) adicionando o inibidor da protease e o vórtice até dissolver.
7. Uma vez que a ultracentrifugação esteja completa, aspirar o sobrenadante, deixando o pellet, que contém os EVs. Suspender o pellet na mistura preparada de lise RIPA e inibidor de protease. As amostras estão prontas para eletroforese em gel e western blotting.

3. Avaliação do potencial de calcificação de vesículas extracelulares com absorbância de dispersão de luz

NOTA: Para medir a formação mineral em tempo real de EVs, utilizamos um ensaio originalmente desenvolvido para estudar a formação mineral a partir de EVs de cartilagem de placa de crescimento a partir de cultura celular¹⁴. Como a deposição de fosfato de cálcio é a marca registrada da calcificação, um aumento na absorvância de dispersão de luz como resultado da formação de compostos de fosfato de cálcio é indicativo do potencial de calcificação¹⁴. In vitro Os modelos VSMC são convenientes para medir o potencial de calcificação dos VEs. Nesta técnica, um leitor de placas com um filtro de comprimento de onda curto pode quantificar a calcificação in vitro de EVs. A leitura da absorvência é registrada a 340 nm, e uma maior absorvância é indicativa de mais formação mineral de fosfato de cálcio. O protocolo para o ensaio de absorbância de dispersão de luz é o seguinte:

1. Centrifugar o meio condicionado coletado de VSMCs a 1.000 × g por 5 min para remover detritos celulares¹⁴.
2. Centrifugar o sobrenadante a 33.000 × g por 30 min, coletar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo.
   NOTA: A presença de EVs no sobrenadante coletado pode ser confirmada através de espalhamento dinâmico de luz (DLS) ou análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
3. Preparar uma solução estéril de fosfato de sódio monobásico (NaH₂PO₄) a 300 mM. Filtre a solução para garantir condições estéreis, se necessário.
4. Adicione 1% (v/v) de 300 mM de NaH₂PO₄ às amostras de EV e pipete suavemente a solução para misturar bem. Transferir 200 μL da solução de mistura para uma placa de 96 poços. Incubar a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 °C.
5. Ajuste o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nm a cada 1 min.

4. Avaliação da formação mineral de calcificação de vesículas extracelulares com hidrogéis de colágeno

NOTA: A agregação de EVs e a formação de microcalcificações são observadas através de hidrogéis de colágeno. Esses hidrogéis atuam como um andaime que imita a densidade de colágeno observada in vivo¹⁵. Isso demonstra o efeito do colágeno no crescimento da calcificação. O protocolo para avaliar a formação mineral de EVs em hidrogéis é o seguinte:

1. Dia 1
   1. Preparar uma solução de colagénio de 2,5 mg/ml em DMEM. Adicione lentamente hidróxido de sódio 5 M à mistura de colagénio/DMEM até que a cor mude para vermelho. Verifique se o pH da solução é de aproximadamente 7.
      Observação : se a solução ficar roxa e se tornar muito básica, reinicie o processo.
   2. Pipetar 300 μL da solução de colagénio de 2,5 mg/ml com um pH de 7 para cada poço de um vidro de câmara de 8 poços. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ de humidade controlada durante 72 h.
2. Dia 4
   1. Adicione 300 μL de DMEM como controle nos poços.
   2. Adicionar 300 μL das amostras médias EV coletadas previamente aos poços restantes.
   3. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ de humidade controlada durante 6 dias.
3. Dia 10
   1. Preparar 2,5 μL de Osteosense 680EX com 22,5 μL de DMEM.
   2. Pipeta de 2,5 μL da mistura de Osteosense e DMEM em cada poço. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ de humidade controlada durante 24 h.
4. Dia 11
   1. Imagem dos hidrogéis com filtros apropriados para fluorescência Osteosense. Imagine-os através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho.
   2. Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação nas imagens coletadas usando as opções de Análise de Partículas disponíveis no ImageJ.
      1. Use a imagem | Ajustar | Comando de limiar para binariz as imagens de tal forma que apenas o sinal Osteosense apareça branco. Use o botão Analisar | Analise o comando de partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Certifique-se de usar os mesmos parâmetros de limite para cada imagem analisada quanto à consistência.

Resultados

Uma vez extraídas as aortas, a imagem por meio de um scanner óptico infravermelho próximo mostra uma representação visual da aorta, bem como da calcificação vascular (Figura 1). Os valores de intensidade de pixel dentro da imagem fluorescente digitalizada representam a distribuição da calcificação e são mostrados aqui usando um mapa de calor colorido. Os métodos de quantificação incluem identificar um limiar positivo e relatar a área percentual da aorta com valores maiores qu...

Discussão

Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153