In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

요약

이 논문은 광물화 가능성을 관찰하기 위해 쥐 대동맥을 분리한 후 석회화된 세포외 소포를 추출하여 혈관 석회화를 얻고 평가하는 방법론을 제시합니다.

초록

심혈관 질환은 세계의 주요 사망 원인이며 혈관 석회화는 심혈관 사건의 가장 중요한 예측 인자입니다. 그러나 현재 혈관 석회화에 대한 치료 또는 치료 옵션은 없습니다. 석회화는 칼슘과 인산 이온을 응집시켜 핵 초점 역할을 하는 특수 세포외 소포(EV) 내에서 시작됩니다. 이 프로토콜은 쥐 대동맥에서 석회화를 획득 및 평가하고 관련 추출된 EV를 분석하는 방법을 설명합니다. 먼저, 마우스의 육안 절개를 수행하여 신장, 간 및 폐와 같은 관련 장기를 수집합니다. 그런 다음 쥐 대동맥을 분리하여 대동맥 뿌리에서 대퇴 동맥으로 절제합니다. 그런 다음 2-3개의 대동맥을 모아 소화액에서 배양한 후 초원심분리를 거쳐 관심 있는 EV를 분리합니다. 다음으로, 고인산염 용액에서 배양하고 파장 340nm에서 광흡광도를 측정하여 EV의 광물화 전위를 측정합니다. 마지막으로, 콜라겐 하이드로겔은 시험관 내에서 EV에 의해 생성된 석회화된 미네랄 형성 및 성숙을 관찰하는 데 사용됩니다.

서문

석회화는 심혈관 질환 사망률 및 이환율의 가장 중요한 예측 인자이다¹. 석회화는 칼슘과 인산염 미네랄의 축적으로 인해 동맥벽 역학을 변화시킵니다². 죽상동맥경화증에서 석회화는 국소 스트레스를 악화시키고 심장마비의 주요 원인인 플라크 파열을 유발할 수 있습니다. 종종 만성 신장 질환으로 인한 내측 석회화는 더 널리 퍼져 있으며 심각한 동맥 경화, 기능 장애 및 심장 과부하를 유발합니다 ^2,3. 현재 혈관 석회화의 치료 또는 예방을 위한 치료 옵션은 없습니다.

혈관 평활근 세포(VSMC)는 조골세포와 유사한 표현형을 채택하고 초기 미네랄을 핵화하는 석회화 세포외 소포(EV)를 방출하여 석회화를 유발합니다 ^4,5,6. 이 과정은 뼈⁷에서 조골 세포의 생리적 광물 화와 유사합니다. 광물화의 종점은 혈관벽과 뼈 기질에서 유사하지만, 석회화 EV가 발생하는 메커니즘은 두 조직에서 다르다⁸. 혈관 석회화를 연구하는 데 사용되는 많은 유형의 모델이 있습니다. 시험관 내에서 세포 배양 모델은 VSMC의 골형성 전이 및 특수 배지를 사용한 후속 미네랄 형성을 모방합니다.

생체 내 석회화를 연구할 때 사용되는 모델은 연구 중인 석회화 유형에 따라 다릅니다. 고지혈증 마우스 모델은 죽상경화성 석회화를 연구하는 데 자주 사용되며, 이는 지질이 풍부한 플라크에서 더 집중적으로 나타난다⁹. 대조적으로, 내측 석회화는 맥관 구조 전체에 더 널리 퍼져 있으며, 종종 신부전을 유도하기 위해 아데닌이 풍부한 식이 요법을 사용하거나 신장의 상당 부분을 제거하기 위한 수술 기술을 사용하는 만성 신장 질환 모델을 사용하여 연구된다^10,11. 공격적인 혈관 석회화 모델은 고지혈증과 만성 신장 질환 모델을 모두 조합하여 사용했다¹². 이 프로토콜은 내측 및 죽상동맥경화성 석회화 모두에 대해 쥐 대동맥에서 혈관 석회화를 평가하고, 대동맥 벽에서 EV를 추출하고, 시험관 내 세포 배양 모델에서 얻은 EV의 광물화 가능성을 관찰하는 방법을 제공합니다. 향후 연구에서는 혈관 석회화의 기계론적 분석과 잠재적인 치료 개입을 평가하기 위해 이러한 절차를 사용할 수 있습니다.

프로토콜

생체 내 작업은 플로리다 국제 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 및 감독을 받았으며 현재 NIH(National Institutes of Health) 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜의 경우 절차는 마우스의 변형, 체중, 연령 및 성별에 따라 다르지 않습니다. 연구 중인 석회화의 유형, 식이 요법 및 치료법은 연구 기간과 사용된 마우스의 체중을 변경할 수 있으며 연구에 사용된 마우스의 특정 균주 및 성별에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 수컷과 암컷 C57BL/6J 마우스를 모두 사용하고 석회화 사료를 먹였습니다. 마우스를 20주령 내지 24주령 사이에 희생시켰다.

1. 대동맥의 격리 및 절제

1. 형광 마커
   1. 안락사 48시간 전에 정맥 주사를 통해 25g당 100μL의 권장 용량으로 형광 이미징제인 20μM OsteoSense 680을 마우스에 주사합니다.
   2. 흄 후드 아래에 4개의 t-핀이 있는 스티로폼 보드, 종이 타월을 깐 양동이, 종이 타월로 채워진 50mL 튜브, 1.5mL 미세 원심분리기 튜브, 해부 도구( 재료 표 참조) 및 에탄올을 스프레이 병에 넣습니다. 얼음 위에 PBS가 있는 비커를 놓습니다.
2. 채혈
   1. 종이 타월로 채워진 2mL 원뿔형 튜브에 50mL의 이소플루란을 추가합니다. 튜브를 양동이에 넣고 뚜껑으로 닫습니다.
      주의 : 이소플루란은 단기 노출의 독성으로 인해 배기 공기의 재순환이 없는 환기가 잘 되는 공간에서 취급해야 합니다.
   2. 한 번에 한 마우스를 버킷에 옮깁니다. 진정되면 마우스를 종이 타월 위에 등쪽 위치에 놓습니다. 주로 사용하지 않는 손바닥으로 마우스를 잡고 엄지 손가락과 포인터 손가락을 사용하여 귀를 다시 놓습니다.
   3. 핀셋을 사용하여 눈 중 하나를 절제하십시오. 마우스를 1.5mL 튜브 위에 올려 혈액 수집을 시작하고 그 동안 1mL의 혈액을 수집해야 합니다. 혈액 배출이 멈추면 추가 진정을 위해 마우스를 양동이에 다시 넣습니다.
3. 안락사
   1. 해부 매트 위에 종이 타월을 놓습니다. 마우스가 진정되면 마우스를 앙와위 자세로 매트 위에 놓습니다. t-핀을 사용하여 마우스를 앙와위 자세로 고정하여 각 팔다리를 고정합니다.
   2. 마우스의 복부에 알코올을 뿌립니다. 핀셋을 사용하여 가슴 부위의 피부를 들어 올립니다. 가위로 내측선을 흉강으로 자릅니다. 흉골이 중앙을 잘라내면 흉곽 양쪽의 횡격막을 자릅니다.
   3. 필요한 경우 흉곽의 정면 부분을 잘라내어 심장과 폐를 노출시킵니다.
4. 장기 제거
   1. 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 정중선 아래로 절개합니다. 과도한 피부나 지방을 제거하십시오. 생식 기관과 방광, 정중선 외부의 지방을 제거하십시오.
   2. 위장 (GI) 기관을 오른쪽으로 옮기고 정중선의 내장을 따라 가십시오. 발견되면 정중선을 들어 올리고 위장관을 위까지 절제합니다.
   3. 신장을 정중선에서 들어 올려 절제하십시오. 가능한 한 신장에 가깝게 자릅니다.
   4. 다음으로, 엽을 들어 올리고 정중선에서 잘라내어 간 제거를 시작하십시오.
   5. 심장과 대동맥을 관류하십시오. 10mL 주사기를 사용하여 차가운 PBS를 우심실에 주입합니다. 폐가 부풀어 오르고 하얗게 변할 때까지 기다리십시오. 폐와 과도한 횡격막 또는 흉곽을 제거하십시오.
5. 뼈 제거
   1. 가위를 넓게 열고 꼬리 위의 마우스 아래쪽 영역에 놓습니다. 아래쪽으로 자르고 피부에서 척추를 들어 올리기 시작합니다. 정중선의 측면에서 지방을 제거하십시오. 피부가 분리되면 심장 바로 위를 절단하여 척추와 손상되지 않은 장기를 절제합니다. 입체경으로 운반하는 경우 척추와 손상되지 않은 장기를 얼음 양동이의 PBS 비커에 넣습니다.
   2. 척추와 장기를 해부 접시로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 채웁니다. 바늘을 사용하여 척추와 흉곽을 고정합니다.
   3. 해부 현미경으로 핀셋을 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올리고 척추 위와 대동맥 아래를 절단하기 시작합니다. 척추의 바닥에 도달 할 때까지 이것을 계속하십시오. 해부 접시에서 척추를 제거하고 심장과 외부 지방 또는 근육을 고정하십시오.
6. 미세 해부
   1. 심장 바로 아래 영역에서 시작하여 식도, 대정맥 및 대동맥의 세 가지 관형 구조를 식별합니다. 대동맥의 명확한 시야를 갖기 위해 식도와 대정맥을 제거하십시오.
   2. 미세 해부 겸자와 가위를 사용하여 지방 조직을 들어 올리고 가능한 한 대동맥에 가깝게 절단합니다. 대동맥을 자르지 마십시오. 모든 대동맥과 대퇴 동맥이 노출될 때까지 내측선을 따라 계속합니다.
   3. 심장에서 모든 지방 조직을 제거하여 대동맥 궁에서 세 가지를 노출시킵니다. 미세 해부 가위를 좌심실에 삽입하고 대동맥 주변 근육을 절단하여 좌심실에서 대동맥 뿌리를 제거합니다.
   4. 대동맥을 분리하고 세척한 후에는 근적외선 스캐너를 사용하여 대동맥을 영상화하여 혈관 석회화를 시각화합니다.
   5. 사용자 지정 MATLAB 스크립트(보충 파일 1)를 사용하여 스캔된 전체 대동맥 영역으로 정규화되는 칼슘 트레이서의 총 신호를 정량화합니다. MATLAB 스크립트는 생물정보학 툴박스(Bioinformatics toolbox) 추가 기능을 사용하여 작동합니다. MATLAB은 먼저 대동맥의 근적외선 스캔에서 TIFF 파일의 위치로 이동하고, 개별 파일을 열고, TIFF 파일에서 픽셀 강도 값을 추출합니다.
      1. 컬러 맵과 함께 이미지가 사용자에게 제공되면 석회화가 가장 큰 대동맥을 최대 척도로 선택합니다.
      2. MATLAB이 명령 창에서 "영상에 표본이 몇 개나 있습니까?"라고 물으면 현재 영상의 대동맥 개수를 입력하고 각 대동맥을 하나씩 선택합니다. 대동맥을 선택하면 MATLAB은 대동맥 전체 면적의 마스크가 있는 이진 영상과 대동맥의 석회화된 면적 마스크가 있는 또 다른 이진 영상을 만듭니다. 그런 다음 이러한 마스킹된 이미지의 값을 사용하여 총 석회화 면적, 대동맥의 전체 면적, 석회화 양성 면적 백분율 및 석회화 영역의 평균 강도를 결정합니다.
      3. 대동맥을 선택하려면 한 번의 왼쪽 클릭으로 네 모서리를 선택하고 이미지 주위에 상자를 만들어 화면의 가장 최근 그림에서 관심 있는 대동맥 주위에 상자를 만듭니다. 상자를 닫으려면 첫 번째 모서리를 두 번 클릭합니다.
         참고: 임계값은 사용된 석회화 모델에 따라 다를 수 있습니다. 혈관 석회화에 대한 양성 신호를 결정하는 값을 결정하는 것은 사용자의 몫입니다. 실험에 대한 임계값이 설정되면 실험 기간 동안 동일하게 유지되어야 합니다.
   6. 정량적 데이터가 추출되면 Tukey의 사후 검정을 사용하여 일원 분산 분석을 수행하여 그룹 간의 유의성을 보여줍니다.

2. 대동맥에서 EV 분리 및 추출

참고: 대동맥이 분리되고 제거되면 조직에서 EV를 추출할 수 있습니다. 소화 용액과 다중 원심분리기 사이클을 사용하여 EV를 수집하고 석회화 분석, 겔 전기영동 및 면역블로팅을 포함한 다양한 기술에 사용할 수 있습니다¹³. EV를 분리하고 추출하기 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

1. 대동맥을 스캔한 직후, 충분한 단백질 농도를 산출하기 위해 2-3개의 대동맥을 풀링합니다.
2. 0.25M 자당, 0.12M 염화나트륨(NaCl), 0.01M 염화칼륨(KCl), 0.02M 트리스 염산염 및 600U/mL 콜라게나제¹³을 포함하는 소화액을 준비합니다.
3. 2-3개의 풀링된 아오타르타를 1.5mL의 소화액에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 솔루션을 수집합니다. 용액을 1,000 × g 에서 15 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
4. 상층액을 33,000 × g 에서 추가로 30분 동안 원심분리하여 미세소포를 제거합니다. 석회화 가능성에 대해 상청액을 수집하고 평가합니다(섹션 3 참조).
   알림: EV의 겔 전기영동 및 단백질 면역블로팅을 수행해야 하는 경우 후속 단계를 따르십시오.
5. 상층액을 100,000× g 에서 1시간 동안 초원심분리하여 관심 있는 EV를 분리합니다.
6. 상청액이 초원심분리되는 동안 프로테아제 억제제를 첨가하고 용해될 때까지 볼텍싱하여 RIPA 용해 및 추출 완충액( 재료 표 참조)을 준비합니다.
7. 초원심분리가 완료되면 상층액을 흡인하여 EV가 포함된 펠릿을 남깁니다. 펠렛을 제조된 RIPA 용해 및 프로테아제 억제제 혼합물에 현탁시킨다. 샘플은 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅을 위한 준비가 되었습니다.

3. 광산란 흡광도를 이용한 세포밖 소포체의 석회화 가능성 평가

참고: EV의 실시간 미네랄 형성을 측정하기 위해 원래 세포 배양¹⁴의 성장판 연골 EV에서 미네랄 형성을 연구하기 위해 개발된 분석을 사용했습니다. 인산칼슘 증착이 석회화의 특징이기 때문에, 인산칼슘 화합물 형성의 결과로서 광산란 흡광도의 증가는 석회화 전위(calcification potential)를 나타낸다¹⁴. 체외 VSMC 모델은 EV의 석회화 가능성을 측정하는 데 편리합니다. 이 기술에서 단파장 필터가 있는 플레이트 리더는 EV의 시험관 내 석회화를 정량화할 수 있습니다. 흡수도 판독값은 340nm에서 기록되며 흡광도가 높을수록 더 많은 인산칼슘 미네랄 형성을 나타냅니다. 광산란 흡광도 분석을 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

1. VSMCs의 컨디셔닝된 수집된 배지를 1,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다¹⁴.
2. 상층액을 33,000× g 에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.
   참고: 수집된 상층액에 EV의 존재 여부는 동적 광 산란(DLS) 또는 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 확인할 수 있습니다
3. 300 mM 인산나트륨 일염기성(_NaH2PO4) 멸균 용액을 준비한다. 필요한 경우 멸균 상태를 보장하기 위해 용액을 여과하십시오.
4. EV 샘플에 300mM NaH2PO4의 1%(v/v)를 추가하고 용액을 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 200 μL의 혼합 용액을 96-웰 플레이트로 옮긴다. 96-웰 플레이트를 37°C의 마이크로플레이트 리더에서 인큐베이션한다.
5. 340분마다 1nm 파장의 흡광도를 기록하도록 플레이트 리더를 설정합니다.

4. 콜라겐 하이드로젤을 이용한 세포밖 소포체의 석회화 미네랄 형성 평가

참고: EV의 응집과 미세석회화의 형성은 콜라겐 하이드로겔을 통해 관찰됩니다. 이들 하이드로겔은 생체 내에서 관찰되는 콜라겐 밀도를 모방하는 스캐폴드로서 작용한다 ¹⁵. 이것은 석회화 성장에 대한 콜라겐의 효과를 보여줍니다. 하이드로겔에서 EV의 광물 형성을 평가하기 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

1. 1일차
   1. DMEM에서 2.5mg/mL 콜라겐 용액을 준비합니다. 색상이 빨간색으로 바뀔 때까지 콜라겐/DMEM 혼합물에 5M 수산화나트륨을 천천히 첨가합니다. 용액의 pH가 약 7인지 확인하십시오.
      알림: 솔루션이 보라색으로 변하고 너무 기본적이 되면 프로세스를 다시 시작하십시오.
   2. pH가 7인 2.5mg/mL 콜라겐 용액 300μL를 8웰 챔버 유리의 각 웰에 피펫팅합니다. 37°C 및 5% CO2 제어 습도에서₇₂ 시간 동안 배양합니다.
2. 4일차
   1. 대조군으로 300 μL의 DMEM을 웰에 추가합니다.
   2. 이전에 수집한 EV 배지 샘플 300μL을 나머지 웰에 추가합니다.
   3. 37°C 및 5%_CO2 조절된 습도에서 6일 동안 배양한다.
3. 10일차
   1. 2.5μL의 DMEM과 함께 2.5μL의 Osteosense 680EX를 준비합니다.
   2. 2.5 μL의 Osteosense 및 DMEM 혼합물을 각 웰에 피펫팅한다. 37°C 및 5%_CO2 제어 습도에서 24시간 동안 배양합니다.
4. 11일차
   1. Osteosense 형광에 적합한 필터로 하이드로겔을 이미지화합니다. 도립 현미경을 사용하여 커버글라스 챔버의 바닥을 통해 또는 작동 거리가 긴 대물렌즈로 상단에서 이미지화합니다.
   2. ImageJ에서 사용할 수 있는 입자 분석 옵션을 사용하여 수집된 이미지의 석회화 수와 석회화 크기를 평가합니다.
      1. 이미지 사용 | 조정 | Osteosense 신호만 흰색으로 나타나도록 이미지를 이진화하는 임계값 명령입니다. 분석 | 입자 분석 명령을 사용하여 이미지의 각 석회화에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 일관성을 위해 분석된 각 이미지에 대해 동일한 임계값 매개 변수를 사용해야 합니다.

결과

대동맥이 추출되면 근적외선 광학 스캐너를 사용한 영상은 대동맥과 혈관 석회화의 시각적 표현을 보여줍니다(그림 1). 스캔된 형광 이미지 내의 픽셀 강도 값은 석회화의 분포를 나타내며 여기에 컬러 히트맵을 사용하여 표시됩니다. 정량화 방법은 양성 역치를 식별하고, 이 역치보다 큰 값을 갖는 대동맥의 백분율 면적을 보고하고/하거나 대동맥 내 픽셀의 평균 형광 강도...

토론

프로토콜을 수행할 때 성공적인 결과를 얻기 위한 중요한 단계를 기록하는 것이 중요합니다. 쥐 대동맥을 분리하는 동안 관류가 제대로 수행되는 것이 중요합니다. PBS를 주사 할 때 우심실에 구멍이 뚫리지 않도록주의해야합니다. 이렇게 하면 액체가 심실에서 직접 누출되어 폐를 순환하지 못하여 대동맥 내에 혈액이 남게 됩니다. 관류가 제대로 수행되고 미세 해부가 시작되면 완료 및 스캔 전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153