Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Resumo

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para o estudo da meiose, fertilização e desenvolvimento embrionário. C. elegans existem como hermafroditas autofecundantes, que produzem grandes ninhadas de progênie - quando os machos estão presentes, eles podem produzir ninhadas ainda maiores de progênie cruzada. Erros de meiose, fertilização e embriogênese podem ser rapidamente avaliados como fenótipos de esterilidade, fertilidade reduzida ou letalidade embrionária. Este artigo descreve um método para determinar a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada em C. elegans. Demonstramos como configurar este ensaio escolhendo um verme em uma placa individual de Youngren modificado, apenas bactopeptona (MYOB), estabelecer o período de tempo apropriado para contar progênie viável e embriões não viáveis e explicar como contar com precisão espécimes de vermes vivos. Esta técnica pode ser usada para determinar a viabilidade em hermafroditas autofertilizantes, bem como a fertilização cruzada por pares de acasalamento. Esses experimentos relativamente simples são facilmente adotáveis por novos pesquisadores, como estudantes de graduação e alunos do primeiro ano de pós-graduação.

Introdução

A reprodução sexuada em organismos eucarióticos requer a produção de gametas funcionais que se fundem para formar um embrião através do processo de fecundação. Os gametas materno e paterno, o óvulo (óvulos) e o espermatozoide são criados através dos processos especializados de divisão e diferenciação celular da meiose e gametogênese¹. A meiose começa com uma única célula diploide e termina com a formação de células filhas que contêm metade do número de cromossomos da célula parental original. Desde a redução da ploidia até o embaralhamento do material genético via sortimento independente e recombinação cruzada, a meiose cumpre múltiplas funções importantes¹. Erros dentro da meiose podem resultar em aneuploidia, em que há muitos ou poucos cromossomos dentro de um gameta. As incidências de aneuploidias têm enormes impactos na saúde humana, uma vez que os desequilíbrios cromossômicos são uma das principais causas de abortos espontâneos e distúrbios do desenvolvimento, como a síndrome de Down e a síndrome de^Edwards2.

A fecundação é o processo pelo qual os gametas materno e paterno se fundem para gerar um novo organismo³. O reconhecimento de gametas-gametas é facilitado por proteínas na superfície do gameta³. Erros com compatibilidade de gametas levam à infertilidade, pois a fusão de espermatozoides e óvulos é incapaz de prosseguir. A fusão de espermatozoides com um ovócito desencadeia uma série de eventos que levam à formação adequada de um embrião ativo que pode iniciar a jornada de desenvolvimento de um embrião unicelular para um organismo multicelular totalmente funcional via divisões mitóticas⁴. Ao longo da embriogênese, os eventos moleculares que regulam o desenvolvimento devem ser rigorosamente regulados e cronometrados, para permitir o crescimento adequado do organismo⁵. A diferenciação celular adequada durante o desenvolvimento inicial é crucial à medida que o organismo faz a transição de um embrião pluripotente para um organismo de pleno direito. Devido às complexidades desses eventos, as rupturas podem levar a defeitos de desenvolvimento que resultam em letalidade embrionária.

Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para estudar meiose, fertilização e desenvolvimento embrionário. C. elegans é um nematódeo transparente que possui dois sexos, machos e hermafroditas. C. elegans hermafroditas, capazes de autofecundação, são o sexo predominante ^6,7. A gônada hermafrodita produz espermatozoides pela primeira vez durante o quarto estágio larval (L4), que são armazenados na espermateca. Na transição de L4 para a idade adulta, a linha germinativa muda para a produção de ovócitos, que são então fertilizados através dos espermatozoides armazenados. Os machos, que surgem nos hermafroditas a uma taxa inferior a 0,2%, só produzem espermatozoides e podem acasalar com hermafroditas. Na fecundação cruzada, os espermatozoides masculinos superam os hermafroditas na fecundação dos ovócitos⁸. Isso permite a manutenção relativamente fácil de mutantes homozigotos através de estoques autofertilizantes e manipulações genéticas através de cruzamentos genéticos. Os dois sexos permitem estudos que exploram diferenças entre meiose em linhagens germinativas masculinas e femininas. Além disso, devido à natureza transparente de C. elegans e seus ovos, os processos de meiose, gametogênese, fertilização e embriogênese podem ser estudados em animais vivos e intactos usando técnicas de imagem por fluorescência.

Ao analisar novas mutações em genes que podem desempenhar um papel na meiose, fertilização e/ou desenvolvimento embrionário em C. elegans, um primeiro passo crucial é determinar a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada, uma vez que erros nesses processos frequentemente levam a uma falha ou redução na produção de progênie viável. Este trabalho descreve um protocolo para avaliar a fertilidade, a viabilidade embrionária e o tamanho da ninhada de hermafroditas autofertilizantes ou cruzamentos entre hermafroditas e machos. Embora este ensaio clássico tenha sido usado em muitos estudos de C. elegans , nós fornecemos um protocolo padronizado para configuração e quantificação precisa. Neste protocolo, vermes individuais ou pares macho/hermafrodita são isolados para permitir o acasalamento e a produção de progênies. A produção e a viabilidade de progênies são observadas ao longo de uma série de dias para determinar o número de progênies viáveis e embriões não viáveis. Ao final do experimento, as ninhadas individuais são analisadas para calcular a porcentagem de viabilidade embrionária e o tamanho total da ninhada.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais usados neste protocolo.

1. Preparação de placas experimentais

1. Prepare placas de Petri de 35 mm de diâmetro com meios Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB). Para fazer placas de MIOB, adicione 20 g de ágar Bacto, 2 g de NaCl, 0,55 g de Trizma-HCl, 0,24 g de Trizma-OH, 3,1 g de peptona Bacto e 1,6 mL de colesterol a 1 L de ddH₂O e autoclave por 40 min a 121 °C. Deixar arrefecer até 55 °C e, utilizando técnica estéril, deitar 4 ml do meio fundido em cada placa de Petri de 35 mm.
   NOTA: Um litro de MYOB produz ~250 placas, que podem ser armazenadas a 4 °C por até 6 meses. Recomendamos um mínimo de 10 indivíduos por réplica com três conjuntos de réplicas para cada cepa.
2. Usando técnica estéril, semeie as placas com uma pequena mancha (aproximadamente 50 μL) de bactérias OP50 no meio da placa.
   NOTA: Gramados pequenos são especialmente importantes para avaliar a fertilização cruzada, pois a mancha menor leva ao aumento de encontros entre machos e hermafroditas, aumentando assim a chance de acasalamento.

2. Ensaios de viabilidade embrionária (autofecundação hermafrodita)

1. Dia 1
   1. Rotule o verso de cada placa. Certifique-se de acompanhar cada placa e seus respectivos vermes durante todo o experimento.
      NOTA: Técnica de rotulagem preferida - Dia 1: verme 1, Dia 1: verme 2, ... etc.
   2. Transfira um hermafrodita de estágio L4 individual para cada placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato. Permitir que os vermes se desenvolvam em adultos e colocar a autoprogênie por 24 h à temperatura padrão de cultivo de 20 °C. Marque essas placas no dia 3.
      NOTA: A temperatura dos experimentos pode ser alterada no caso de mutações sensíveis à temperatura. Para mutações sensíveis à temperatura, os ensaios de viabilidade embrionária devem ser realizados nas temperaturas permissiva (15-16 °C) e não permissiva (24-26 °C).
2. Dia 2
   1. Rotule um conjunto de novas placas-Dia 2: verme 1, Dia 2: verme 2, ... etc.
   2. Transfira minhocas individuais do dia 1 para as novas placas.
      NOTA: Esses vermes deveriam ter atingido a idade adulta, e os vermes selvagens já deveriam ter começado a colocar embriões.
   3. Deixar que os vermes ponham embriões durante 24 h a 20 °C ou outra temperatura adequada. Marcar essas placas no dia 4.
3. Dia 3
   1. Rotule um conjunto de placas novas. Dia 3: verme 1, dia 3: verme 2, ... etc.
   2. Transfira minhocas individuais do dia 2 para novas placas. Deixar que coloquem a progênie por 24 h a 20 °C ou outra temperatura adequada. Marcar essas placas no dia 5.
      OBS: Em casos de temperaturas mais baixas, os tempos de eclosão serão aumentados. Ajuste de acordo.
   3. Desenhe um padrão de grade em uma tampa de 35 mm usando um marcador fino. Coloque a tampa quadriculada sob a placa de teste para contagem para acompanhar as minhocas previamente contadas (Figura 1A-B).
      1. Usando um contador de células diferenciais, marque as placas do dia 1 para a presença ou ausência de progênie. Conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos.
         NOTA: Neste ponto, decorreu um tempo suficiente para que quaisquer embriões viáveis tenham eclodido. Presume-se que todos os embriões não eclodidos estejam mortos.
      2. Dentro de um quadrado individual, conte os embriões não eclodidos e as larvas vivas que estão inteiramente dentro do quadrado (Figura 1C-F).
      3. Para vermes que estão nas bordas quadradas, conte com base na localização da cabeça do verme. Conte vermes com cabeças tocando as bordas superior e esquerda do quadrado (não conte aqueles que tocam as bordas inferior ou direita; Figura 1D). Não conte ovócitos não fertilizados para este ensaio (Figura 1F).
   4. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório.
4. Dia 4
   1. Marcar as placas do dia 2 contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos, conforme descrito na etapa 2.3.3.1. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório.
5. Dia 5
   1. Marcar as placas do dia 3 contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos, conforme descrito na etapa 2.3.3.1. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório. Analisar os dados obtidos utilizando o método descrito na análise dos dados.
      NOTA: Alguns mutantes genéticos podem ter um ciclo reprodutivo atrasado ou expandido. Monitorar cepas individuais para a postura contínua de embriões além das placas do dia 3. Se a produção de embriões não tiver cessado até o dia 4, continue a transferir adultos para novas placas.

3. Ensaios de viabilidade embrionária (fertilização cruzada macho/hermafrodita)

1. Dia 1
   1. Rotule o verso de cada placa. Certifique-se de acompanhar cada placa e seus respectivos vermes durante todo o experimento.
   2. Transfira um verme Hermafrodita L4 individual para cada placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato.
      NOTA: Cepas feminizadas, como mutantes de perda de função fog-2 , que não produzem espermatozoides, podem ser usadas no lugar de hermafroditas.
   3. Transfira um único verme macho L4 para cada placa marcada contendo um hermafrodita L4. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato.
      NOTA: Cepas como os machos da variante plg-1 podem ser usadas para identificar se o acasalamento ocorreu, pois esses machos depositam um tampão copulatório na vulva hermafrodita após o acasalamento.
   4. Deixar que os vermes acasalem e coloquem progênie por 24 h a 20 °C, ou outra temperatura apropriada. Pontuar essas placas para larvas vivas versus embriões não eclodidos no dia 3.
2. Dia 2
   1. Rotule um conjunto de placas novas e transfira as minhocas, como no dia 2 acima. Neste caso, certifique-se de transferir tanto o hermafrodita quanto o macho para novas placas. Certifique-se de que o hermafrodita atingiu a idade adulta.
   2. Deixar que os hermafroditas depositem progênie por 24 h a 20 °C, ou outra temperatura apropriada. Pontuar essas placas para larvas vivas versus embriões não eclodidos no dia 4.
3. Dia 3
   1. Rotule um conjunto de placas novas e transfira as minhocas, como no dia 3 acima. Certifique-se de transferir tanto o hermafrodita quanto o macho para novas placas.
   2. Deixar assentar a progênie por 24 h a 20 °C, ou outra temperatura apropriada. Marcar essas placas para embriões vivos versus não eclodidos no dia 5.
   3. Usando um contador de células diferenciais, conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir das placas do dia 1, conforme descrito na etapa 2.3.3.1.
      OBS: Não descarte as placas, pois elas são obrigatórias para o dia 4.
   4. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório.
4. Dia 4
   1. Contar a progenitura viva e os embriões não eclodidos a partir das placas do dia 2, conforme descrito no passo 2.3.3.1. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório.
   2. Confira no dia 1 pratos para machos. Se o acasalamento tiver ocorrido, a proporção genética esperada de hermafroditas para machos deve ser de 50:50. Se as placas do dia 1 não contiverem machos, não ocorreu acasalamento entre o macho e o hermafrodita. Descarte esse par de acasalamento e registre essa observação no caderno de laboratório.
5. Dia 5
   1. Contar as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir das placas do dia 3, conforme descrito no passo 2.3.3.1. Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório. Analisar os dados obtidos utilizando os métodos descritos na análise dos dados.

4. Análise dos dados

1. Calcular a porcentagem de viabilidade embrionária de uma dada réplica biológica de uma cepa usando a equação (1).
   NOTA: Os números de progênie viva e de embriões não eclodidos são obtidos totalizando a contagem diária ao longo do período experimental.
   (1º)
2. Calcular o tamanho da ninhada por verme de uma determinada estirpe somando o número de descendentes (embriões e larvas não eclodidos) produzidos pelo hermafrodita progenitor. Calcular o tamanho médio da ninhada usando a equação (2).
   (2º)
3. Relatar a porcentagem de viabilidade embrionária e o tamanho médio da ninhada com a média e o desvio padrão entre as réplicas biológicas. Realizar o teste t de Student comparando os dados controle e experimental.

Resultados

Foram realizados ensaios de viabilidade embrionária e dimensionamento de ninhadas em N2 (tipo selvagem) e em duas cepas contendo mutações em genes envolvidos na meiose, him-5(e1490) e spo-11(ok79). Como tanto o him-5 quanto o spo-11 desempenham um papel na formação do cruzamento meiótico, mutações nesses dois genes resultam na formação de gametas aneuplóides. Este ensaio de viabilidade embrionária para N2 produziu uma porcentagem de viabilidade de 98,9%, enquanto tanto him-5(e1490) quanto spo-11(ok79) mostraram uma redução na viabilidade da progênie com um percentual de 74,9% e 0,8%, respectivamente (Figura 2A; p < 0,0005). Esses resultados são consistentes com resultados previamente publicados ^7,9. O tamanho médio da ninhada de N2, him-5(e1490) e spo-11(ok79) foi determinado como sendo 217, 105 e 219, respectivamente (Figura 2B). Consistente com publicações anteriores, him-5(e1490) tem um tamanho de ninhada significativamente reduzido em comparação com o tipo selvagem, enquanto spo-11(ok79) não ^7,9.

Figura 1: Demonstração do arranjo de contagem e morfologia do embrião em placas . (A) Imagem de uma tampa com um padrão de grade cruzado desenhado usando um sharpie fino. (B) Placa MYOB de 35 mm com a tampa padronizada embaixo para contagem. (C) Imagem demonstrando um campo de visão de baixa ampliação (10x) mostrando várias caixas da grade. Pontas de seta brancas apontam várias larvas dentro desse campo de visão. A contagem deve ser feita em uma ampliação maior (apenas um quadrado no campo) para observar tanto larvas quanto embriões. Barra de escala = 1.000 μm. (D) Desenho animado da tampa com o padrão de grade colocado sob uma placa de 35 mm. O inset denota a técnica adequada para determinar quais larvas são contadas em um determinado quadrado. Conte de cima para baixo, da esquerda para a direita. Conte todos os vermes que estão inteiramente dentro do quadrado. Os vermes que tocam o limite devem ser contados com base na posição da cabeça do verme, não na cauda. Conte worms voltados para a grade atual ou grades que foram contadas anteriormente (ou seja, bordas superior e esquerda). Não conte vermes com cabeças tocando as bordas inferior ou direita. A partir do início, os vermes azuis serão contados, enquanto os vermes vermelhos não. (E) Imagem representativa de larvas saudáveis eclodidas N2 L1 (cabeça de seta branca). (F) Imagem representativa de um ovócito não fertilizado (ponta de seta preta) e de um embrião não eclodido (ponta de seta vermelha). Oócitos não fertilizados não devem ser contados para este ensaio. Barras de escala (E,F) = (100 μm). Nota: As imagens em C, E e F foram obtidas com um microscópio Zeiss AxioZoom, com uma câmera acoplada com a finalidade de demonstrar o aparecimento de larvas, embriões e ovócitos em placas de vermes. Para os ensaios de viabilidade embrionária, as contagens são feitas durante a observação das placas usando um estereomicroscópio (sem câmera). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Gráficos representativos dos resultados dos ensaios de viabilidade embrionária e do tamanho das ninhadas. (A) Porcentagem de viabilidade embrionária de N2, him-5(e1490) e spo-11(ok79) a 20 °C. (B) Tamanhos de ninhada de N2, him-5(e1490) e spo-11(ok79) a 20 °C. A progênie de pelo menos 28 hermafroditas foi pontuada para cada cepa. O número total de embriões não eclodidos mais larvas pontuados foram N2 = 6302, him-5(e1490) = 2.945 e spo-11(ok79) = 7.230. As barras de erro indicam o desvio padrão em três réplicas individuais separadas. Estatística calculada pelo teste t de Student, n.s. = não significante, *p < 0,0005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A propagação de espécies reprodutoras sexuadas requer a formação de gametas haploides (isto é, óvulos e espermatozoides) através da meiose, que são então unificados na fecundação, restaurando o número cromossômico diploide e iniciando o desenvolvimento embrionário. Erros em qualquer um desses processos podem levar à infertilidade, letalidade embrionária e/ou defeitos congênitos. C. elegans é um poderoso sistema modelo para estudar a reprodução sexuada. Os efeitos de mutações gênicas ou knockdown de expressão gênica (por exemplo, interferência de RNA) podem ser avaliados de forma relativamente rápida e fácil usando os ensaios de viabilidade embrionária e dimensionamento de ninhada descritos acima. Utilizamos esses métodos para a caracterização inicial de genes envolvidos na segregação cromossômica meiótica e fertilização/ativação de ovos^10,11,12. Uma redução observada na viabilidade embrionária ou no tamanho da ninhada indica uma interrupção na meiose, gametogênese, fertilização ou embriogênese.

Como a viabilidade embrionária e o dimensionamento da ninhada são avaliados com relativa facilidade por meio da contagem de progênie e de um cálculo matemático simples, esses são experimentos introdutórios ideais para iniciantes em pesquisa, seja no laboratório ou na sala de aula. A facilidade de criação de C. elegans e as vantagens econômicas os tornam particularmente adequados para aulas de biologia experimental. Os alunos adquirem valiosa experiência de pesquisa através da criação de C. elegans , aprendem a usar microscópios dissecantes e podem fazer perguntas biológicas em um sistema de desenvolvimento que podem ser respondidas em um período relativamente curto de tempo (aproximadamente 5 dias com o protocolo descrito neste artigo).

O momento da contagem de progênies é muito importante para ensaios de viabilidade embrionária. A 20 °C, a embriogênese leva aproximadamente 16 h, e adultos reprodutivamente maduros começam a colocar ovos aproximadamente 60 h após a eclosão como larvas L1. Como o ciclo de vida é rápido, é importante contar a progênie dentro da janela apropriada, dando tempo suficiente para que os embriões eclodam, mas antes que a própria progênie comece a colocar ovos. Também é importante notar que os períodos de crescimento variam dependendo da temperatura. O crescimento é aproximadamente 2,1 vezes mais rápido a 24-25 °C do que 15-16 °C, e aproximadamente 1,3 vezes mais rápido a 20 °C do que 15-16 °C¹³. Neste protocolo, recomendamos que as contagens ocorram 48 h após os adultos serem colocados em um prato fresco. Esse prazo garante que todos os embriões com desenvolvimento selvagem tenham tempo suficiente para eclodir (>16 h), mas não envelheçam até o ponto de capacidade reprodutiva. Ensaios realizados em temperaturas inferiores a 20 °C podem precisar ser estendidos (animais de transferência por 4 dias) para que os embriões eclodam e para que a progênie eclodida atinja estágios larvais mais fáceis de observar entre as bactérias nas placas MYOB (estágios L3-L4).

Uma limitação aos ensaios de viabilidade embrionária e ao dimensionamento das ninhadas é que o processo específico de desenvolvimento que é perturbado não é facilmente aparente. No entanto, esses ensaios iniciais podem ser acompanhados com técnicas citológicas para determinar qual processo é afetado. Por exemplo, a dissecção dos vermes adultos para liberar a gônada seguida pela coloração de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e a análise cuidadosa da morfologia do DNA dentro da linha germinativa podem revelar se os processos meióticos são interrompidos. Além disso, a coloração DAPI de embriões pode revelar em que estágio a embriogênese é interrompida.

Em conclusão, descrevemos um protocolo para determinar o número de embriões produzidos (ninhada) e a porcentagem de embriões viáveis para vários mutantes de C. elegans. Este ensaio pode ser usado tanto para hermafroditas autofertilizantes quanto para cruzamentos macho/hermafrodita. Com o curto ciclo de vida de C. elegans, este protocolo pode ser completado em menos de 1 semana. Ensaios de viabilidade embrionária e tamanhos de ninhada podem ser usados como primeiras análises de genes envolvidos em meiose, fertilização ou desenvolvimento embrionário, e são protocolos apropriados para pesquisadores mais avançados e novatos em pesquisa (estudantes de graduação e do primeiro ano de pós-graduação).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.