Tomografia por Emissão de Pósitrons Usando 64-Cobre como Traçador para o Estudo de Doenças Relacionadas ao Cobre

Resumo

O presente protocolo descreve como realizar imagens de PET/CT e PET/RM de ⁶⁴em humanos para estudar distúrbios relacionados ao cobre, como a doença de Wilson, e o efeito do tratamento no metabolismo do cobre.

Resumo

O cobre é um oligoelemento essencial, atuando em catálise e sinalização em sistemas biológicos. O cobre radiomarcado tem sido usado há décadas no estudo do metabolismo básico do cobre humano e animal e de distúrbios relacionados ao cobre, como a doença de Wilson (DM) e a doença de Menke. Uma adição recente a este kit de ferramentas é a tomografia por emissão de pósitrons (PET) de 64 cobre (64), combinando a imagem anatômica precisa dos modernos scanners de tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM) com a biodistribuição do sinal traçador PET ^{de 64}. Isso permite o rastreamento in vivo dos fluxos e cinética de cobre, visualizando diretamente o tráfego e o metabolismo de órgãos de cobre humanos e animais. Consequentemente, a PET ⁶⁴é adequada para avaliar os efeitos clínicos e pré-clínicos do tratamento e já demonstrou a capacidade de diagnosticar a DP com precisão. Além disso, ⁶⁴estudos de PET/CT de provaram ser valiosos em outras áreas científicas, como pesquisa de câncer e acidente vascular cerebral. O presente artigo mostra como realizar ⁶⁴PET/CT ou PET/RM em humanos. Os procedimentos para manuseio de ⁶⁴, preparo do paciente e configuração do scanner são demonstrados aqui.

Introdução

O cobre é um cofator catalítico vital que conduz múltiplos processos bioquímicos importantes essenciais para a vida, e defeitos na homeostase do cobre são diretamente responsáveis por doenças humanas. Mutações nos genes ATP7A ou ATP7B , que codificam as ATPases transportadoras de cobre, causam as doenças de Menke e Wilson, respectivamente. A doença de Menke (ATP7A) é uma rara desordem letal de hiperacúmulo intestinal de cobre com grave deficiência de cobre nos tecidos periféricos e déficits de enzimas dependentes de cobre¹. A doença de Wilson (DM) (ATP7B) é uma doença rara caracterizada pela incapacidade de excretar cobre em excesso para a bile, resultando em sobrecarga de cobre e subsequente lesão de órgãos, afetando mais gravemente o fígado e^{o cérebro2}.

Estudos sobre o metabolismo do cobre têm utilizado cobre radiomarcado (geralmente 64-cobre [⁶⁴] ou 67-cobre) há décadas, e esses estudos têm se mostrado inestimáveis para nossa compreensão do metabolismo do cobre em mamíferos, incluindo o local de absorção e as vias de excreção 3,4,5,6. Anteriormente, contadores gama eram usados para detectar o sinal radioativo com uma resolução anatômica limitada, mas recentemente, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) de ⁶⁴combinada com tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM) foi introduzida em estudos em humanos e animais. Hoje, os scanners PET têm uma sensibilidade tão alta que é possível rastrear ⁶⁴por até 70 h após a injeção. A meia-vida longa de 12,7 h para ⁶⁴permite a avaliação a longo prazo dos fluxos de cobre. Essa melhora na resolução entrou recentemente no campo dos estudos do cobre, e estudos sobre o metabolismo normal e patológico do cobre, bem como estudos avaliando o impacto de tratamentos específicos, estão começando a surgir. Além disso, a introdução de scanners PET de corpo inteiro com um campo de visão alargado aumentará ainda mais a sensibilidade destes exames.

Este artigo metodológico visa permitir que clínicos e cientistas adicionem ⁶⁴PET CT/MRI ao repertório de ferramentas existentes como um método robusto e fácil de usar para avaliar o metabolismo do cobre de maneira comparável entre os departamentos de medicina nuclear. A produção de ^{cobre 64}pode ser realizada usando diferentes métodos e geralmente é realizada em instalações especiais. Dentre as reações nucleares, o método de 64 Ni (p, n) 64 é amplamente utilizado, uma vez que um alto rendimento de produção de ⁶⁴pode ser obtido com prótons de baixa energia nessa rota ^7,8. Uma descrição detalhada dos métodos de produção está fora do escopo deste trabalho, e a disponibilidade será diferente por país e região.

Neste artigo, descrevemos primeiramente a preparação da radioquímica necessária e do traçador. Em seguida, são demonstrados os princípios para o preparo dos equipamentos de PET/CT ou PET/RM.

Protocolo

Alguns ensaios clínicos usando este protocolo PET/CT ou PET/MRI de ⁶⁴foram aprovados pelo Comitê de Ética Regional da Região Midt, Dinamarca [1-10-72-196-16 (EudraCT 2016-001975-59), 1-10-72-41-19 (EudraCT 2019-000905-57), 1-10-72-343-20 (EudraCT 2020-005832-31), 1-10-72-25-21 (EudraCT 2021-000102-25) e 1-10-72-15-22 (EudraCT 2021-005464-21)]. Consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes no momento da inscrição. Os critérios de inclusão para todas as participantes foram idade >18 anos e para o sexo feminino o uso de contracepção segura. Os critérios de exclusão para pacientes com doença de Wilson foram cirrose descompensada, escore Model for End-stage Liver Disease (MELD) >11 ou escore de Nazer modificado >6. Os critérios de exclusão para todas as participantes foram hipersensibilidade conhecida a ⁶⁴ou outros ingredientes na fórmula traçadora, gravidez, amamentação ou desejo de engravidar antes do final do estudo.

1. Preparação de ⁶⁴CuCl₂

1. Dissolver ^{o sólido 64}CuCl₂ em ácido clorídrico (0,1 M) e adicionar tampão acetato de sódio (0,5 M) para aumentar o pH para ~5. Formular com soro fisiológico e filtrar esterilizar a solução, passando-a através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: O tampão acetato de sódio (0,5 M) é produzido a partir de acetato de sódio trihidratado e água estéril que é passada através de um filtro esterilizante de 0,22 μm.
2. Para o controle de qualidade da solução de ⁶⁴CuCl₂ produzida, realizar medição de pH, teste de endotoxina bacteriana, determinação da pureza radioquímica e identificação radionuclídica ^7,8.
3. Armazene o produto em um recipiente de chumbo à temperatura ambiente e mantenha-o em quarentena até que todas as especificações de controle de qualidade tenham sido satisfatoriamente atendidas.
   NOTA: Para o presente estudo, ⁶⁴CuCl₂ foram produzidos com uma pureza radionuclídica ≥99% e uma pureza radioquímica ≥95%. O sólido ⁶⁴CuCl₂, utilizado como matéria-prima, foi obtido de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

2. Preparação do scanner PET

1. Execute uma verificação de qualidade (QC)⁹ no scanner, seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Os CQ devem ser realizados diariamente pela manhã antes dos exames do paciente.

3. Desenho do traçador para injeção intravenosa (IV) e por administração oral (PO)

1. Use luvas de plástico e retire a tampa do recipiente de chumbo.
2. Use pinças longas para desinfetar a membrana de borracha do frasco de vidro contendo traçador dentro do recipiente de chumbo com um cotonete de desinfecção.
3. Use uma pinça para inserir uma cânula curta (~0,5 mm x 16 mm) na membrana para evitar o transbordamento do vácuo dentro do frasco.
4. Use uma pinça para inserir uma cânula mais longa para desenhar. Esta cânula deve ser longa o suficiente para alcançar o fundo do frasco (geralmente 50 mm).
5. Certifique-se de que o calibrador de dose (ver Tabela de Materiais) está calibrado para ⁶⁴. Calcule um volume aproximado para desenhar para o primeiro sorteio.
   OBS: A partir dos relatórios de controle de qualidade química, a quantidade de atividade e o volume do líquido estarão disponíveis, permitindo o cálculo de um volume aproximado a ser sacado.
6. Use luvas de plástico, insira uma seringa de plástico de tamanho adequado na cânula longa e desenhe o volume calculado. Este volume dependerá da concentração de 64 no produto e de quanto ⁶⁴é decidido para o protocolo (ver Cálculos de dose nos resultados representativos).
7. Use uma pinça para segurar a cânula enquanto move a seringa para o calibrador de dose para medir a radioatividade.
8. Continue desenhando até que a quantidade de radioatividade apropriada seja atingida. Aproximadamente 5% do traçador permanecerá na seringa e cânula após a injeção.
   NOTA: O ⁶⁴não deve ser diluído em água salgada, pois o traçador pode precipitar. Assim, a seringa não pode ser enxaguada com água salina após a injeção (isto não é relevante para a administração PO).
9. Com a pinça, aplique uma cânula com tampa (cânula de ~16 mm) para fechar a seringa e guarde-a em um recipiente de chumbo até a aplicação.

4. Aplicação do marcador

1. Injeção intravenosa
   1. Insira uma cânula intravenosa (~22 G, 25 mm), de preferência em uma veia cubital, e enxágue com água salina para garantir a colocação correta.
      NOTA: Uma planilha com o nome do participante, um carimbo ou assinatura para liberação do controle de qualidade do traçador e pontos de tempo e radioatividade para desenho, injeção e sobras do traçador devem estar disponíveis.
   2. Meça a radioatividade na seringa usando o calibrador de dose disponível e anote o tempo e a atividade na planilha.
   3. Transporte a seringa em um recipiente de chumbo até a cabeceira do leito do participante.
   4. Se ocorrer algum transbordamento da injeção, coloque um guardanapo sob o cotovelo do participante para que a radioatividade derramada possa ser medida.
   5. Com uma pinça, retire a tampa/cânula da seringa e, com luvas plásticas, conecte a seringa ao acesso IV. Observe o tempo na planilha e injete em um movimento constante.
      NOTA: Como mencionado anteriormente, a seringa não deve ser enxaguada com soro fisiológico, pois o traçador pode precipitar.
   6. Retire a seringa do acesso IV, coloque a tampa/cânula e coloque-a no recipiente de chumbo com o guardanapo, se necessário.
   7. Enxaguar o acesso IV com água salina.
   8. Observe o tempo e a radioatividade restante na seringa na planilha.
      NOTA: A atividade injetada é calculada como a diferença entre a atividade da seringa antes e depois da injeção, mas usando o protocolo PET scan para corrigir a deterioração. Assim, todos os três momentos (medidas de sorteio, injeção e sobras) e a radioatividade medida no sorteio e as medidas de sobras são inseridos no protocolo PET scan quando o participante é escaneado (ver passo 5).
   9. Destinar as sobras de material de forma adequada, de acordo com as normas de segurança institucional.
   10. Remova o acesso IV. Caso surjam reações alérgicas, deixe o acesso IV por 30 min.
2. Administração oral
   NOTA: Uma planilha com o nome do participante, um carimbo ou assinatura para liberação do controle de qualidade do traçador e pontos de tempo e radioatividade para desenho, administração e sobras do traçador devem estar disponíveis.
   1. Em um copo plástico descartável e macio, despeje cerca de 100 mL de água ou cordial; o ⁶⁴é insípido. Um canudo plástico descartável e um pequeno saco plástico descartável devem estar disponíveis.
   2. Meça a radioatividade na seringa usando o calibrador de dose disponível e anote o tempo e a atividade na planilha.
   3. Transporte a seringa em um recipiente de chumbo até a cabeceira do leito do participante. O participante deve estar sentado em uma cama ou cadeira.
   4. Retire a tampa/cânula da seringa com uma pinça e, usando luvas plásticas, injete o traçador no copo, tomando cuidado para não derramar nenhum. Retire um pouco da água/cordial e injete-a no copo novamente.
   5. Coloque um canudo plástico no copo (isso é para minimizar o risco de transbordamento quando o participante bebe).
   6. Anote o tempo na planilha e deixe o participante beber. O copo deve estar o mais vazio possível.
   7. Coloque o copo e o canudo vazios no saco plástico descartável com a seringa vazia e coloque-os no recipiente de chumbo.
   8. Observe o tempo e meça a radioatividade restante na seringa. Observação na planilha.
      NOTA: A atividade injetada é calculada como a diferença entre a atividade da seringa antes e depois da injeção, mas usando o protocolo PET scan para corrigir a deterioração.
Assim, todos os três momentos (sorteio, injeção e sobras) e a radioatividade medida no sorteio e na medição de sobras são inseridos no protocolo PET scan quando o participante é escaneado (ver Scan).
3. Destinar as sobras de material de forma adequada, de acordo com as normas de segurança institucional.
   NOTA: Observar o participante para reações alérgicas agudas por 30 minutos após a ingestão pode ser apropriado.

5. Varreduras PET

1. Coloque o participante em decúbito dorsal no scanner.
2. Execute uma tomografia computadorizada ou ressonância magnética de visão geral para planejar a região específica a ser examinada durante o PET scan.
3. Observe o tempo de sorteio, injeção e medida de sobras, e a radioatividade no sorteio e na medida de sobras no protocolo PET.
4. Execute a varredura PET seguindo as etapas abaixo.
   OBS: O protocolo PET scan deve ser padronizado em relação à duração do exame e aos parâmetros de reconstrução da imagem para todos os participantes de um mesmo estudo; relatos publicados devem ser seguidos^10,11,12.
   1. Realizar varreduras PET estáticas com um tempo de varredura de 4,5 min/posição de leito por até 24 h após a administração do traçador e 10 min/leito por até 68 h após a administração do traçador (para maiores detalhes, consulte Exame sob os resultados representativos).
      NOTA: Durante a varredura PET dinâmica, o decaimento é continuamente registrado e, posteriormente, segmentado em uma estrutura de quadro. Isso permite a seleção de quadros de intervalos de tempo curtos para enfatizar a dinâmica da distribuição de ⁶⁴e quadros de intervalos de tempo mais longos para priorizar a sensibilidade. Tipicamente, intervalos mais curtos são selecionados logo após a injeção e aumentados gradualmente a partir de¹⁰.

6. Reconstrução de imagens

1. Reconstrua as imagens usando as melhores correções disponíveis para atenuação, dispersão, tempo de voo e função de dispersão de pontos.
   NOTA: Os parâmetros de reconstrução da imagem devem ser cuidadosamente selecionados para otimizar as propriedades da imagem, como recuperação de sinal e sinal-ruído. Para estudos multicêntricos, é fundamental padronizar a qualidade da imagem entre os centros.

7. Análise dos dados

NOTA: O presente estudo descreve um método simples para quantificar o conteúdo de ⁶⁴no fígado. O sinal PET é medido como valor padrão de captação (SUV), a concentração de radioatividade tecidual ajustada para o peso do participante da atividade injetada e/ou quilobecquerel (kBq) por mL de tecido.

1. Baixe dados para um programa adequado, por exemplo, arquivos Dicom, para PMOD.
   NOTA: Existem provavelmente muitos programas diferentes para analisar imagens PET, como Hermes ou PMOD (consulte Tabela de Materiais).
2. Ajustar os tons da TC/RM para diferenciar as estruturas anatômicas.
3. Certifique-se de que o exame anatômico e o PET scan estejam sobrepostos.
4. Trabalhando no plano horizontal com a melhor ressonância magnética ou tomografia computadorizada, localize o fígado e as grandes estruturas.
5. Coloque um volume apropriado de interesse (VOI) ou múltiplas VOIs no fígado.
   NOTA: UM VOI é uma área definida de tecido onde o SUV é medido. Um VOI consiste em múltiplas regiões de interesse (ROIs), que são áreas de tecido em um plano. Muitos programas têm VOIs esféricas como uma pré-configuração, o que significa que múltiplas ROIs (uma em cada plano) não precisam ser desenhadas para constituir uma VOI. O lobo direito do fígado tende a ser mais homogêneo e, portanto, uma boa posição para colocar VOIs.
6. Coloque várias VOIs no lobo direito do fígado em diferentes planos horizontais para obter a medida mais precisa da atividade, pois o SUV pode variar um pouco (~5%) no lobo hepático direito. Calcule o SUV médio desses VOIs.
7. Para quantificar o SUV, por exemplo, em todo o fígado, desenhe ROIs cobrindo todo o volume hepático em cada plano para estudos dosimétricos.
   NOTA: Evite grandes estruturas como artérias e veias ao usar este método.

Resultados

Cálculo da dose
Com base nos cálculos dosimétricos, a dose efetiva de radioatividade para administração IV é de 62 ± traçador de 5 μSv/MBq¹⁰. Assim, recomenda-se uma dose de 50 MBq, dependendo do período de tempo. Até 75-80 MBq é aplicável para exames mais longos e fornece imagens de boa qualidade sem exceder uma dose eticamente aprovada. A dose efetiva para administração oral é de 113 ± traçador de 1 μSv/MBq, devido ao acúmulo intestinal do traçador. Assim...

Discussão

O método é como qualquer outro método PET, mas a longa meia-vida de 12,7 h oferece a oportunidade de investigar fluxos de cobre a longo prazo (temos bons resultados de até 68 h após a injeção IV do traçador). Todas as etapas do protocolo devem ser manuseadas por pessoal familiarizado com PET, embora não sejam mais críticas do que qualquer outro exame PET.

Solucionando problemas
Como muitas vezes usamos ⁶⁴para investigações de longo prazo, o sinal PET ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 micrometer sterilizing filter	Merck Life Science
Cannula 21 G 50 mm	BD Microlance	301155
Cannula 25 G 16 mm	BD Microlance	300600
Dose calibrator	Capintec CRC-PC calibrator
PET/CT scanner	Siemens: Biograph
PET/MR scanner	GE Signa
PMOD version 4.0	PMOD Technologies LLC
Saline solution 0.9% NaCl	Fresenius Kabi
Sodium acetate trihydrate BioUltra	Sigma Aldrich	71188
Solid 64CuCl2	Danish Technical University Risø
Sterile water	Fresenius Kabi
Venflon 22 G 25 mm	BD Venflon Pro Safety	393280