Extração de Microtúbulos Modificados de Células de Mamíferos para Estudo de Complexos Microtúbulo-Proteína por Microscopia Crio-Eletrônica

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para extrair tubulina endógena de células de mamíferos, que podem não possuir ou conter enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obter microtúbulos enriquecidos para uma modificação específica. Em seguida, descrevemos como os microtúbulos extraídos podem ser decorados com proteínas purificadas de ligação a microtúbulos para preparar grades para microscopia crio-eletrônica.

Resumo

Os microtúbulos são uma parte importante do citoesqueleto e estão envolvidos na organização intracelular, divisão celular e migração. Dependendo das modificações pós-traducionais, os microtúbulos podem formar complexos com várias proteínas interagentes. Estes complexos microtúbulo-proteína estão frequentemente implicados em doenças humanas. O entendimento da estrutura de tais complexos é útil para elucidar seus mecanismos de ação e pode ser estudado por criomicroscopia eletrônica (crio-EM). Para a obtenção de tais complexos para estudos estruturais, é importante extrair microtúbulos contendo ou não modificações pós-traducionais específicas. Neste trabalho, descrevemos um protocolo simplificado para extração de tubulina endógena de células de mamíferos geneticamente modificadas, envolvendo polimerização de microtúbulos, seguida de sedimentação por ultracentrifugação. A tubulina extraída pode então ser usada para preparar grades de microscópios crio-eletrônicos com microtúbulos que estão ligados a uma proteína purificada de ligação a microtúbulos de interesse. Como exemplo, demonstramos a extração de microtúbulos totalmente tirosinados, de linhagens celulares projetadas para não possuir as três enzimas destirosinantes de tubulina conhecidas. Esses microtúbulos são então usados para fazer um complexo proteico com tubulina detirosinase associada a microtúbulos enzimaticamente inativos em grades crio-EM.

Introdução

Os microtúbulos são uma parte crucial do citoesqueleto; Eles estão envolvidos em diferentes funções, como migração e divisão celular, mas também contribuem para a organização intracelular. Para se adaptar a diferentes destinos funcionais, os microtúbulos interagem com uma variedade de proteínas associadas a microtúbulos (MAPs), enzimas e outras proteínas, que coletivamente chamaremos de "proteínas que interagem com microtúbulos". A ligação dos microtúbulos dessas proteínas pode ser guiada por diferentes modificações da tubulina, comumente referida como o "código da tubulina"¹. Exemplos dessa preferência são a cinesina associada a centrômeros mitóticos (MCAK)2 e o domínio CAP-Gly dineína-dinactina de p150³, que se associam preferencialmente à tubulina tirosinada, enquanto os motores cinesina proteína E associada ao centrômero (CENP-E)⁴ e cinesina-2⁵ preferem a tubulina que não possui a tirosina C-terminal.

Enquanto uma variedade de métodos pode ser empregada para estudar interações microtúbulo-proteína, a microscopia crioeletrônica (crio-EM) é frequentemente usada para estudar essas interações em resolução quase atômica ^6,7. Nos últimos anos, estruturas crio-EM têm revelado grandes proteínas motoras como a dineína ^8,9,10 e cinesina¹¹, proteínas +TIP como EB3^12,13 e MCAK 14, outras proteínas como Tau ^15,16 e até moléculas pequenas como paclitaxel, peloruside e zampanolide ¹⁷ interagem com microtúbulos. Para estudar as interações microtúbulo-proteína, os microtúbulos são tipicamente extraídos do cérebro suíno¹⁸. Em seguida, a maioria dos estudos in vitro, incluindo estruturas de microtúbulos crio-EM, é realizada usando tubulina cerebral suína. Os resultados desses estudos, portanto, obscurecem a importância da natureza heterogênea das modificações da tubulina¹⁹ entre tecidos e tipos celulares. Isso cria um problema particular ao investigar uma proteína que requer ou prefere uma modificação específica para se ligar aos microtúbulos. Isso pode ser ilustrado com tubulina tirosinada, o substrato para a microtúbulo detirosinase MATCAP.

A destirosinação é uma modificação da tubulina na qual o aminoácido C-terminal tirosina da α-tubulina está ausente, o qual está associado à função mitótica, cardíaca e neuronal²⁰. Embora os microtúbulos totalmente tirosinizados sejam o substrato ideal para a MATCAP, esta está amplamente ausente nos microtúbulos comercialmente disponíveis do cérebro suíno devido à função das vasohibinas 21,22 e MATCAP 23 destirosinases nesse tecido 22,23,24,25,26. Embora a HeLa tubulina comercialmente disponível contenha principalmente microtúbulos tirosinados, a destirosinação pode ocorrer, e esta fonte de tubulina é, portanto, menos adequada para criar uma amostra uniforme para análise crio-EM.

Para estimular a ligação do MATCAP aos microtúbulos e criar uma amostra homogênea para análise estrutural, buscamos uma fonte de microtúbulos totalmente tirosinada. Para isso, foi criada uma linhagem celular deficiente em MATCAP e vasohibina, que foi usada para extrair microtúbulos totalmente tirosinados. O procedimento de extração foi baseado em protocolos bem estabelecidos que utilizam ciclos repetidos de polimerização e despolimerização dos microtúbulos para extrair tubulina do tecido cerebral ou das células 18,27,28,29,30^, com apenas uma etapa de polimerização e centrifugação sobre um coxim de glicerol. Usando MATCAP como exemplo, demonstramos como esses microtúbulos podem ser usados para estudos de crio-EM. Para a preparação de grades crio-EM, um protocolo de aplicação em duas etapas com baixa concentração de sal é descrito. Os métodos neste artigo descrevem a extração de microtúbulos personalizáveis em quantidades e pureza suficientes para realizar análises crio-EM e fornecem um protocolo detalhado sobre como usar esses microtúbulos para criar complexos proteína-microtúbulos em grades crio-EM.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Cultura celular

NOTA: Toda a cultura celular deve ser feita em uma capela de fluxo laminar estéril.

1. Para seguir esse protocolo, primeiro descongele um frasco de células congeladas em banho-maria a 37 °C. Aqui, usamos uma linhagem celular HCT116 geneticamente modificada que não possui as três enzimas destirosinantes conhecidas, VASH1, VASH2 e MATCAP, para criar tubulina tirosinada.
2. Preparar uma placa de Ø 10 cm contendo 10 mL do meio de cultura celular apropriado.
   NOTA: Neste protocolo, DMEM (meio Dulbecco's modified Eagle) suplementado com 10% v/v FCS (soro fetal de bezerros) e antibiótico penicilina/estreptomicina (meio de cultura) foi utilizado para a linhagem celular HCT116 geneticamente modificada.
3. Conte as células e semeie ~2,5 × 10⁶ células viáveis (~20% de confluência) na placa preparada de 10 cm. Agite a placa suavemente para distribuir uniformemente as células. Incubar a placa em uma estufa de cultura celular a 37 °C gaseificado com 5% (v/v) de CO₂ até que as células atinjam 80%-90% de confluência.
   NOTA: Normalmente, isso leva 3 dias para células HCT116, mas o tempo pode depender da densidade de semeadura específica e da linha celular usada.
4. Descarte o meio de cultura celular com pipeta ou aspirador a vácuo e lave a placa 2 x 5 mL de PBS.
   NOTA: Tome cuidado para não dispensar o PBS com muita força na monocamada celular, pois isso poderia separar as células da placa.
5. Adicionar 1-2 mL de tripsina e incubar as células na incubadora por 2-5 min para desanexar as células.
6. Adicionar 2 mL do meio de cultura à placa para extinguir a tripsina.
7. Dividir a suspensão celular em três a cinco partes iguais e resemeá-las para expandir as células em meio de cultura até obter 6-12 placas confluentes de 15 cm.

2. Colheita

1. Lave suavemente as células com 10 mL de PBS (1x) para remover qualquer meio de cultura celular.
2. Separar as células das placas incubando-as por 5 min à temperatura ambiente com 3 mL de PBS gelado suplementado com EDTA 5 mM (estéril/filtrado) e, posteriormente, usando um raspador celular.
3. Coletar as células em um tubo de 50 mL sobre gelo e girar para baixo (10 min, 250 × g).
   1. Observar o volume das células colhidas com a escala volumétrica no tubo de 50 mL.
      NOTA: O volume esperado pode estar entre ~0,5 mL e 4 mL. PASSO DE PAUSA: Congele o pellet de célula em LN2 e armazene a -20 °C até o uso. Observe que o pellet de célula pode ser armazenado apenas por algumas semanas ou meses. Se o pellet for mantido por mais tempo, isso pode resultar em um rendimento diminuído ou nenhum microtúbulo.

3. Extração de microtúbulos

NOTA: Mantenha tudo para as etapas 3.1-3.5 no gelo; tudo a partir do passo 3.6 deve ser mantido aquecido (30-37 °C).

1. Preparar 10 mL de tampão de lise gelada contendo 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl₂, 1 mM PMSF e um comprimido inibidor de protease (mini).
2. Ressuspenda a pastilha de células colhidas em tampão de lise 1:1 v/v (em caso de dúvida sobre o volume exato, tome menos tampão de lise em vez de mais).
3. Lise as células por sonicação: 15 s on, 45 s off, amp 30, quatro ciclos (determinar as condições experimentalmente, e mudar de acordo com o sonicator).
   1. Após a sonicação, coletar uma amostra para análise de SDS-PAGE: 2 μL de lisado + 18 μL de água + 5 μL de tampão de amostra 5x SDS.
      NOTA: Verifique sob um microscópio de luz padrão se as células realmente lisaram completamente.
4. Pipetar as células lisadas para um tubo centrífugo. Gire por 1 h a 100.000 × g a 4 °C em um rotor ultracentrífugo para limpar o lisado.
   NOTA: Certifique-se de que todos os bolsos do rotor estejam secos e limpos para garantir o balanceamento correto da centrífuga.
5. Use uma seringa para retirar o lisado limpo. Tome cuidado para não atrapalhar o pellet, bem como a camada flutuante na parte superior.
   1. Recolher uma amostra do lisado limpo: 2 μL de lisado + 18 μL de água + 5 μL de tampão de amostra 5x SDS.
   2. Enxágue cuidadosamente o pellet e retire um pouco do pellet girando uma ponta de pipeta P10 através do pellet; adicionar 200 μL de água e 50 μL de tampão SDS.
6. Complementar o sobrenadante da etapa anterior com 1 mM de GTP e 20 μM de paclitaxel para polimerizar os microtúbulos; para um volume de 1 mL, adicionar 10 μL de 2 mM de paclitaxel e 10 μL de 100 mM de GTP.
   CUIDADO: Paclitaxel pode causar irritação da pele, danos oculares graves, irritação respiratória, defeitos genéticos, danos ao feto e danos aos órgãos. A exposição prolongada ou repetida causa danos aos órgãos. Não respire, borrife ou polvilhe a substância de forma alguma. Use luvas de borracha nitrílica para evitar o contato com a pele.
7. Incubar o sobrenadante suplementado com GTP/paclitaxel durante 30 min a 37 °C para permitir a montagem dos microtúbulos.
8. Durante esta etapa de incubação, deixe o rotor e a ultracentrífuga aquecerem até 30 °C.
9. Prepare o tampão da almofada: Adicionar 0,6 mL de glicerol a 0,4 mL de tampão de lise e complementar a mistura com 20 μM de paclitaxel. Pré-aqueça o tampão da almofada a 37 °C.
10. Adicionar 800 μL de tampão de almofada a um tubo de ultracentrífuga. Pipetar cuidadosamente o lisado suplementado com GTP/paclitaxel por cima do tampão da almofada.
    NOTA: Evite a mistura do tampão da almofada e do lisado pipetando muito suavemente.
11. Gire por 30 min a 100.000 × g a 30 °C em um rotor ultracentrífugo. Marque a borda externa do tubo de centrifugação para reconhecer facilmente onde o pellet de microtúbulo deve se formar.
12. Retire o tampão da almofada cuidadosamente usando uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar o pellet de microtúbulo.
    1. Recolher uma amostra do tampão da almofada: 2 μL + 18 μL de água + 5 μL de tampão de amostra 5x SDS.
13. Lave o pellet cuidadosamente 3x com tampão de lise morno para remover o glicerol. Distribua suavemente o tampão quente ao lado do pellet (não lavando o líquido diretamente sobre o pellet), gire o tubo algumas vezes para remover o máximo de glicerol possível do pellet e das paredes do tubo e, em seguida, aspirar e repetir.
    NOTA: Se o glicerol não for lavado corretamente, a grade derreterá muito rapidamente sob a iluminação eletrônica. Isso pode ser evidenciado pelo alto movimento de partículas, criando imagens borradas.
14. Prepare o tampão de ressuspensão com os seguintes ingredientes: tubos de 100 mM/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH e 1 mM MgCl₂ e aqueça o tampão a 37 °C.
15. Ressuspenda o pellet lavado suavemente com uma ponta de corte em ~50 μL de tampão de ressuspensão pré-aquecido e mantenha o tubo a 37 °C.
    1. Coletar uma amostra da fração de pastilha ressuspensa: 2 μL + 18 μL de água + 5 μL de tampão de amostra 5x SDS.
       DICA: A ponta de corte evita a quebra dos microtúbulos. Prepare um bloco de aquecimento metálico a 37 °C e guarde-o numa caixa de poliestireno para que os tubos de amostra possam ser transportados facilmente sem os arrefecer até à temperatura ambiente.

4. Preparação da grade Cryo-EM

1. Prepare o dispositivo congelador de imersão instalando o papel mata-borrão. Aqueça o congelador de imersão até 30 °C e ajuste a umidificação a 100%. Deixe ~30 min para equilibrar a temperatura e umidade.
2. Prepare as configurações do congelador de imersão para dois aplicativos e execute todo o programa uma vez para ter certeza de que as configurações estão definidas corretamente. Certifique-se de que o primeiro aplicativo tenha uma força de 10, 2 s de tempo de blot e 0 s de tempo de espera e que o segundo aplicativo tenha uma força de 10, 6,5 s de tempo de blot e 10 s de tempo de espera.
3. Descarga de brilho das grades crio-EM a 30 mA por 60 s.
4. Resfrie o conjunto do recipiente de poliestireno com LN2 e prepare o etano líquido em um copo de metal condensando o gás etano em um copo de metal frio.
5. Preparar um tampão de diluição com os seguintes componentes: tubos de 100 mM/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH e 1 mM MgCl₂ e aquecê-lo a 37 °C.
6. Diluir a proteína de interação com microtúbulos 1:1 v/v com tampão de diluição imediatamente antes de aplicá-la nas grades para garantir que a concentração de sal seja reduzida (usamos uma concentração final de sal de 50 mM de NaCl). Manter a mistura a 37 °C.
7. Pegue uma grade descarregada com pinça de mergulho e clique-as no congelador de imersão.
8. Posicione o recipiente de poliestireno com etano líquido no congelador de imersão e percorra o programa preparado: primeiro aplique 3,5 μL de solução de microtúbulos na grade, deixe o congelador de imersão manchar a grade, em seguida, aplique imediatamente 3,5 μL de proteína recém-diluída e, por último, deixe o êmbolo manchar e mergulhe congelando a grade em etano líquido.
9. Transfira as grades para uma caixa de armazenamento de grade e armazene-as em um dewar LN2 até a geração de imagens.

Resultados

Investigamos a tubulina destirosinase MATCAP ligada a microtúbulos tirosinados, por crio-EM. Para isso, extraímos microtúbulos totalmente tirosinados, de uma linhagem celular HCT116 geneticamente modificada, sem as três enzimas destirosinantes conhecidas, VASH1/2 e MATCAP. Foram utilizadas 6-12 placas confluentes de 15 cm para extrair os microtúbulos de aproximadamente 0,5-4 mL de pellet celular (Figura 1). Após a segunda etapa de centrifugação (etapa 3.11), obtém-se um pellet visível, porém pequeno e transparente (Figura 1I). O rendimento dos microtúbulos é tipicamente de ~75 μg. Se o pellet não estiver visível, isso pode indicar um problema em uma das etapas anteriores, como uma temperatura incorreta de polimerização de microtúbulos, problemas com a qualidade do GTP ou paclitaxel usados, ou a adição de muito tampão de lise, resultando em uma concentração de tubulina muito baixa para polimerização. Para avaliar a qualidade e concentração dos microtúbulos extraídos, analisamos amostras em gel de SDS corado com Coomassie (Figura 2A). Essas análises indicaram que os microtúbulos extraídos eram relativamente puros. A concentração de microtúbulos interpolados derivada da quantificação de BSA foi de ~1,4 mg/mL. Isso concorda bem com o número medido com espectrofotômetro (Figura 2B,C).

Os microtúbulos recém-extraídos podem ser usados diretamente para fazer amostras para crio-EM. Os microtúbulos devem parecer intactos e abundantes nas micrografias. Para uma análise mais aprofundada do crio-EM, é fundamental ter uma baixa densidade de microtúbulos por micrografia para evitar que os microtúbulos se cruzem entre si (Figura 3A). Microtúbulos quebrados ou que não são visíveis podem indicar que os microtúbulos despolimerizados (por exemplo, devido a uma baixa temperatura ou hidrólise de GTP) ou que os parâmetros de blotting e plunge freezing não foram ajustados corretamente. O fundo ao redor dos microtúbulos é denso, presumivelmente com tubulina não polimerizada.

O peso molecular do MATCAP é de 53 kDa, e ele tem um domínio catalítico globular logo abaixo do tamanho de um monômero de tubulina. A decoração do MATCAP no microtúbulo poderia, portanto, ser detectada visualmente. Os microtúbulos que não se ligaram ao MATCAP apresentaram bordas "lisas", enquanto os microtúbulos que se ligaram ao MATCAP apresentaram bordas "rugosas", caracterizadas por pontos elétron-densos na superfície dos microtúbulos (Figura 3B). Microtúbulos ligados a MATCAP e não ligados a MATCAP também puderam ser distinguidos nas classes 2D calculadas, embora devido à forma e tamanho, isso possa diferir para outras proteínas que interagem com microtúbulos (Figura 3C). Para confirmar que a densidade realmente pertence à proteína de interesse, pode-se tirar proveito de estruturas experimentalmente determinadas ou previstas. Também sugerimos fazer uma grade de controle que contenha microtúbulos apenas para comparação. Isso indica se os microtúbulos foram polimerizados e extraídos intactos em uma concentração suficientemente alta e se o processo de congelamento por imersão foi executado corretamente. Observou-se que a abundância de microtúbulos diminuiu nas grades com a segunda aplicação de MATCAP.

Figura 1: Orientação visual das etapas experimentais. (A) Pelotização celular antes da lise; (B) células sonicadas em tubo de ultracentrífuga antes da centrifugação; (C) células sonicadas em tubo de ultracentrífuga após centrifugação; (D) seringa com o sobrenadante limpo; (E) pellet residual após remoção do sobrenadante, incluindo uma "camada flutuante branca"; (F) Ponteira P10 com pellet de detritos celulares para o gel de Coomassie SDS; (G) Sobrenadante suplementado com GTP/paclitaxel antes da incubação; (H) sobrenadante incubado com GTP/paclitaxel sobre uma almofada de glicerol em um tubo de ultracentrífuga; (I) pastilha limpa de microtúbulos após a segunda etapa de centrifugação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Determinação da pureza e concentração dos microtúbulos . (A) Gel de página SDS corado com Coomassie mostrando as amostras colhidas durante o protocolo de extração e uma comparação da concentração de BSA. S1 e P1 correspondem ao sobrenadante e ao pellet após a primeira etapa de centrifugação, respectivamente. S2 e P2 correspondem similarmente à segunda etapa de centrifugação. (B) Uma linha de regressão não linear das quantidades relativas de BSA derivadas de A. A interpolação da banda de microtúbulos em torno de 50 kDa na faixa P2 (microtúbulos) indica uma concentração final de 1,42 mg/mL. (C) A análise espectrofotométrica dos microtúbulos ressuspendidos (P2) medidos por duas pessoas e corrigidos pelo coeficiente de extinção combinado de TUBA1A e TUBB3 (0,971) indica uma concentração média e desvio padrão de 1,46 mg/mL ± 0,14 mg/mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplo de micrografias. (A) Exemplo de micrografias mostrando microtúbulos ligados ao MATCAP. Os microtúbulos indicados por uma caixa verde estão intactos, decorados, e podem ser usados para a análise crio-EM. O microtúbulo indicado pela caixa laranja é um microtúbulo intacto e decorado, mas está posicionado próximo aos microtúbulos à esquerda dele; portanto, é menos adequado para incluir na análise crio-EM. Os microtúbulos na caixa vermelha estão cruzando e quebrados. Estes devem ser excluídos da análise crio-EM. (B) Uma visão ampliada do microtúbulo verde circundado do painel esquerdo. As pontas de seta vermelhas indicam os pontos pretos que só apareceram nos microtúbulos nas micrografias que tiveram aplicação de MATCAP e, portanto, provavelmente correspondem a MATCAP ligado ao microtúbulo. (C) Exemplo de classes 2D de partículas de microtúbulos escolhidas de A que mostraram alta e baixa decoração e uma classe 2D de um conjunto de dados diferente para o qual não observamos nenhuma decoração por MATCAP (painel mais à direita). Barras de escala = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise imunoblot de microtúbulos derivados de células HCT116 HCT116 com deficiência de MATCAP e VASH1/2 com nocaute triplo (TKO), cérebro suíno comercial e tubulina HeLa. Abreviações: nocaute técnico = nocaute triplo; mAb = anticorpo monoclonal; pAb = anticorpo policlonal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este método descreve como extrair rapidamente tubulina endógena de linhagens celulares e, posteriormente, decorar esses microtúbulos em grades crio-EM. Os microtúbulos são sensíveis à temperatura. Despolimerizam em ambiente frio e polimerizam em ambiente quente³¹. Portanto, é fundamental executar o spin de sonicação e depuração (passos 1.1-1.5) a 4 °C para solubilizar a tubulina. Se algum fator estivesse estabilizando tão bem os microtúbulos que eles não se despolimerizassem nessa etapa, esses microtúbulos e os fatores estabilizadores seriam descartados no pellet após o giro inicial da folga. Após a (re)polimerização dos microtúbulos, é importante manter a solução contendo os microtúbulos polimerizados sempre aquecida. Extraímos os microtúbulos das células HCT116, que são deficientes nas proteínas VASH1, VASH2 e MATCAP. Outras linhagens celulares, assim como tecidos, podem ser usados para extrair microtúbulos²⁹, embora os contaminantes, os isótipos de tubulina e o rendimento possam ser muito diferentes do que é descrito aqui. Plasmídeos superexpressando que contêm enzimas modificadoras também podem ser usados para introduzir modificações específicas na tubulina.

Outros protocolos 18,27,28,29,30 utilizam múltiplos ciclos de polimerização e despolimerização dos microtúbulos para obter microtúbulos livres de outras proteínas interagentes. Aqui, simplificamos esses protocolos e polimerizamos os microtúbulos apenas uma vez. É possível que, devido a essa polimerização única, esses microtúbulos possam co-sedimentar com outras proteínas que interagem com microtúbulos. No entanto, descobrimos que este protocolo fornece microtúbulos suficientemente puros para fins de crio-EM. Se uma amostra mais pura for necessária para ensaios específicos, ciclos adicionais de polimerização e despolimerização poderiam produzir uma amostra mais pura, embora isso possa ser às custas do rendimento de microtúbulos. Neste protocolo, utilizou-se paclitaxel para polimerizar os microtúbulos. No entanto, o paclitaxel poderia enviesar a rede de microtúbulos em direção a uma certa torção e elevação, o que poderia interferir com a afinidade dos microtúbulos da proteína de interesse. Outros reagentes estabilizadores de microtúbulos podem ser usados se o paclitaxel não for adequado; exemplos desses reagentes são moléculas não taxânicas, como o pelorusídeo, ou variantes de GTP não hidrolisáveis, como o GMPCPP^17,32.

Para investigar estruturalmente proteínas que se ligam a microtúbulos em grades crio-EM, é necessário ligar uma quantidade suficiente da proteína de interesse aos microtúbulos. Um problema comum é que os complexos de proteínas que são estáveis em solução se desfazem na grade. Para formar o complexo proteico na grade, foi crucial primeiro camuflar os microtúbulos e, em seguida, aplicar a proteína de ligação aos microtúbulos com baixa concentração de sal na grade revestida de microtúbulos, montando assim o complexo proteico diretamente na grade. Outros relataram similarmente um protocolo com baixo teor de sal 33,34 e um protocolo de aplicação em duas etapas^34,35,36 para decoração bem sucedida de microtúbulos. É provável que uma menor concentração de sal enviese o complexo proteico em direção a uma interação mais estável devido à diminuição das cargas eletrostáticas. No entanto, devido à baixa concentração de sal, a proteína de interesse está em risco de precipitação. Portanto, é altamente recomendável manter a proteína em ou em torno de concentrações de sal fisiologicamente relevantes até pouco antes de vitrificação das grades. Este protocolo de aplicação em duas etapas provavelmente evita que o complexo proteico se desfaça durante as etapas de blotting ou plunge-freezing. Neste protocolo, utilizamos o Vitrobot. No entanto, métodos de vitrificação mais rápidos (VitroJet) ou o uso de grades livres de manchas (Puffalot) ou dispositivos que têm ambas as propriedades (camaleão) poderiam potencialmente superar a aplicação em duas etapas, mas estes não estão atualmente amplamente disponíveis para teste.

A resolução final da densidade crio-EM reconstruída pode ser afetada por uma série de fatores, incluindo o movimento da proteína ligadora de microtúbulos em relação ao microtúbulo e o nível de decoração que pode ser alcançado. Uma maior decoração de microtúbulos é provavelmente benéfica para a resolução final obtida na reconstrução da densidade 3D. Isso pode ser limitado por alguns fatores, como a maior concentração de proteína que é obtida durante a purificação da proteína de ligação de microtúbulos, a menor concentração de sal que a proteína de interação com microtúbulos pode suportar sem se agregar e o modo de ligação da proteína de interação com microtúbulos (por exemplo, a proteína pode abranger mais de um dímero de tubulina, dificultando assim uma relação de ligação de 1:1). Embora a resolução da reconstrução crio-EM possa estar comprometida por microtúbulos esparsamente decorados, a análise computacional pode contornar muitos problemas, como exemplificado por uma estrutura do complexo microtúbulo-proteína recentemente relatada que foi extremamente escassamente decorada⁸.

O protocolo que descrevemos aqui apresenta um método rápido e de baixo custo para a obtenção de microtúbulos adequados para fins de crio-EM. Em contraste com a tubulina cerebral suína comercialmente disponível, os microtúbulos derivados de células HCT116 deficientes em MATCAP e vasohibina são totalmente tirosinados (Figura 4). A tubulina HeLa comercial, um reagente caro, em princípio, é relativamente uniformemente tirosinada e contém poucas outras modificações⁴ , como a glutamilação, mas os lotes podem variar, e a modificação só poderia ser alcançada in vitro. Uma vantagem de extrair microtúbulos de linhagens celulares feitas sob medida é a flexibilidade que se tem para superexpressar ou excluir enzimas modificadoras da tubulina, como a tubulina detirosinases, para criar um pool mais homogêneo de microtúbulos. Isso pode beneficiar a decoração e uniformidade da amostra de crio-EM e, em última análise, beneficiará a facilidade e a qualidade dos mapas de densidade crio-EM e estruturas moleculares derivadas desta amostra.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Cell culture
10 cm plate	Falcon	353003	Cell culture
15 cm plate	Thermo FisherScientific	168381	Cell culture
50 mL tubes	Sarstedt	62.547255	Cell culture
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools	N1-C14nCu30-01	Cryo-EM grid preparation
Cell scrapers	Falcon	353085	Cell culture
DMEM	Gibco	41966-029	Cell culture
EDTA	Merck	108418	Cell culture
EGTA	Sigma Aldrich	E3899	Microtubule extraction
Ethane gas			Cryo-EM grid preparation
FCS	Serana	s-FBS-EU-015	Cell culture
Glycerol	VWR	24.397.296	Microtubule extraction
GTP	Fisher Scientific	G8877-1G	Microtubule extraction
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells	self made	Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291	Cell culture
KOH	Merck	1.05033	Microtubule extraction
MgCl2	Merck	105833	Microtubule extraction
Microtubule binding protein	self made		Cryo-EM grid preparation
Needle	BD microlance	300600	Microtubule extraction
Paclitaxel	Santa Cruz Biotechnology	sc-212517	caution toxic, microtubule extraction
PBS	Fisher Scientific	BP399	Cell culture
Penicillin and streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100mL	Cell culture
PIPES	Merck	P8203	Microtubule extraction
PMSF (in EtOH)	Roche	16837091001	Microtubule extraction
SDS sample buffer	self made		Quality assessment
Syringe	BD plastipak	309658	Microtubule extraction
Ultra protease tables mini	Fisher Scientific	NC0975224	Microtubule extraction
Whatman blotting paper	Whatman	47000-100	Cryo-EM grid preparation
Equipment
Flow hood			cell culture
GloQube	Quorum		Cryo-EM grid preparation
Grid storage box	SWISSCI	41018	Cryo-EM grid storage
Heating block, electric or metal			to warm the buffers
Incubator, cell culture	NUAIR		cell culture
LN2 dewar			Cryo-EM grid storage
Plunge-tweezers	Electron Microscopy Sciences	0508-L5-PS	Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot
Polystyrene box			to keep the buffers warm
Sonicator	Qsonica	Q700	Microtubule extraction
Standard light microscope	Olympus	CKX 41	Quality assessment
TLA 100.3 rotor	Beckman Coulter		Microtubule extraction
TLA 120.2 rotor	Beckman Coulter		Microtubule extraction
Tubes for TLA 100.3 rotor	Beckman Coulter	326819	Microtubule extraction
Tubes for TLA 120.2 rotor	Beckman Coulter	347356	Microtubule extraction
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Microtubule extraction
Vitrobot	FEI, ThermoFischer Scientific	mark IV	Cryo-EM grid preparation
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup	ThermoFisher Scientific	200703	Cryo-EM grid preparation
Water bath			cell culture