Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Resumo

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Resumo

Os Tumores Malignos de Bainha de Nervo Periférico (MPNSTs) são derivados das células de Schwann ou de seus precursores. Em pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), os MPNSTs são a neoplasia maligna mais comum e a principal causa de morte. Esses sarcomas de partes moles raros e agressivos oferecem um futuro promissor, com taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos de 34-60%. As opções de tratamento para indivíduos com MPNSTs são decepcionantemente limitadas, sendo a cirurgia desfigurante a principal opção de tratamento. Muitas terapias outrora promissoras, como o tipifarnibe, um inibidor da sinalização de Ras, falharam clinicamente. Da mesma forma, ensaios clínicos de fase II com erlotinib, que tem como alvo o fator de crescimento epidérmico (EFGR), e sorafenib, que tem como alvo o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o Raf, em combinação com a quimioterapia padrão, também falharam em produzir resposta nos pacientes.

Nos últimos anos, métodos de triagem genômica funcional combinados com o perfil genético de linhagens de células cancerosas têm se mostrado úteis para a identificação de vias essenciais de sinalização citoplasmática e o desenvolvimento de terapias alvo-específicas. No caso de tipos raros de tumores, uma variação dessa abordagem conhecida como oncogenômica comparativa entre espécies está sendo cada vez mais usada para identificar novos alvos terapêuticos. Na oncogenômica comparativa entre espécies, o perfil genético e a genômica funcional são realizados em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) e os resultados são validados em espécimes humanos raros e linhagens celulares disponíveis.

Este artigo descreve como identificar mutações no gene driver candidato em células MPNST humanas e de camundongos usando o sequenciamento completo do exoma (WES). Em seguida, descrevemos como realizar telas de shRNA em escala genômica para identificar e comparar vias críticas de sinalização em células MPNST humanas e de camundongos e identificar alvos farmacológicos nessas vias. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz para identificar novos alvos terapêuticos em uma variedade de tipos de câncer humano.

Introdução

Os tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são neoplasias de células fusiformes altamente agressivas que surgem em associação com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), esporadicamente na população geral e em locais de radioterapia ^prévia1,2,3. Os pacientes com NF1 nascem com uma cópia selvagem do gene supressor de tumor NF1 e um segundo alelo NF1 com uma mutação de perda de função. Esse estado de haploinsuficiência torna os pacientes com NF1 suscetíveis a uma segunda mutação de perda de função em seu gene NF1 selvagem, que desencadeia a tumorigênese. Quando essa mutação NF1 de "segundo impacto" ocorre em uma célula da linhagem celular de Schwann, o tumor resultante é um neurofibroma dérmico que surge na pele ou um neurofibroma plexiforme que se desenvolve em grandes nervos ou plexos nervosos. Embora a patologia dos neurofibromas dérmicos e plexiformes seja idêntica, seu comportamento biológico é bastante diferente - embora os neurofibromas dérmicos e plexiformes sejam benignos, apenas os neurofibromas plexiformes podem sofrer transformação e dar origem aos MPNSTs. Além da perda de neurofibromina, a proteína ativadora da GTPase Ras codificada pelo gene NF1, as MPNSTs carregam mutações de vários outros genes supressores de tumor, incluindo TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 e PTEN 10, mutações de genes que codificam componentes do complexo repressivo policomb 2 11,12 (PRC2; o genes SUZ12 e EED) e expressão aberrante do receptor tirosina quinases ^1,2. Mutações da NF1 e dos demais genes citados acima também estão presentes em MPNSTs esporádicas e induzidas por radiação^11,12.

Embora esses avanços em nossa compreensão das anormalidades genômicas em MPNSTs tenham sido inestimáveis para a compreensão de sua patogênese, eles ainda não resultaram no desenvolvimento de novas terapias eficazes para MPNSTs. Uma grande barreira que impede o desenvolvimento de novos tratamentos é o fato de que os MPNSTs são cânceres raros. Devido a isso, é difícil obter o grande número de amostras de pacientes que são necessárias para análises globais que definem mutações chave como as realizadas pelo Atlas do Genoma do Câncer (TCGA). Em nossa experiência, acumular até mesmo um número modesto de espécimes humanos de MPNST pode levar anos. Para superar tais limitações, muitos pesquisadores que estudam outros tipos raros de câncer têm se voltado para o uso de oncogenômica comparativa entre espécies para identificar mutações genéticas condutoras essenciais, definir as vias de sinalização citoplasmáticas essenciais em seu tumor de interesse e identificar novos alvos terapêuticos. Uma vez que as vias de sinalização essenciais para a tumorigênese são altamente conservadas entre humanos e outras espécies de vertebrados, a aplicação de abordagens genômicas funcionais, como telas de shRNA em escala genômica, pode ser um meio eficaz de identificar essas novas mutações condutoras, vias de sinalização e alvos terapêuticos 13,14,15,16,17,18,19 , particularmente quando se estudam tipos raros de tumores humanos que estão disponíveis em números limitantes²⁰.

Nas metodologias aqui apresentadas, descrevemos essa abordagem para realizar o perfil genômico em linhagens celulares humanas de MPNST e culturas de MPNST de passagem precoce derivadas de camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de camundongo geneticamente modificado (GEM) no qual a superexpressão específica de células de Schwann do fator de crescimento neuregulina-1 (NRG1) promove a patogênese dos neurofibromas plexiformes e sua subsequente progressão para MPNSTs ^{21, 22,23}. O primeiro passo nesta abordagem é identificar genes condutores candidatos em MPNSTs P 0-GGFβ3, linhagens celulares MPNST humanas e MPNSTs humanas ressecadas cirurgicamente. Para validar funcionalmente as vias de sinalização afetadas por essas mutações, usamos telas de shRNA em escala genômica para identificar os genes necessários para a proliferação e sobrevivência em linhagens celulares MPNST humanas e de camundongos. Depois de identificar os genes necessários para a proliferação e sobrevivência, identificamos os produtos gênicos farmacológicos dentro da coleção de "hits" usando o Drug Gene Interaction Database. Nós também comparamos os "hits" em células MPNST humanas e de camundongos, para determinar se o modelo GEM e MPNSTs humanos demonstram dependência semelhante dos mesmos genes e vias de sinalização. A identificação de sobreposições nos genes necessários para a proliferação e sobrevivência e as vias de sinalização afetadas serve como um meio de validar o modelo de camundongo P 0-GGFβ3 em nível molecular. Essa abordagem também enfatiza a eficácia da combinação de telas humanas e de camundongos para identificar novos alvos terapêuticos, onde o modelo de camundongo pode servir como um complemento às telas humanas. O valor desta abordagem entre espécies é particularmente aparente quando se procura alvos terapêuticos em tumores raros, onde tumores humanos e linhagens celulares são difíceis de obter.

Protocolo

Antes do início dos estudos, os procedimentos e protocolos em animais para manejo de vetores virais foram revisados e aprovados pela Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pela Comissão Institucional de Biossegurança (CIB). Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelos Conselhos IACUC e IBC da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Análises WES-Seq e Identificação de Variantes Patogênicas

1. Isolar o DNA genômico de uma amostra tumoral ou de células MPNST subconfluentes (70%) cultivadas em uma placa de 60 mm, usando métodos padrão à base de sílica-gel de adsorção disponíveis comercialmente (consulte o protocolo dos fabricantes para obter etapas detalhadas). O fluxo de trabalho geral é diagramado na Figura 1.
2. Submeter pelo menos 10 μL de DNA genômico a 50 ng/μL ao núcleo de sequenciamento, a menos que diferentes quantidades ou concentrações de DNA genômico sejam especificadas.
   1. A instalação central fragmenta o DNA genômico por sonicação e, em seguida, purifica-o usando o método preferido. A captura do exoma e a construção da biblioteca são realizadas usando o kit de sequenciamento de exoma preferido e as tags de índice são adicionadas ao exoma capturado amplificado.
   2. Submeter os espécimes ao núcleo de sequenciamento para que seja realizado o sequenciamento completo do exoma pareado (WES; 100 pb sequenciado de cada extremidade).
   3. Os arquivos FASTQ gerados pelo núcleo são fornecidos ao investigador. Use apenas arquivos FASTQ que passam métricas de qualidade para análise.
3. Alinhe e analise os arquivos FASTQ usando programas de software disponíveis comercialmente (por exemplo, DNAStar19,20, Partek21 ou Varsome). Alinhe os arquivos FASTQ ao genoma de referência do mouse GRCm38/mm10 usando as configurações padrão.
   Observação : usando DNAStar e uma amostra MPNST do mouse como um exemplo, o fluxo de trabalho geral é diagramado em Figura 1 e brevemente explicado abaixo.
   1. Abra o software DNAStar e escolha o fluxo de trabalho SeqMan NGen.
   2. Escolha Fluxo de trabalho selecionando Análise de variantes/resequenciamento e o tipo de análise de sequenciamento Amplicon baseado em NGS, painel de genes ou exoma. Clique em Avançar.
   3. Escolha a Sequência de Referência preferida selecionando Download Genome Package e o genoma de referência apropriado ( ou seja, Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip ou Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Se o recurso principal forneceu um arquivo de cama, carregue esse arquivo auxiliar. Clique em Avançar.
   4. Escolha Sequências de entrada selecionando a tecnologia de sequenciador apropriada, Illumina, e designe que as leituras de sequenciamento são emparelhadas. Em seguida, selecione a configuração do experimento, várias amostras e carregue os arquivos FASTQ de sequenciamento selecionando Adicionar. Se estiver executando várias amostras, designe cada conjunto de extremidades emparelhadas com um experimento exclusivo ou nome de amostra Tumor, Cell line ou A18, A202... Clique em Avançar.
   5. Defina o conjunto de dados de controle , se houver um. Clique em Avançar e clique em Avançar novamente em Opções de Assembly. Em Opções de Análise, clique no modo de Detecção de Variante apropriado como Diploid e clique em Avançar. Em Saída do assembly, nomeie e designe o local de salvamento do arquivo do projeto; clique em Avançar. Execute o assembly no computador local ou na nuvem.
      Observação : os arquivos de alinhamento resultantes podem ser abertos no fluxo de trabalho ArrayStar para anotação variante de polimorfismos de nucleotídeo único detectados (SNPs). Esse fluxo de trabalho detecta SNPs, não ganhos ou perdas no número de cópias genéticas. Uma análise separada chamada matriz SNP de alta densidade detecta alterações no número de cópias; O sequenciamento completo do exoma não detecta de forma confiável as alterações no número de cópias. Consulte o guia do usuário do programa para as etapas específicas a serem executadas com o programa de alinhamento.
   6. Aplique filtros definidos pelo usuário à anotação de variante de SNPs detectados para incluir ou excluir determinados dados. Para obter uma lista condensada de prováveis variantes funcionalmente relevantes, aplique os seguintes filtros aos conjuntos de dados de variantes nesta hierarquia: não controle (se uma amostra de controle normal estiver disponível), frequência populacional (gnomAD, ExAC, frequências de 1.000 genomas), frequência alélica (inclui ≤0,001 ou 0,1%), profundidade de cobertura (excluir profundidade <10), patogenicidade ou classe ClinVar (incluir: patogênico, provavelmente patogênico; excluir: incerto, provavelmente benigno, benigno) e, se desejado, tipo de SNP e impacto de codificação (incluem: não-sinônimo, missense, nonsense, frameshift, in-frame, splicing).
      NOTA: Uma lista de genes de cancro relevantes conhecidos também pode ser aplicada à lista final para extrair apenas genes específicos relevantes para a doença, ver passo 1.3.7. Esses filtros podem reduzir a lista de genes variantes para menos de 20 genes.
      1. Use a frequência alélica variante para filtrar SNPs de erro de sequenciamento. As variantes homozigotas e heterozigotas serão representadas aproximadamente em 100% e 50%, respectivamente, para uma população de células puras não contaminantes (uma linhagem celular derivada de tumor estabelecida deve representar uma única população de células tumorais isogênicas). Neste caso, aplique frequências alélicas de 100-90% e 50-40% para variantes como um filtro, removendo assim quaisquer variantes abaixo disso. Se os dados do arranjo SNP de alta densidade também estiverem disponíveis para o mesmo conjunto de dados, aplique o ganho ou a perda do número de cópias a SNPs com frequências alélicas variantes menores do que as razões homozigotas ou heterozigotas (ou seja, o ganho no número de cópias resultando em 2 cópias do alelo A e 1 cópia do alelo B tornaria apropriadas as frequências alélicas variantes de 75%, 25%, respectivamente).
   7. Depois de identificar variantes patogênicas com o ArrayStar, exporte e salve a lista de genes variantes como um arquivo csv, txt ou xls e compare os genes que contêm essas mutações com aqueles na coorte de tumores gerados por P 0-GGFβ3 para determinar listas de genes mutados sobrepostos e únicos. Compare os genes mutados com genes mutantes conhecidos associados aos seus homólogos humanos (ou seja, a lista de genes do cancro do laboratório de Bushman ou uma lista selecionada pelo utilizador).
      1. Opcionalmente, antes de aplicar qualquer filtro definido pelo usuário (1.3.6), exporte e salve o arquivo anotado como um arquivo VCF.
         NOTA: Este arquivo VCF pode ser carregado para outro software de predição de efetor variante Varsome ou VEP para comparação como uma análise secundária. A análise biológica e de vias também pode ser realizada nas listas de genes de variantes filtradas.
   8. Realizar a classificação funcional da lista de genes variantes por meio de um banco de dados preferido pelo usuário para obter informações sobre a classe de proteínas, a via, o componente da via e a família de genes e ontologias.
      NOTA: PANTHER (pantherdp.org) é usado como um exemplo aqui.
      1. Carregue a lista de genes filtrados com o ID do gene.
      2. Selecione o organismo (Mus musculus).
      3. Selecione análise (Classificação funcional visualizada na lista de genes) e clique em enviar análise biológica e de vias em listas de genes de variantes filtradas.

2. Telas de shRNA em escala genômica

NOTA: Várias bibliotecas shRNA e CRISPR estão disponíveis que podem ser usadas para telas funcionais em escala genômica com culturas tumorais de baixa passagem. Aqui, descrevemos o uso de bibliotecas de shRNA CELLECTA DECIPHER como exemplo. As bibliotecas de shRNA lentiviral CELLECTA DECIPHER são otimizadas para rastreios genéticos de RNAi em formato pooled. Cada transcrição é alvo por pelo menos 5-6 shRNAs únicos e cada vetor de shRNA lentiviral contém um código de barras genético único flanqueado por sítios de primer de PCR. Essas bibliotecas cobrem a maioria dos genes relevantes para doenças humanas e de camundongos, mas não cobrem todos os genes do genoma. Os pools de DNA plasmidial da biblioteca humana Cellecta estão disponíveis em três módulos (Módulo Humano I, II, III; tem como alvo 15.377 genes), enquanto os pools de plasmídeos da biblioteca de camundongos estão disponíveis em dois módulos (Módulos I e II de Camundongos; alvos 9.145 genes). Essas bibliotecas são usadas para realizar ensaios de "abandono" nos quais genes-alvo necessários para a proliferação e/ou sobrevivência são diferencialmente expressos em diferentes momentos após a transdução viral.

1. Embalagens Lentivirais
   1. Dia 0: Prato 10 pratos de 10 milhões de células 293T/prato de 15 cm em DMEM livre de antibiótico de 30 mL/prato contendo 10% de soro fetal bovino (SFB).
   2. Dia 1: Confirme se as células estão ~80% confluentes no dia seguinte e prontas para transfecção. Em um tubo cônico de 50 mL, misturar o seguinte nesta ordem: 600 μL de mistura de plasmídios de embalagem (0,5 μg/μL), 60 μL de biblioteca de código de barras de plasmídeos, 12 mL de DMEM (sem soro ou antibióticos) e 600 μL de reagente de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Colocar 900 μL de reagente de transfecção e 12 mL de DMEM em um tubo cônico separado de 15 mL e misturar por vórtice. Adicionar 12,9 mL da mistura de reagente de transfecção/DMEM à mistura de DNA e mexer para misturar. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos sem mais misturas. Adicionar 2,5 mL dessa mistura, em gotas, a cada prato de 15 cm de células 293T e incubar durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos.
   4. Dia 2: Substitua o meio no dia seguinte por meios de crescimento regulares contendo antibióticos.
   5. Dia 3: Colher o vírus coletando o meio e passando-o através de uma unidade de filtração de 0,2 μm e aliquotando em tubos cônicos de 15 mL; preparar também cinco alíquotas de 1 mL de vírus filtrado em criofrascos para uso na titulação viral (considerado vírus 48 h); armazenar o vírus em um freezer de -80 °C. Substitua o meio por 30 mL de meio de crescimento nas placas, uma de cada vez, para evitar o ressecamento das células.
   6. Dia 4: Colher o vírus coletando o meio e passando-o através de uma unidade de filtração de 0,2 μm. Alíquota do vírus em tubos cônicos de 15 mL. Este é considerado vírus 72 h; armazenar o vírus em um freezer de -80 °C.
2. Titer Piscinas Lentivirais
   1. Adicionar 65 μL de polímero catiônico (10 mg/mL) a 65 mL de meio de crescimento de células tumorais. Pipetar 1 mL/poço do meio contendo polímero em onze placas de cultura de tecidos de 6 poços. Tripsinizar células tumorais de passagem precoce e contar células usando o método preferido para que cada poço receba 50.000 células/mL/poço. Descongelar alíquotas de 1 ml de lentivírus de 48 h do congelador em banho-maria a 37 °C.
   2. Para cada módulo viral, preparar a infecção como mostrado na Tabela 1.
   3. Coloque todas as placas de 6 poços em uma incubadora de cultura de tecidos. No dia seguinte, remova os meios virais e reabasteça com novos meios de crescimento. Às 48 h, adicionar meios contendo puromicina a todos os poços que recebem seleção. Antes que as células de controle sejam confluentes, realize contagens de células de clones sobreviventes usando o método preferido.
      NOTA: A concentração de puromicina necessária para matar células não transduzidas deve ser pré-determinada empiricamente, testando uma gama de concentrações em uma curva de "matar". Utilizar a menor concentração que induza uniformemente a morte de culturas não transduzidas.
3. Infecção Lentiviral de Células-Alvo
   1. Tripsinise as células MPNST e contar. Prato 2,5 milhões de células por prato de 15 cm para um total de vinte pratos de 15 cm por módulo. Descongelar o vírus e transduzir as células com o vírus a um MOI de 0,5 na presença de 5 μg/mL de polímero catiônico (Figura 2A).
   2. Remova a mídia contendo vírus na manhã seguinte e substitua por meios de crescimento frescos. Cultivar células por mais 2 dias para permitir a expressão do marcador de seleção e, em seguida, adicionar puromicina às culturas para eliminar células não transduzidas.
   3. Três dias após a adição de puromicina, tripsinizar as células e centrifugar metade da população celular a 200 × g por 5 min em uma centrífuga de mesa. Armazenar as células peletizadas no congelador de -80 °C para futura preparação de ADN genómico; este é o ponto de tempo de referência, ou ponto de tempo 1 (T1).
   4. Replantar a outra metade da população celular e cultivá-la por aproximadamente 7 duplicações populacionais antes de colher e centrifugar como acima. Este pellet celular servirá como ponto de tempo final (ponto de tempo 2, T2) e será armazenado a -80 °C para futuro isolamento do DNA genômico (Figura 2).
4. Isolando DNA Genômico de Células Transduzidas com Pools de Vírus
   1. Descongelar o pellet celular do freezer de -80 °C e ressuspendê-lo em 10 mL de tampão de ressuspensão com adição de RNAse, e imediatamente dividido em dois tubos de polimetilpenteno de 15 mL (Figura 2B).
   2. Adicionar 500 μL de SDS a 10% por 5 mL, misturar e incubar à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, coloque tubos em um dispositivo de cisalhamento de DNA para sonicar o DNA por 25 ciclos de 30 s on/30 s off, certificando-se de manter a temperatura em 4 °C.
   3. Adicionar 5 mL de fenol/clorofórmio, pH 8,0 (armazenado a 4 °C), certificando-se de misturar bem o fenol/clorofórmio antes do uso. Após a adição de fenol/clorofórmio, misture bem por vórtice vigorosamente na fixação máxima para 45-60 s. Centrifugar por 60 min, -20 °C a 7.200 × g.
      NOTA: Uma aparência espumosa / leitosa após o vórtice sinalizará ressussão completa.
   4. Transferir 3 mL da fase superior clara para um tubo fresco de 15 mL e adicionar 0,5 mL de acetato de sódio 3 M e 4 mL de isopropanol e misturar bem (Figura 2C). Centrifugar por 30 min a 20 °C a 7.200 × g.
   5. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e, em seguida, pipete cuidadosamente o líquido restante. Adicionar 0,5 mL de etanol a 70% e deslocar o pellet pipetando para cima e para baixo. Transfira o pellet ressuspendido para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e combine os dois pellets da mesma amostra em um único tubo de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugar à velocidade máxima em uma centrífuga de bancada por 5 min.
   6. Descarte o sobrenadante e use um lenço de laboratório para absorver qualquer etanol residual a 70%. Ressuspenda o pellet em 0,5 mL de água destilada, certificando-se de não deixar o pellet secar, pois isso dificultará a ressuspensão. Conservar as amostras a 4 °C antes de medir a concentração de ADN.
5. PCR aninhado para amplificar códigos de barras shRNA
   NOTA: Recupere o DNA do armazenamento e coloque no gelo. Se a concentração de DNA for inferior a 100 ng/μL, acelere a secagem a vácuo do DNA e ressuspenda em um volume apropriado de água destilada. Recomendamos processar apenas um módulo de cada vez (ponto de tempo 1 (T1) ou ponto de tempo 2 (T2)). Realizar duas preparações de cada ponto de tempo que devem ser agrupadas no final; Por isso, é importante não processar pontos de tempo replicados no mesmo dia. O protocolo a seguir é para um ponto de tempo do DNA genômico.
   1. Montar 7 tubos e rotulá-los conforme descrito: controle negativo, controle positivo, 4 tubos para DNA genômico e um para mistura mestre (Figura 3A). O controle negativo é água destilada; o controle positivo é o DNA plasmidial utilizado na transfecção 293T para gerar lentivírus.
   2. Adicionar água a cada tubo primeiro, conforme indicado na Tabela 2.
   3. Prepare um Master Mix (MM) conforme mostrado na Tabela 3.
   4. Adicionar 18 μL de MM a cada tubo contendo água. Em seguida, adicione 25 μL de DNA genômico a cada um dos 4 tubos modelo. Em seguida, adicionar 1 μL de controle positivo (10 ng/μL) ao tubo de controle positivo, tomando cuidado para não contaminar outros tubos com DNA de controle positivo. Por último, adicionar 2 μL de polimerase a cada tubo, adicionando primeiro aos 4 tubos de amostra e por último ao tubo de controlo positivo; misturar e girar os tubos de PCR (Figura 3).
   5. Realizar reação de PCR nas condições indicadas na Tabela 4.
   6. Enquanto o primeiro PCR estiver em execução, prepare os tubos para o^2º PCR conforme indicado na Tabela 5. Montar sete tubos: controle negativo, controle positivo, 4 tubos para DNA genômico e um para MM (Figura 3B).
   7. Adicionar 22 μL de MM a cada tubo contendo água e aguardar o término da primeira rodada de PCR antes de adicionar o DNA e a polimerase.
      1. Quando a primeira rodada de PCR estiver completa, combine 4 tubos de amostra em um tubo de microcentrífuga e misture.
      2. Adicionar 25 μL a cada tubo de amostra contendo água.
      3. Em seguida, adicionar 2 μL do primeiro controle negativo da PCR e 2 μL do primeiro controle positivo da PCR aos tubos adequadamente marcados.
      4. Adicionar 2 μL de polimerase a cada tubo, adicionando primeiro aos 4 tubos de amostra e por último o controlo negativo.
   8. Realizar reação de PCR conforme indicado na Tabela 6.
      NOTA: Ao analisar os resultados da primeira reação de PCR por eletroforese em gel de agarose a 3,5%, se for obtida abundância de produto, o número de ciclos pode ser reduzido para 9-10 para a próxima repetição deste procedimento; Da mesma forma, se o rendimento do produto for baixo, os ciclos podem ser aumentados para 14.
   9. Quando a segunda reação de PCR estiver completa, combine 4 amostras em um tubo de microcentrífuga mais 80 μL de corante de carregamento de 6x. Para os controles positivo e negativo, utilizar 20 μL da amostra.
      1. Preparar um gel de agarose a 3,5% em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) (Figura 4A). Para acomodar o grande volume de amostra, crie um grande poço no pente de gel colando vários poços juntos (se um pente para encaixar o volume não estiver disponível), certificando-se de deixar dois poços disponíveis para os controles positivo e negativo. Passe o gel a 90 V por 1 h.
   10. Visualize o gel e confirme uma banda em aproximadamente 250 pares de bases (pb).
6. Primeira Purificação: Extração em Gel
   1. Usando um bisturi limpo ou lâmina de barbear, extire a faixa de 250 pb, cortando o máximo de gel possível. Secione a banda grande em 4 partes e transfira cada peça para um tubo de microcentrífuga limpo. Meça e registre o peso de cada fatia de gel.
      NOTA: Cada peça deve ser de aproximadamente 200 mg ou menos por tubo.
   2. Adicionar 6 volumes de tampão de solubilização (por exemplo, se o pedaço de gel pesar 200 mg, adicionar 1,2 mL de tampão). Coloque os tubos em banho-maria a 50 °C e gire a cada 10-15 minutos até que as fatias de gel estejam dissolvidas. Em seguida, adicione 1 volume de isopropanol a cada tubo (por exemplo, 0,2 mL de isopropanol se a peça de gel pesar 200 mg).
   3. Usando duas colunas de spin para purificação, carregue as amostras de todos os 4 tubos nas colunas. Realize vários giros para processar todo o volume da amostra, pois as colunas comportam apenas 750 μL. Gire as colunas a 17.900 × g por 1 min em uma microcentrífuga convencional de bancada e descarte o fluxo de cada vez.
   4. Lavar as colunas com 750 μL de tampão de lavagem e centrifugar a 17.900 × g por 1 min. Após a lavagem, descarte o fluxo e seque a coluna de spin centrifugando a 17.900 × g por 3 min. Eluir o DNA com 50 μL de água destilada por coluna e centrifugar previamente por 1 min e combinar ambos os tubos para um volume total de 100 μL da amostra.
7. Segunda purificação
   1. Esta próxima etapa de purificação usará o Binding Buffer 2 (do Kit de Purificação PCR), que não elimina pequenos fragmentos. Adicionar 400 μL de tampão aos 100 μL de DNA e carregá-lo em uma coluna de spin (Figura 4B). Centrifugar a amostra a 17.900 × g por 1 min.
   2. Em seguida, lave a membrana com 650 μL de tampão de lavagem e gire conforme realizado anteriormente. Secar a coluna de spin com centrifugação adicional como acima por 3 min.
   3. Eluir o DNA com 30 μL de água destilada e girar na velocidade máxima por 1 min. Após a eluição verificar a concentração em espectrofotômetro; garantir que a concentração não seja inferior a 10 ng/μL ou superior a 70-80 ng/μL. Conservar o ADN num congelador a -20 °C.
8. Sequenciamento de Códigos de Barras Amplificados
   1. Para o sequenciamento, diluir os códigos de barras purificados para 0,75 ng/μL usando tampão de eluição (EB). Para adicionar diversidade de sequências, os amplicons são agrupados em 17 pM, incluindo 30% (v/v) de PhiX. Execute o cluster de extremidade única (SE) em um sistema de geração de cluster automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Faça com que o núcleo de sequenciamento execute um total de 36 ciclos de sequenciamento de extremidade única em um sequenciador NextGen (Figura 4C). Adicione o primer personalizado GexSeqS aos primers de sequenciamento do Illumina a 0,5 μM.
   3. Use o software de análise referenciado para gerar arquivos Fastq e processá-los usando software para cortar comprimentos de leitura para 18 nucleotídeos.
   4. Use o software Analisador de Código de Barras e Deconvoluter para desconvoluir leituras cortadas. Calcule os escores de depleção de dobras para cada shRNA como a razão das contagens de leitura no ponto de tempo de referência (T1) versus o ponto de tempo final (T2).
9. Análise de Resultados de Triagem de shRNA e Identificação de Alvos Terapêuticos Candidatos
   NOTA: Na biblioteca de shRNA Cellecta, a maioria dos genes é alvo de 5 (67%) ou 6 shRNAs diferentes (32%). No entanto, vários genes housekeeping, que devem ser atingidos na maioria das células, são alvo de um grande número de shRNAs e servem como controles que definem a faixa de escores para negativos.
   1. Para evitar o viés em direção a genes visados por um número maior de shRNAs, o log transforma os escores de depleção. Realizar uma estimativa quantílica calculando o percentil 80 para cada gene a partir de sua distribuição empírica.
   2. Para gerar uma distribuição nula dos escores de depleção de dobras logarítmicas, assuma que >95% dos genes não serão esgotados e que seus escores log-quantílicos terão uma distribuição normal. Use a mediana da distribuição empírica para estimar a média da distribuição nula. Usando essa distribuição nula, classifique todos os genes com escores de depleção log-fold maiores que o percentil 95 da distribuição nula como 'hits'.
      NOTA: Todos os acertos devem ter pelo menos dois shRNAs com escores de depleção acima do ponto de corte (Figura 5).
   3. Para avaliar a qualidade dos dados de triagem de abandono de RNAi e a validade do ponto de corte, use um conjunto de genes que foram definidos como "essenciais essenciais" pela iniciativa de rastreamento de RNAi do câncer COLT^24,25 para comparação. Remova CEGs da lista de acertos para produzir a lista inicial de potenciais alvos terapêuticos.
      NOTA: Os genes no conjunto COLT pontuaram como um acerto em >50% das 72 linhagens de células cancerosas que foram rastreadas pelo COLT. A lista de genes essenciais contém 640 genes.
   4. Para identificar potenciais alvos terapêuticos que são comumente ou uniformemente requeridos por múltiplas linhagens celulares de MPNST, construa diagramas de Venn dos acertos não-CEG identificados em telas de diferentes linhagens celulares de MPNST ou culturas de passagem precoce (Figura 6A). Priorize os acertos não-CEG que são necessários em todas ou na maioria das linhas ou culturas do MPNST.
      1. Alternativamente, realizar análises de vias na lista de acertos não-CEG de cada linhagem celular ou cultura de passagem precoce para identificar genes cujos produtos codificam componentes de vias de sinalização que são necessários para a proliferação e/ou sobrevivência de células tumorais. Em seguida, compare as vias de sinalização que são identificadas na análise de vias de não-CEGs com as vias de sinalização que foram identificadas como afetadas por mutações identificadas com WES.
         NOTA: Achamos particularmente útil identificar vias de sinalização que são consistentemente afetadas por mutações identificadas no WES e compará-las com as vias de sinalização identificadas como críticas em telas de shRNA.
   5. Para identificar alvos farmacológicos para os quais os agentes terapêuticos já estão disponíveis, selecione a lista de acertos remanescentes após a remoção dos principais genes essenciais usando o Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      NOTA: Este banco de dados permite que uma lista de genes seja inserida e rastreada simultaneamente e fornece orientação sobre drogas que estão atualmente disponíveis para atingir esses genes.
   6. Valide primeiro os alvos de alto interesse identificáveis derrubando sua expressão gênica com shRNAs distintos daqueles usados na tela inicial da biblioteca em um único formato de lote (não um formato de lote de biblioteca apenas descrito). Para derrubar a expressão gênica, use dois a três shRNAs lentivirais distintos. Três a quatro dias após a infecção, determinar o efeito que isso tem sobre a proliferação de células tumorais e sobrevivência como descrito abaixo.

3. Realizar Ensaios de Citómetro de Números e Viabilidade Celular em Células MPNST Desafiadas com Agentes Terapêuticos Candidatos

1. Cultivar células MPNST em DMEM até 80% de confluência. Enxaguar as células com solução salina balanceada de Hanks à temperatura ambiente (HBSS).
   NOTA: Não cresça células para confluência, pois o crescimento dessas células ficará para trás por um tempo após o replaqueamento.
2. Separar as células do substrato cobrindo as células por 30 s a 1 min com uma solução de dissociação celular não enzimática. Adicionar 5 mL de DMEM por 1 mL da solução de dissociação e pipetar suavemente as células para cima e para baixo para se desprender do substrato.
3. Conte células usando um hemocitômetro. Células de placa a uma densidade de 1.200 células por poço em placas de 96 poços de paredes pretas; Placa de pelo menos três poços para cada diluição do fármaco que será testada e realizar três réplicas biológicas desses experimentos.
4. Para determinar as concentrações iniciais do fármaco que será testado, revise a literatura para avaliar quais concentrações têm sido efetivas contra outros tipos de células cancerígenas. Em experimentos iniciais, teste uma faixa de duas ordens de magnitude acima e duas ordens de magnitude abaixo da concentração da droga usada com outros tipos de câncer.
5. Preparar diluições do medicamento a ser testado e adicionar cada diluição ou veículo a pelo menos três poços de replicação.
6. Avaliar o número de células diretas 1, 3, 5 e 7 dias após a adição de drogas. Adicionar Hoechst 33342 a uma concentração final de 5 μg/ml e incubar as placas durante 30 minutos a 37 °C. Leia placas em um citômetro de imagem de alto rendimento usando a opção de contagem direta de células para número total de células com tempos de exposição de 100.000 ms.
7. Analise as leituras usando o software e exporte-as para uma planilha e use software apropriado para análises estatísticas.
8. Se reduções estatisticamente significativas no número de células forem observadas em poços tratados com drogas, realize um ensaio "Vivo/Morto" para determinar se essa redução se deve, em parte, à indução da morte celular.
   1. Células de placas em placas de 96 poços de paredes pretas, conforme descrito na etapa 3.3.
   2. Preparar e adicionar medicamentos conforme descrito na etapa 3.5.
   3. Avaliar a viabilidade celular e a morte 1, 3, 5 e 7 dias após a adição da droga. Adicionar calceína AM a uma concentração final de 1 μM e iodeto de propídio a uma concentração final de 1 μM em cada poço. Incubar as células durante 15 min a 37 °C.
   4. Células de imagem em um citômetro de imagem usando a opção de software Live+Dead . Analise as leituras usando o software e exporte-as para uma planilha e use software apropriado para análises estatísticas.

Resultados

Os gráficos da Figura 5 mostram escores de depleção de genes essenciais centrais (CEGs) rotulados como TRUE em comparação com não-CEGs (rotulados como FALSE) em cada linhagem celular humana que foi triada. Os pontos representam log2 dos escores de depleção de dobras para genes individuais, que são plotados sobre uma representação boxplot da distribuição geral do estrofe. O teste t de Student foi utilizado para testar a diferença significativa na média dos escores de d...

Discussão

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos para estudar a neoplasia do sistema nervoso periférico e a patogênese do MPNST. Embora tenhamos encontrado esses métodos como eficazes, deve-se reconhecer que existem algumas limitações potenciais para os métodos que descrevemos aqui. A seguir, discutimos algumas dessas limitações e possíveis estratégias para superá-las em outros sistemas modelo.

Descobrimos que o sequenciamento completo do exoma efetivamente identifica mu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org