Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes

Resumo

Um clamp hiperglicêmico é usado para medir a liberação de insulina com uma concentração de glicose no sangue mais alta mantida. Uma pinça hipoglicemiante serve para medir a produção de glicose induzida por respostas contra-regulatórias. Ambos os métodos utilizam o mesmo procedimento cirúrgico. Apresentamos aqui uma técnica de clamp para avaliar o metabolismo sistêmico da glicose.

Resumo

O diabetes mellitus (DM) é causado pela liberação insuficiente de insulina das células β pancreáticas (DM tipo 1) e sensibilidade à insulina nos músculos, fígado e tecido adiposo (DM tipo 2). A injeção de insulina trata pacientes com DM, mas leva à hipoglicemia como efeito colateral. O cortisol e as catecolaminas são liberados para ativar a produção de glicose do fígado para recuperar a hipoglicemia, chamadas de respostas contrarregulatórias (CRR). Na pesquisa de DM usando modelos de roedores, testes de tolerância à glicose e injeção de 2-desoxiglicose são usados para medir a liberação de insulina e CRR, respectivamente. No entanto, as concentrações de glicose no sangue mudam persistentemente durante os experimentos, causando dificuldades na avaliação da liberação líquida de insulina e da RCR. Este artigo descreve um método no qual a glicemia é mantida em 250 mg/dL ou 50 mg/dL em camundongos conscientes para comparar a liberação de insulina e hormônios CRR, respectivamente.

A tubulação de polietileno é implantada na artéria carótida e na veia jugular dos camundongos, e os camundongos podem se recuperar da cirurgia. A tubulação da veia jugular é conectada a uma seringa de Hamilton com uma bomba de seringa para permitir a infusão de insulina ou glicose a uma taxa constante e variável. A tubulação da artéria carótida é para coleta de sangue. Para a pinça hiperglicêmica, 30% de glicose é infundida na veia, e os níveis de glicose no sangue são medidos a partir do sangue arterial a cada 5 min ou 10 min. A taxa de infusão de glicose a 30% é aumentada até que o nível de glicose no sangue se torne 250 mg/dL. O sangue é coletado para medir as concentrações de insulina. Para a pinça hipoglicemiante, infunde-se insulina 10 mU/kg/min juntamente com glicose a 30%, cuja velocidade de infusão é variável para manter 50 mg/dL de glicemia. O sangue é coletado para medir os hormônios contrarreguladores quando a infusão de glicose e a glicose no sangue atingem um estado estacionário. Tanto as pinças hiperglicêmicas quanto as hipoglicêmicas têm o mesmo procedimento cirúrgico e montagens experimentais. Assim, este método é útil para pesquisadores do metabolismo sistêmico da glicose.

Introdução

A glicose é uma importante fonte de energia para as células, e a falta de glicose pode levar a uma variedade de sintomas e complicações. No caso de glicose baixa (hipoglicemia, geralmente inferior a 70 mg/dL no nível de glicemia de jejum, mas não deve ser determinada por um único valor¹), os sintomas mais comuns incluem fraqueza, confusão, sudorese e dor de cabeça. Também pode interromper a função cerebral e aumentar o risco de eventos cardiovasculares e mortalidade². Por outro lado, a hiperglicemia é uma condição médica na qual a concentração de glicose plasmática excede os níveis normais (geralmente > 126 mg/dL na glicemia de jejum³). Isso pode ocorrer em indivíduos com diabetes que têm um déficit na produção ou utilização de insulina. A hiperglicemia pode levar à cetoacidose diabética, que ocorre quando o corpo não pode usar a glicose para energia, mas em vez disso, quebra os ácidos graxos como combustível. O estado hiperosmolar hiperglicêmico também aumenta a mortalidade⁴. A hiperglicemia a longo prazo pode causar danos aos vasos sanguíneos, nervos e órgãos, levando ao desenvolvimento de várias complicações crônicas, como doenças cardiovasculares, retinopatias e doenças renais. Assim, a glicemia deve ser mantida em uma faixa restrita entre 100 mg/dL e 120 mg/dL.

A glicemia é regulada pelo balanço entre a entrada e a saída de glicose em um modelo unicompartimental (Figura 1A). A entrada de glicose inclui a glicose absorvida dos alimentos e a produção de glicose do fígado, rins e intestino delgado. O débito de glicose compreende a captação de glicose nos tecidos e a eliminação de glicose dos rins. Tanto a quantidade de entrada quanto a saída de glicose são reguladas por hormônios endócrinos. Por exemplo, glucagon, corticosterona e catecolaminas, conhecidas como hormônios contrarreguladores, são liberadas quando os níveis de glicose no sangue diminuem⁵. Eles estimulam a quebra de glicogênio e a síntese de glicose, principalmente a partir do fígado; Esses processos são conhecidos como glicogenólise e gliconeogênese, respectivamente. A hiperglicemia aumenta a liberação de insulina pelas células β pancreáticas e estimula a captação de glicose nos músculos, tecidos adiposos e coração 6,7,8,9. O exercício físico aumenta a captação de glicose insulino-independente¹⁰. O sistema nervoso simpático aumenta a captação de glicose nos músculos e no tecido adiposo marrom ^6,11. Para medir a capacidade de regular o metabolismo da glicose nos tecidos periféricos, os pesquisadores normalmente usam o teste de tolerância à glicose (GTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT) (Figura 1B,C). No GTT, dois fatores devem ser considerados: liberação de insulina e sensibilidade à insulina (Figura 1B). No entanto, a curva de concentração de glicose durante o teste de 120 min é diferente em cada camundongo, o que pode afetar diferentes quantidades de liberação hormonal. No ITT, a glicose no sangue é regulada tanto pela sensibilidade à insulina quanto pela liberação de hormônios contrarreguladores. Portanto, é difícil determinar o significado preciso do metabolismo da glicose, liberação de insulina e sensibilidade à insulina no GTT e ITT, em situações em que os níveis de glicose no sangue não são constantes.

Para superar esses problemas, é desejável manter a glicose no sangue em um nível constante (ou "braçadeira"). No clamp hiperglicêmico, a glicose é infundida na corrente sanguínea para elevar os níveis de glicose no sangue para um nível específico e, em seguida, mantida nesse nível por um período de tempo. A quantidade de glicose infundida é ajustada com base em medições dos níveis de glicose no sangue a cada 5-10 minutos para manter um estado estacionário. Esta técnica é particularmente útil para a compreensão dos parâmetros de secreção de insulina em um nível de glicose clampeada. O clamp hipoglicêmico é um método para manter baixos níveis de glicose no sangue por infusão de insulina. A glicose é infundida a uma taxa variável para manter um nível específico de glicose no sangue. Se o rato não conseguir recuperar da hipoglicemia, deve ser infundida mais glicose.

Embora existam muitas vantagens na realização de pinças hiperglicêmicas e hipoglicêmicas, os procedimentos cirúrgicos e experimentais são considerados tecnicamente difíceis. Assim, poucos grupos de pesquisa conseguiram realizá-las. Nosso objetivo foi descrever esses métodos para que pesquisadores com restrições financeiras e de força de trabalho iniciem esses experimentos com um orçamento menor.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kumamoto.

NOTA: Para alívio da dor, o ibuprofeno foi administrado em água potável (0,11 mg/mL) por 48 h, e a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) foi administrada 30 minutos antes da cirurgia. As condições estéreis incluem luvas, máscaras e instrumentos autoclavados esterilizados com óxido de etileno entre os animais. A cirurgia foi realizada em uma almofada térmica regulada a 37 °C e coberta por um novo tapete de laboratório para cada animal. Antes da cirurgia, a área cirúrgica foi limpa com solução de betadina e álcool. Todos os instrumentais cirúrgicos foram esterilizados em autoclave (para no máximo duas cirurgias). Antes de fazer a incisão, os camundongos foram verificados para garantir que estavam totalmente anestesiados. A profundidade da anestesia para cada camundongo foi avaliada antes e durante a cirurgia por meio de uma pinça do dedo. O período de aclimatação não foi superior a 5 min cada vez. Siga as instruções da IACUC na respectiva instituição.

1. Preparo de tubos para veia jugular e artéria carótida

1. Esterilize todos os tubos, suprimentos de polipropileno (por exemplo, pontas de pipeta) e suturas com autoclave ou óxido de etileno. Para a veia jugular, conectar 8 cm de tubing1 (ver Materiais) e 3 cm de tubing2 usando cola (Figura 2A). Coloque 2 mm de tubing1 no topo porque o tubo 2 (polietileno) é muito duro e pode danificar os vasos sanguíneos (Tubing1.1).
2. Tubo de extensão para veia jugular (Tubing1.2) para infusão de glicose e insulina
   1. Preparar dois tubos de 30 cm e um de 10 cm com tubulação2 (Figura 2A). Corte a extremidade afiada de uma ponta de pipeta de 20 μL (ou qualquer coisa que tenha uma extremidade de ponta estreita com OD < 0,5 mm para conectar com a tubulação 1.1) e coloque três tubos2 (30 cm, 30 cm e 10 cm) juntos nele. Selo com cola adesiva.
   2. Coloque 5 cm de tubing1 na outra extremidade do tubing2.
3. Para a artéria carótida (Tubing1.3): Esticar a tubulação2 para torná-la mais fina. Conectar 8 cm de tubulação1 e 3 cm de tubulação esticada2 com cola (Figura 2A). Faça uma marca a 9 mm da ponta.
4. Agulha com extremidade não afiada que conecta a tubulação à seringa: Faça um arranhão perto da extremidade afiada da agulha (23 G) com uma lima de metal, dobre-a suavemente para frente e para trás algumas vezes com um alicate e quebre-a. Faça o mesmo corte no meio da agulha para fazer um pedaço de conector de metal (Figura 2A).
5. Tubo de extensão para a artéria retirar sangue (Tubing set1.4): Conectar 10 cm de tubing1 com o conector metálico e a agulha não afiada que foi feita no passo 1.4.
   OBS: Todas as tubulações e suturas são esterilizadas em autoclave ou óxido de etileno

2. Cirurgia

1. Anestesiar camundongos com isoflurano (1,5-2,0%) ou cetamina/xilazina (cetamina 10 mg/mL, xilazina 1 mg/mL em solução salina 0,9% estéril, 0,1 mL/10 g de peso corporal (PC) via injeção intraperitoneal [ip]). Mantenha o rato sobre a almofada quente (37 °C) para reduzir o stress físico. Aguarde anestesia profunda por 5-10 min. Confirme a profundidade da anestesia pelo reflexo pedal, respiração e frequência cardíaca, e resposta aos estímulos por pinça dos dedos. Durante a cirurgia, a fita cirúrgica deve ser usada para fixar a tampa nasal à mesa de cirurgia para inalação contínua de anestesia. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
2. Preencher solução salina heparinizada (100 U/mL) em tubing1.1 e 1.3 e conectá-los com uma seringa de 1 mL com agulha não cortante (Figura 2B). Feche a extremidade da tubulação3 (ver Tabela de Materiais) fundindo-a com um ferro de solda, que será usado como tampas para tubulação1.1 e tubulação1.3.
3. Raspar e limpar a área da incisão da primeira (interescapular nas costas) e da segunda (pescoço na frente) com três ciclos de betadina a 10%, seguidos de uma preparação pré-operatória com álcool 70% estéril. Fazer uma pequena incisão vertical de 5 mm cefálica ao esterno, dissecar os tecidos e expor a artéria. Separe o nervo vago da artéria. Isso reduz os efeitos negativos da remoção do nervo vago no metabolismo da glicose.
   NOTA: O passo da incisão ventral até o passo onde o cateter é inserido na veia e fixado com suturas de seda é realizado sob um microscópio.
4. Coloque duas suturas de seda sob a artéria. Interromper o fluxo sanguíneo amarrando uma sutura firmemente no lado cranial (Figura 2C-1) e a outra frouxamente no lado caudal (Figura 2C-2), o que é suficiente para interromper o fluxo sanguíneo, mas o suficiente para abrir novamente mais tarde. Colocar mais um ponto sob a artéria (Figura 2C-3).
5. Cortar a artéria próxima à Figura 2C-1 com tesoura de mola e colocar tubulação1.3 na artéria. Faça uma amarração solta tanto na artéria quanto na tubulação (Figura 2C-3, não amarre firmemente. A tubulação será inserida mais profundamente na artéria). Abra o nó do lado caudal (Figura 2C-2) para inserir o tubo até que a marca de 9 mm atinja o nó no meio (Figura 2C-3). Amarre firmemente todas as ligaduras e lave com soro fisiológico estéril heparinizado.
6. Expor a veia jugular direita da mesma incisão da artéria carótida direita para o cateter jugular. Isolar a extremidade cranial e ligá-la com fio de seda (Figura 2D-1, Tabela de Materiais). Colocar outro pedaço de sutura na extremidade caudal da veia exposta (Figura 2D-2). Corte a veia próxima à marca Figura 2D-1 com tesoura de mola.
7. Insira o cateter (não muito profundo para evitar a penetração de vasos), amarre-o e confirme visualmente que ele coleta sangue. Lave com soro fisiológico estéril heparinizado (0,2 mL) e confirme visualmente que não há sangue no cateter.
8. Coloque o rato sobre o novo pano cirúrgico estéril para evitar a infecção da primeira ferida. Vire o mouse, limpe com três ciclos de betadina seguido de uma preparação pré-operatória com álcool estéril e faça uma pequena incisão entre as omoplatas.
9. Passe um porta-agulhas sob a pele da incisão nas costas para o lado ventral. Aperte os cateteres com o suporte da agulha, passe-os sob a pele e traga-os de volta. Limpar o local da incisão e fechar as incisões ventrais com uma sutura sintética (diâmetro 0,15-0,2 mm). Aperte o cateter venoso com micro serrefine no local da incisão entre as omoplatas.
10. Cortar o cateter 1 cm acima da pinça, lavá-lo com soro fisiológico heparinizado e fechá-lo com uma tampa (passo 2.4). Siga o mesmo procedimento para o cateter arterial. Fechar a incisão dorsal com sutura sintética (diâmetro 0,15-0,2 mm).
11. Coloque o mouse em uma gaiola quente e limpa (Figura 2E). Realizar cuidados pós-operatórios diariamente.

3. Recuperação

1. Único abrigar o mouse porque outro camundongo pode morder o cateter na habitação do grupo.
   1. Para reduzir o estresse pelo isolamento social, mantenha ratos com enriquecimento ambiental (por exemplo, abrigos). Realizar cuidados pós-operatórios diariamente. Para aliviar a dor, angústia e desconforto, fornecer cuidados pós-operatórios, incluindo analgesia (ibuprofeno em água potável (0,11 mg/mL).
   2. Observe os ratos em busca de sinais de infecção, como festering, letargia ou dor no local da incisão. A maioria dos ratos saudáveis começa a andar e se alimentar cerca de 2 h após a cirurgia. Uma postura curvada, pelos babados e diminuição da ingestão de alimentos podem indicar dor. Se esses sinais forem observados, eutanasiar imediatamente os camundongos, decapitando-os sob anestesia profunda ou asfixia por dióxido de carbono.
2. O sangue entrará no cateter na artéria e formará um coágulo. Para manter as linhas de cateter, remova o coágulo diariamente, seguindo os passos 3-6.
3. Encher uma seringa de 1 mL e uma agulha 23 G (extremidade não afiada) com soro fisiológico heparinizado (100 U/mL). Com uma câmara de indução, anestesiar levemente o camundongo com isoflurano (1,0%-1,5%). Em seguida, remova o camundongo da câmara e realize a remoção do coágulo sob anestesia com isoflurano com uma tampa nasal.
4. Aperte a tubulação para a artéria na parte de trás do rato com micro serrefine, remova a tampa e extraia o sangue e os coágulos. Lavar o cateter com soro fisiológico heparinizado usando outra seringa de 1 mL com uma agulha 23 G (extremidade não afiada) e reencapá-lo. Limpe a linha venosa como a linha arterial no caso de coagulação grave.
5. Faça o mesmo procedimento para limpar o cateter uma vez por dia durante 3-5 dias.
6. Verifique o peso corporal do mouse. Se o peso corporal reduzir em mais de 10% a partir do dia da cirurgia, aplique cuidados de suporte e tente melhorar a pontuação de condição corporal normal e use o mouse para outro experimento.
   OBS: A perda de peso dos animais foi inferior a 10% nos experimentos deste estudo. A perda de peso afetará fortemente o metabolismo sistêmico da glicose. Assim, recomenda-se aguardar a recuperação do peso corporal ou retirar do experimento de grampos.

4. Configure o sistema de bomba (para braçadeira hipoglicemiante)

1. Preparar 1 U/mL de insulina em solução salina BSA 0,1%, glicose a 30% em solução salina e solução salina heparinizada.
2. Meça o peso corporal do rato. Calcular o volume de 1 U/mL de insulina para fazer o infusato de insulina (10 mU/kg/min). Infundir 1,7 μL/min de solução de insulina nos ratos no experimento de clamp. Para produzir 300 μL de infusato de insulina, o volume necessário para 1 U/mL de insulina (μL) é de 2,647 (μL/g) x Peso corporal (g). Um volume de 300 μL de infusato de insulina é suficiente para terminar o experimento de pinça em 1 camundongo. A Tabela 1 mostra um exemplo de fabricação de infusato de insulina.
3. Preencher infusato de insulina e glicose a 30% em cada seringa de Hamilton, conectá-los com a tubulação 1.2 e colocar a seringa na bomba de seringa (Figura 3A). Encher cada solução em tubagem 1.2. Encher o soro fisiológico em uma seringa de 1 mL e conjunto de tubos 1.4 (Figura 2A).
4. Anestesiar o camundongo com isoflurano (1,0%-1,5%) e conectar tubing1.2 ao cateter venoso e conjunto de tubing1.4 ao cateter arterial (Figura 3A). Use fita celofane, para manter os tubos juntos.
5. Coloque o rato num copo vazio de 500 ml.
   NOTA: Para grampo hiperglicêmico, use soro fisiológico em vez de 1 U/mL de insulina.

5. Grampo hipoglicemiante

1. Medir os níveis de glicose no sangue a cada 5-10 min, como mostrado na Figura 3B, e coletar amostras de sangue para dosagens hormonais em -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min. Siga o passo 5.2 para medir a glicemia.
   NOTA: Não é necessário medir a glicemia em todos os momentos, mas recomenda-se medi-la pelo menos a cada 10 min. Medir a glicemia a cada 5 minutos quando seu nível e taxa de infusão de glicose não estiverem estáveis.
2. Aperte a extremidade superior do conjunto de tubos1.4 e conecte uma nova seringa, extraia 50 μL de sangue e coloque-a em um tubo de 1,5 mL para lavagem. Medir o nível de glicose no sangue.
   NOTA: Este é o sangue diluído pela solução salina no tubo devido à lavagem do cateter após a amostragem anterior. Um volume de 50 μL é suficiente para substituir o sangue diluído por sangue puro.
3. Armazenar o sangue diluído (glóbulos vermelhos). Lave o sangue acumulado (~500 μL) com soro fisiológico (ver passos 5.11-5.12) e regresse ao corpo para prevenir a hipóxia.
4. O cateter é conectado à artéria com pressão alta, portanto, quando a pinça é solta, o sangue fluirá para fora e será usado para medir a glicose com um medidor de glicose útil. Infundir 50 μL de soro fisiológico para manter quantidade suficiente de fluido sanguíneo.
5. Para a amostragem de sangue, extrair mais 50 μL de sangue e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo. Infundir 100 μL (50 μL de reposição + 50 μL de amostragem) de solução salina.
6. Após 0 min da medição da glicemia, inicie a bomba da seringa de insulina. Primeiro, infundir 30 mU/kg/min em bolus por 2 min (5,1 μL/min), depois infusão de 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) pelo restante da duração.
7. Medir o nível de glicose no sangue e alterar a taxa de infusão de glicose a cada 5-10 min por 120 min.
8. Criar um estado estacionário onde a taxa de infusão de glicose não muda, e o nível de glicose no sangue é de 50 mg/dL.
9. Após a coleta da amostra de sangue em t = 120 min, infundir um agente de eutanásia na veia jugular e coletar tecidos para análise de RNA ou proteína.
10. Centrifugar o sangue a 1000 x g por 5 min e medir a concentração de hormônios como insulina ou peptídeo c usando um kit ELISA de acordo com o protocolo do fabricante.
11. Para lavar o sangue, centrifugar o sangue a 1000 x g por 3 min. Retire o sobrenadante, adicione 500 μL de solução salina heparinizada e realize a pipetagem.
12. Repita a lavagem novamente e coloque as hemácias lavadas em seringa de 1 mL para a artéria. As células sanguíneas serão reinfundidas automaticamente quando 50 ou 100 μL de solução salina forem infundidos nas etapas 5.2 e 5.3. Monitore o hematócrito cuidadosamente para evitar hipóxia.
    OBS: Para a dosagem da glicemia, foi utilizado um glicosímetro comercial manual.

6. Grampo hiperglicêmico

1. Seguir os passos como a técnica de clamp hipoglicêmico, porém sem infusão de insulina e com glicemia ajustada para 250-300 mg/dL. Medir os níveis de glicose no sangue a cada 5-10 min, como mostrado na Figura 3B, e coletar amostras de sangue para dosagens hormonais em -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min.
2. Ligar uma nova seringa ao conjunto de tubos1.4, extrair 50 μL de sangue e colocá-la num tubo de 1,5 ml para lavagem.
3. Para a amostragem de sangue, extrair mais 50 μL de sangue e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo. Infundir 100 μL (50 μL de reposição + 50 μL de amostragem) de solução salina.
4. Após 0 min da medição da glicemia, inicie a bomba da seringa de glicose. Primeiro, infundir 30 g/kg/min em bolus por 2 min (5,1 μL/min), depois 10 g/kg/min (1,7 μL/min) pelo resto da duração.
5. Medir o nível de glicose no sangue e alterar a taxa de infusão de glicose a cada 5 -10 min por 120 min. Criar um estado estacionário onde a taxa de infusão de glicose não muda, e o nível de glicose no sangue é de 250-300 mg/dL, um estado hiperglicêmico clampeado.

Resultados

O estudo do clamp hipoglicemiante foi realizado em camundongos machos C57BL/6N (8 semanas de idade, mais de 25 g PV) 3 h em jejum no início do experimento (Figura 4A,B). A glicemia inicial era de 136 mg/dL (t = -15 min). Se for inferior a 90 mg/dL, pode ser porque a cirurgia não correu bem, ou o cateter arterial foi inserido muito fundo, ou coágulos sanguíneos entraram no fluxo sanguíneo. A condição do rato após a cirurgia afeta o metabolismo energético no rato. O m...

Discussão

O método descrito aqui é simples e pode ser feito com pontas de pipetas, seringas e outros itens encontrados em laboratórios comuns. Embora os pesquisadores possam precisar comprar tubos e bombas adicionais, equipamentos caros não são necessários. Assim, esse protocolo de cateterismo e pinçamento é mais fácil de iniciar em comparação com relatos prévios 12,13,14.

A técnica de pinça foi d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5