Bilinçli Farelerde Hiperglisemik Kelepçe ve Hipoglisemik Kelepçe

Özet

Daha yüksek kan şekeri konsantrasyonu ile insülin salınımını ölçmek için bir hiperglisemik kelepçe kullanılır. Hipoglisemik bir kelepçe, karşı düzenleyici yanıtların neden olduğu glikoz üretimini ölçmek içindir. Her iki yöntemde de aynı cerrahi prosedür kullanılır. Burada, sistemik glukoz metabolizmasını değerlendirmek için bir klemp tekniği sunuyoruz.

Özet

Diabetes mellitus (DM), pankreas β hücrelerinden yetersiz insülin salınımı (Tip1 DM) ve kas, karaciğer ve yağ dokularında insülin duyarlılığı (Tip2 DM) nedeniyle oluşur. İnsülin enjeksiyonu DM hastalarını tedavi eder, ancak yan etki olarak hipoglisemiye yol açar. Kortizol ve katekolaminler, karşı düzenleyici yanıtlar (CRR) adı verilen hipoglisemiyi iyileştirmek için karaciğerden glikoz üretimini aktive etmek için salınır. Kemirgen modelleri kullanılarak yapılan DM araştırmalarında, insülin salınımını ve CRR'yi ölçmek için sırasıyla glukoz tolerans testleri ve 2-deoksi-glukoz enjeksiyonu kullanılmıştır. Bununla birlikte, kan şekeri konsantrasyonları deneyler sırasında sürekli olarak değişir ve bu da net insülin salınımını ve CRR'yi değerlendirmede zorluklara neden olur. Bu makale, insülin ve CRR hormonlarının salınımını karşılaştırmak için bilinçli farelerde sırasıyla kan şekerinin 250 mg/dL veya 50 mg/dL'de tutulduğu bir yöntemi açıklamaktadır.

Polietilen tüp, farelerin karotis arterine ve juguler venine implante edilir ve farelerin ameliyattan sonra iyileşmesine izin verilir. Juguler ven tüpü, sabit ve değişken bir oranda insülin veya glikoz infüzyonunu sağlamak için bir şırınga pompası ile bir Hamilton şırıngasına bağlanır. Karotis arter tüpü kan toplama içindir. Hiperglisemik klemp için damar içine %30 glikoz verilir ve her 5 dakikada bir veya 10 dakikada bir arteriyel kandan kan şekeri seviyeleri ölçülür. Kan şekeri seviyesi 250 mg/dL olana kadar %30 glukoz infüzyon hızı arttırılır. İnsülin konsantrasyonlarını ölçmek için kan alınır. Hipoglisemik klemp için, 10 mU / kg / dak insülin, infüzyon hızı 50 mg / dL kan şekeri seviyesini korumak için değişken olan% 30 glikoz ile birlikte infüze edilir. Hem glikoz infüzyonu hem de kan şekeri sabit bir duruma ulaştığında karşı düzenleyici hormonları ölçmek için kan toplanır. Hem hiperglisemik hem de hipoglisemik klempler aynı cerrahi prosedüre ve deney düzeneklerine sahiptir. Bu nedenle, bu yöntem sistemik glikoz metabolizması araştırmacıları için yararlıdır.

Giriş

Glikoz, hücreler için önemli bir enerji kaynağıdır ve glikoz eksikliği çeşitli semptomlara ve komplikasyonlara yol açabilir. Düşük glikoz durumunda (hipoglisemi, açlık kan şekeri seviyesinde genellikle 70 mg/dL'den az, ancak tek bir değer¹ ile belirlenmemelidir), en yaygın semptomlar arasında halsizlik, kafa karışıklığı, terleme ve baş ağrısı bulunur. Ayrıca serebral fonksiyonu bozabilir ve kardiyovasküler olay ve mortalite riskini artırabilir². Tersine, hiperglisemi, plazma glukoz konsantrasyonunun normal seviyeleri aştığı tıbbi bir durumdur (genellikle açlık kan şekeri seviyesi^3'te 126 mg / dL'>). Bu, insülin üretiminde veya kullanımında bir eksiklik olan diyabetli bireylerde ortaya çıkabilir. Hiperglisemi, vücut enerji için glikoz kullanamadığında, bunun yerine yakıt için yağ asitlerini parçaladığında ortaya çıkan diyabetik ketoasidoza yol açabilir. Hiperglisemik hiperosmolar durum da mortaliteyi artırır⁴. Uzun süreli hiperglisemi kan damarlarına, sinirlere ve organlara zarar vererek kardiyovasküler hastalık, retinopatiler ve böbrek hastalıkları gibi çeşitli kronik komplikasyonların gelişmesine yol açabilir. Bu nedenle, kan şekeri konsantrasyonu 100 mg/dL ile 120 mg/dL arasında dar bir aralıkta tutulmalıdır.

Kan şekeri, tek bölmeli bir modelde glikoz giriş ve çıkışı arasındaki denge tarafından düzenlenir (Şekil 1A). Glikoz girişi, gıdalardan emilen glikozu ve karaciğer, böbrekler ve ince bağırsaktan glikoz üretimini içerir. Glikoz çıkışı, dokularda glikoz alımını ve böbreklerden glikoz atılımını içerir. Hem glikoz giriş hem de çıkış miktarı endokrin hormonları tarafından düzenlenir. Örneğin, karşı düzenleyici hormonlar olarak bilinen glukagon, kortikosteron ve katekolaminler, kan şekeri seviyeleri düştüğünde^{salınır 5}. Glikojenin parçalanmasını ve esas olarak karaciğerden glikoz sentezini uyarır; Bu süreçler sırasıyla glikojenoliz ve glukoneogenez olarak bilinir. Hiperglisemi, pankreas β hücrelerinden insülin salınımını artırır ve kaslarda, yağ dokularında ve kalpte glikoz alımını uyarır 6,7,8,9. Egzersiz, insülinden bağımsız glikoz alımını artırır¹⁰. Sempatik sinir sistemi, kaslarda ve kahverengi yağ dokusunda glikoz alımını artırır ^6,11. Periferik dokularda glukoz metabolizmasını düzenleme yeteneğini ölçmek için, araştırmacılar tipik olarak glukoz tolerans testini (GTT) ve insülin tolerans testini (ITT) kullanırlar (Şekil 1B, C). GTT'de iki faktör göz önünde bulundurulmalıdır: insülin salınımı ve insülin duyarlılığı (Şekil 1B). Bununla birlikte, 120 dakikalık test sırasında glikoz konsantrasyon eğrisi her farede farklıdır ve bu da farklı miktarlarda hormon salınımını etkileyebilir. ITT'de kan şekeri hem insülin duyarlılığı hem de karşı düzenleyici hormonların salınımı ile düzenlenir. Bu nedenle, kan şekeri seviyelerinin sabit olmadığı durumlarda, GTT ve ITT'de glikoz metabolizmasının, insülin salınımının ve insülin duyarlılığının kesin anlamını belirlemek zordur.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, kan şekerini sabit bir seviyede (veya "kelepçe") tutmak arzu edilir. Hiperglisemik kıskaçta, kan şekeri seviyelerini belirli bir seviyeye yükseltmek için kan dolaşımına glikoz verilir ve daha sonra bir süre bu seviyede tutulur. İnfüzyon glikoz miktarı, sabit bir durumu korumak için her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerinin ölçümlerine göre ayarlanır. Bu teknik, klemplenmiş bir glikoz seviyesinde insülin sekresyonunun parametrelerini anlamak için özellikle yararlıdır. Hipoglisemik kelepçe, insülin infüze ederek düşük kan şekeri seviyelerini korumak için kullanılan bir yöntemdir. Glikoz, belirli bir kan şekeri seviyesini korumak için değişken bir oranda infüze edilir. Fare hipoglisemiden kurtulamazsa, daha fazla glikoz infüze edilmelidir.

Hiperglisemik ve hipoglisemik klemplerin uygulanmasının birçok avantajı olmasına rağmen, cerrahi ve deneysel prosedürler teknik olarak zor kabul edilir. Bu nedenle, az sayıda araştırma grubu bunları yapabilmiştir. Finansal ve işgücü kısıtı olan araştırmacıların bu deneyleri daha düşük bir bütçeyle başlatmaları için bu yöntemleri tanımlamayı amaçladık.

Protokol

Tüm prosedürler Kumamoto Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

NOT: Ağrının giderilmesi için ibuprofen 48 saat içme suyunda (0.11 mg/mL) ve ameliyattan 30 dakika önce buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg i.p.) verildi. Steril koşullar, hayvanlar arasında etilen oksit ile sterilize edilmiş eldivenleri, maskeleri ve otoklavlanmış aletleri içerir. Ameliyat, 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde gerçekleştirildi ve her hayvan için yeni bir laboratuvar matı ile kaplandı. Ameliyattan önce ameliyat bölgesi betadin solüsyonu ve alkol ile temizlendi. Tüm cerrahi aletler otoklav ile sterilize edildi (en fazla iki ameliyat için). Kesi yapılmadan önce, fareler tamamen uyuşturulduklarından emin olmak için kontrol edildi. Her fare için anestezi derinliği, ameliyattan önce ve ameliyat sırasında bir ayak parmağı tutamıyla değerlendirildi. İklimlendirme süresi her seferinde 5 dakikadan fazla değildi. İlgili kurumdaki IACUC'nin talimatlarını izleyin.

1. Juguler ven ve karotis arter için tüplerin hazırlanması

1. Tüm hortumları, polipropilen malzemeleri (örn. pipet uçları) ve sütürleri otoklav veya etilen oksit ile sterilize edin. Şah damarı için 8 cm boru1 ( bkz. Malzemeler) ve 3 cm boru2 yapıştırıcı kullanarak bağlayın (Şekil 2A). Üstüne 2 mm boru1 koyun çünkü boru 2 (polietilen) çok serttir ve kan damarlarına zarar verebilir (Boru1.1).
2. Glikoz ve insülini infüze etmek için juguler ven (Tubing1.2) için uzatma tüpü
   1. İki adet 30 cm'lik tüp ve bir adet 10 cm'lik tüplü tüp2 hazırlayın (Şekil 2A). 20 μL'lik bir pipet ucunun keskin ucunu (veya hortum 1.1 ile bağlantı kurmak için 0.5 mm OD < dar uçlu herhangi bir şeyi) kesin ve içine üç hortum2 (30 cm, 30 cm ve 10 cm) yerleştirin. Yapışkan yapıştırıcı ile kapatın.
   2. Borunun diğer ucuna 5 cm boru12 yerleştirin.
3. Karotis arter için (Tubing1.3): Boruyu2 inceltmek için gerin. 8 cm boru1 ve gerilmiş borunun3 cm'sini2 yapıştırıcı kullanarak bağlayın (Şekil 2A). Uçtan 9 mm'lik bir işaret yapın.
4. Boruyu şırıngaya bağlayan keskin olmayan uçlu iğne: Metal bir törpü ile iğnenin keskin ucuna (23 G) yakın bir yerde çizik yapın, pense ile birkaç kez hafifçe ileri geri bükün ve kırın. Bir parça metal konektör yapmak için iğnenin ortasında aynı kesimi yapın (Şekil 2A).
5. Arterin kan alması için uzatma tüpü (Boru seti1.4): 10 cm'lik boruyu1 metal konektöre ve adım 1.4'te yapılan keskin olmayan iğneye bağlayın.
   NOT: Tüm borular ve sütürler otoklav veya etilen oksit ile sterilize edilmiştir.

2. Ameliyat

1. Bir fareyi izofluran (% 1.5-2.0) veya ketamin / ksilazin (ketamin 10 mg / mL,% 0.9 steril salin içinde ksilazin 1 mg / mL, intraperitoneal [ip] enjeksiyonu yoluyla 0.1 mL / 10 g vücut ağırlığı (BW)) ile uyuşturun. Fiziksel stresi azaltmak için fareyi sıcak ped (37 °C) üzerinde tutun. Derin anestezi için 5-10 dakika bekleyin. Anestezi derinliğini pedal refleksi, solunum ve kalp atış hızı ile onaylayın ve ayak parmağını sıkıştırarak uyaranlara yanıt verin. Ameliyat sırasında, anestezinin sürekli solunması için burun kapağını ameliyat masasına sabitlemek için cerrahi bant kullanılmalıdır. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
2. Heparinize salini (100 U / mL) tüp 1.1 ve 1.3'e doldurun ve bunları keskin olmayan bir iğne ile 1 mL'lik bir şırınga ile bağlayın (Şekil 2B). Borunun ucunu3 ( Malzeme Tablosuna bakın) boru1.1 ve boru1.3 için kapak olarak kullanılacak bir havya ile eriterek kapatın.
3. Birinci (arkada interskapular) ve ikinci (önde boyun) kesi bölgesini üç döngü% 10 betadin ile tıraş edin ve silin, ardından steril% 70 alkol ile ameliyat öncesi bir hazırlık yapın. Sternuma 5 mm sefalik küçük bir dikey orta hat insizyonu yapın, dokuları künt diseke edin ve arteri ortaya çıkarın. Vagus sinirini arterden ayırın. Bu, vagus sinirinin çıkarılmasının glikoz metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerini azaltır.
   NOT: Ventral kesiden kateterin damar içine yerleştirildiği ve ipek dikişlerle sabitlendiği basamağa kadar olan adım mikroskop altında gerçekleştirilir.
4. Arterin altına iki ipek dikiş yerleştirin. Bir sütürü kraniyal tarafa (Şekil 2C-1) ve diğerini kaudal tarafa gevşek bir şekilde (Şekil 2C-2) sıkıca bağlayarak kan akışını durdurun, bu da kan akışını durdurmak için yeterlidir, ancak daha sonra tekrar açmak için yeterlidir. Arterin altına bir dikiş daha yerleştirin (Şekil 2C-3).
5. Şekil 2C-1'in yakınındaki arteri yaylı makasla kesin ve tüp1.3'ü artere yerleştirin. Hem arter hem de hortum üzerinde gevşek bir bağ yapın (Şekil 2C-3, sıkıca bağlamayın. Tüp arterin daha derinlerine yerleştirilecektir). Tüpü 9 mm işareti ortadaki düğüme ulaşana kadar yerleştirmek için kuyruk tarafındaki düğümü açın (Şekil 2C-3). Tüm bağları güvenli bir şekilde bağlayın ve heparinize steril salinle yıkayın.
6. Sağ juguler veni, juguler kateter için sağ karotis arter ile aynı kesiden ortaya çıkarın. Kraniyal ucu izole edin ve ipek sütür ile bağlayın (Şekil 2D-1, Malzeme Tablosu). Açıkta kalan damarın kaudal ucuna başka bir dikiş parçası yerleştirin (Şekil 2D-2). Şekil 2D-1 işaretinin yakınındaki damarı yaylı makasla kesin.
7. Kateteri yerleştirin (damarların nüfuz etmesini önlemek için çok derin değil), bağlayın ve kan örneği aldığını görsel olarak onaylayın. Heparinize steril salin (0.2 mL) ile yıkayın ve kateterde kan kalmadığını görsel olarak doğrulayın.
8. İlk yaradan enfeksiyon oluşmasını önlemek için fareyi yeni steril cerrahi örtünün üzerine yerleştirin. Fareyi ters çevirin, üç döngü betadin ile silin, ardından steril alkolle ameliyat öncesi bir hazırlık yapın ve kürek kemikleri arasında küçük bir kesi yapın.
9. Sırttaki kesiden ventral tarafa kadar derinin altına bir iğne tutucu geçirin. Kateterleri iğne tutucu ile sıkıştırın, derinin altından geçirin ve geri getirin. Kesi bölgesini temizleyin ve ventral insizyonları sentetik bir sütürle (çap 0.15-0.2 mm) kapatın. Venöz kateteri omuz bıçakları arasındaki insizyon bölgesinde mikro serrefine ile sıkıştırın.
10. Kateteri kelepçenin 1 cm yukarısından kesin, heparinize salinle yıkayın ve bir kapakla kapatın (adım 2.4). Arteriyel kateter için aynı prosedürü izleyin. Dorsal insizyonu sentetik bir sütürle kapatın (çap 0.15-0.2 mm).
11. Fareyi sıcak, temiz bir kafese yerleştirin (Şekil 2E). Ameliyat sonrası bakımı günlük olarak gerçekleştirin.

3. Kurtarma

1. Fareyi tek başına barındırın, çünkü başka bir fare grup konutundaki kateteri ısırabilir.
   1. Sosyal izolasyon yoluyla stresi azaltmak için, fareleri çevresel zenginleştirmelerle (örneğin barınaklar) tutun. Ameliyat sonrası bakımı günlük olarak gerçekleştirin. Ağrıyı, sıkıntıyı ve rahatsızlığı gidermek için analjezi (içme suyunda ibuprofen (0.11 mg / mL) dahil olmak üzere ameliyat sonrası bakım sağlayın.
   2. Kesi bölgesinde iltihaplanma, uyuşukluk veya ağrı gibi enfeksiyon belirtileri için fareleri gözlemleyin. Sağlıklı farelerin çoğu ameliyattan yaklaşık 2 saat sonra yürümeye ve beslenmeye başlar. Kambur bir duruş, fırfırlı kürk ve azalmış yiyecek alımı ağrıya işaret edebilir. Bu belirtiler gözlenirse, fareleri derin anestezi veya karbondioksit boğulması altında keserek hemen ötenazi yapın.
2. Kan, arterdeki katetere girecek ve bir pıhtı oluşturacaktır. Kateter hatlarını korumak için, 3-6 adımlarını izleyerek pıhtıyı günlük olarak çıkarın.
3. 1 mL'lik bir şırınga ve 23 G iğneyi (keskin olmayan uç) heparinize salin (100 U / mL) ile doldurun. Bir indüksiyon odası kullanarak, fareyi izofluran (% 1.0 -% 1.5) ile hafifçe uyuşturun. Ardından, fareyi odadan çıkarın ve bir burun başlığı ile izofluran anestezisi altında pıhtı çıkarma işlemini gerçekleştirin.
4. Farenin arkasındaki arter borusunu mikro serrefine ile sıkıştırın, kapağı çıkarın ve kanı ve pıhtıları çıkarın. Kateteri 23 G iğneli (keskin olmayan uçlu) başka bir 1 mL şırınga kullanarak heparinize salinle yıkayın ve tekrar kapatın. Şiddetli pıhtılaşma durumunda venöz hattı arteryel hat gibi temizleyin.
5. Kateteri 3-5 gün boyunca günde bir kez temizlemek için aynı işlemi yapın.
6. Farenin vücut ağırlığını kontrol edin. Vücut ağırlığı ameliyat gününden itibaren %10'dan fazla azalırsa, destekleyici bakım uygulayın ve normal vücut kondisyon skorunu iyileştirmeye çalışın ve fareyi başka bir deney için kullanın.
   NOT: Bu çalışmadaki deneylerde hayvanların kilo kaybı %10'dan azdı. Kilo kaybı, sistemik glikoz metabolizmasını güçlü bir şekilde etkileyecektir. Bu nedenle, vücut ağırlığının geri kazanılmasını beklemeniz veya kelepçe deneyinden çıkarmanız önerilir.

4. Pompa sistemini kurun (hipoglisemik kelepçe için)

1. % 0.1 BSA salin,% 30 salin ve heparinize salin içinde 1 U / mL insülin hazırlayın.
2. Farenin vücut ağırlığını ölçün. İnsülinin infüzyonunu yapmak için 1 U / mL insülin hacmini hesaplayın (10 mU / kg / dak). Kelepçe deneyinde farelere 1.7 μL/dk insülin çözeltisi infüze edin. 300 μL insülin infüzyonu yapmak için 1 U/mL insülin (μL) için gerekli hacim 2.647 (μL/g) x Vücut ağırlığıdır (g). 1 farede kelepçe deneyini bitirmek için 300 μL insülin infüzyonu hacmi yeterlidir. Tablo 1 , insülin infüzyonu yapmanın bir örneğini göstermektedir.
3. Her Hamilton şırıngasına insülin infüzyonu ve %30 glikoz doldurun, bunları 1.2 tüpüne bağlayın ve şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin (Şekil 3A). Her çözeltiyi tüpe doldurun 1.2. 1 mL'lik bir şırınga ve boru setine 1.4 salin doldurun (Şekil 2A).
4. Fareyi izofluran (%1.0-%1.5) ile uyuşturun ve tüpü bağlayın1.2 venöz katetere ve tüp seti1.4 arteriyel katetere (Şekil 3A). Tüpleri bir arada tutmak için selofan bant kullanın.
5. Fareyi 500 mL'lik boş bir behere yerleştirin.
   NOT: Hiperglisemik klemp için 1 U/mL insülin yerine salin kullanın.

5. Hipoglisemik kelepçe

1. Şekil 3B'de gösterildiği gibi her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerini ölçün ve -15 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 40 dakika, 60 dakika, 80 dakika, 100 dakika ve 120 dakikada hormon ölçümleri için kan örnekleri toplayın. Kan şekerini ölçmek için adım 5.2'yi izleyin.
   NOT: Kan şekerini her zaman noktasında ölçmek gerekli değildir, ancak en az 10 dakikada bir ölçülmesi önerilir. Kan şekerini, seviyesi ve glikoz infüzyon hızı sabit olmadığında her 5 dakikada bir ölçün.
2. Boru setinin üst ucunu kelepçeleyin1.4 ve yeni bir şırınga bağlayın, 50 μL kan alın ve yıkama için 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Kan şekeri seviyesini ölçün.
   NOT: Bu, önceki örneklemeden sonra kateter yıkama nedeniyle tüpteki salin solüsyonu ile seyreltilen kandır. Seyreltilmiş kanı saf kanla değiştirmek için 50 μL'lik bir hacim yeterlidir.
3. Seyreltilmiş kanı (kırmızı kan hücreleri) saklayın. Biriken kanı (~500 μL) salinle yıkayın (bkz. adım 5.11-5.12) ve hipoksiyi önlemek için vücuda geri dönün.
4. Kateter, yüksek tansiyon ile artere bağlanır, bu nedenle kelepçe gevşetildiğinde kan dışarı akar ve kullanışlı bir glikoz ölçer ile glikozu ölçmek için kullanılır. Yeterli miktarda kan sıvısını tutmak için 50 μL salin infüzyonu yapın.
5. Kan örneklemesi için, 50 μL daha kan alın ve buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. 100 μL (50 μL değiştirme + 50 μL örnekleme) salin demleyin.
6. 0 dakikalık kan şekeri ölçümünden sonra insülin şırınga pompasını çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika (5.1 μL / dak) boyunca bolus içinde 30 mU / kg / dak, daha sonra sürenin geri kalanında 10 mU / kg / dak (1.7 μL / dak) infüzyon demleyin.
7. Kan şekeri seviyesini ölçün ve glikoz infüzyon hızını 120 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir değiştirin.
8. Glikoz infüzyon hızının değişmediği ve kan şekeri seviyesinin 50 mg / dL olduğu kararlı bir durum oluşturun.
9. Kan örneğini t = 120 dakikada topladıktan sonra, juguler damara bir ötenazi ajanı aşılayın ve RNA veya protein analizi için dokuları toplayın.
10. Kanı 5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin ve üreticinin protokolüne göre bir ELISA kiti kullanarak insülin veya c-peptid gibi hormon konsantrasyonunu ölçün.
11. Kanı yıkamak için, kanı 3 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın, 500 μL heparinize salin ekleyin ve pipetleme yapın.
12. Yıkamayı tekrarlayın ve yıkanmış kırmızı kan hücrelerini arter için 1 mL şırıngaya yerleştirin. Adım 5.2 ve 5.3'te 50 veya 100 μL salin infüze edildiğinde kan hücreleri otomatik olarak yeniden infüze edilecektir. Hipoksiyi önlemek için hematokritleri dikkatlice izleyin.
    NOT: Kan şekeri ölçümü için ticari bir kullanışlı glikoz ölçüm cihazı kullanılmıştır.

6. Hiperglisemik kelepçe

1. Adımları hipoglisemik klemp tekniği olarak izleyin, ancak insülin infüzyonu olmadan ve kan şekeri 250-300 mg / dL'ye ayarlanmış. Şekil 3B'de gösterildiği gibi her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerini ölçün ve -15 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 40 dakika, 60 dakika, 80 dakika, 100 dakika ve 120 dakikada hormon ölçümleri için kan örnekleri toplayın.
2. Boru setine yeni bir şırınga bağlayın1.4, 50 μL kan alın ve yıkama için 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
3. Kan örneklemesi için, 50 μL daha kan alın ve buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. 100 μL (50 μL değiştirme + 50 μL örnekleme) salin demleyin.
4. 0 dakikalık kan şekeri ölçümünden sonra, glikoz şırınga pompasını çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika (5.1 μL / dak) boyunca bolus içinde 30 g / kg / dak, ardından sürenin geri kalanında 10 g / kg / dak (1.7 μL / dak) demleyin.
5. Kan şekeri seviyesini ölçün ve glikoz infüzyon hızını 120 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir değiştirin. Glikoz infüzyon hızının değişmediği ve kan şekeri seviyesinin 250-300 mg / dL olduğu, kenetlenmiş bir hiperglisemik durum olan kararlı bir durum oluşturun.

Sonuçlar

Hipoglisemik klemp çalışması, deneyin başlangıcında 3 saat aç kalan erkek C57BL / 6N farelerinde (8 haftalık, 25 g BW'den fazla) gerçekleştirildi (Şekil 4A, B). Başlangıç kan şekeri düzeyi 136 mg/dL (t = -15 dk) idi. 90 mg/dL'den azsa, bunun nedeni ameliyatın iyi gitmemesi veya arteriyel kateterin çok derine yerleştirilmesi veya kan pıhtılarının kan akışına girmesi olabilir. Ameliyat sonrası fare durumu, faredeki enerji metabolizmasını etkiler. ...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntem, pipet uçları, şırıngalar ve sıradan laboratuvarlarda bulunan diğer öğelerle yapılabilecek basit bir yöntemdir. Araştırmacıların ek tüpler ve pompalar satın almaları gerekebilse de, pahalı ekipmanlara gerek yoktur. Bu nedenle, bu kateterizasyon ve klemp protokolünün başlatılması önceki raporlara^{göre daha kolaydır} 12,13,14.

Kelepçe tekniği 1970 ci...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5