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Resumo

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Resumo

As infecções virais podem causar estresse no retículo endoplasmático (RE) devido ao acúmulo anormal de proteínas, levando à resposta proteica desdobrada (UPR). Os vírus desenvolveram estratégias para manipular a RPU do hospedeiro, mas há uma falta de compreensão detalhada da modulação da RPU e seu significado funcional durante a infecção pelo HIV-1 na literatura. Nesse contexto, o presente artigo descreve os protocolos utilizados em nosso laboratório para medir os níveis de estresse do RE e UPR durante a infecção pelo HIV-1 em células T e o efeito da UPR na replicação viral e infectividade.

A coloração com tioflavina T (ThT) é um método relativamente novo usado para detectar o estresse do ER nas células, detectando agregados de proteínas. Aqui, ilustramos o protocolo de coloração ThT em células infectadas pelo HIV-1 para detectar e quantificar o estresse do RE. Além disso, o estresse do RE também foi detectado indiretamente medindo os níveis de marcadores UPR como BiP, IRE1 fosforilado, PERK e eIF2α, splicing de XBP1, clivagem de ATF6, ATF4, CHOP e GADD34 em células infectadas pelo HIV-1, usando immunoblotting convencional e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-PCR). Descobrimos que a fluorescência ThT se correlaciona com os indicadores de ativação da UPR. Este artigo também demonstra os protocolos para analisar o impacto do estresse do RE e da modulação da UPR na replicação do HIV-1 por meio de experimentos de knockdown, bem como o uso de moléculas farmacológicas. O efeito da UPR na expressão/replicação do gene HIV-1 e na produção do vírus foi analisado por ensaios repórter de luciferase e ELISA de captura do antígeno p24, respectivamente, enquanto o efeito na infectividade do vírion foi analisado pela coloração de células repórter infectadas. Coletivamente, este conjunto de métodos fornece uma compreensão abrangente das vias de resposta proteica desdobrada durante a infecção pelo HIV-1, revelando sua intrincada dinâmica.

Introdução

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) é caracterizada por uma redução gradual no número de linfócitos T CD4+, o que leva à falha progressiva da resposta imune. O vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) é o agente causador da AIDS. É um vírus de RNA de fita simples, envelopado, de sentido positivo, com duas cópias de RNA por vírion e pertence à família retroviridae. A produção de altas concentrações de proteínas virais dentro da célula hospedeira coloca estresse excessivo na maquinaria de dobramento de proteínas da célula1. O RE é o primeiro compartimento na via secretora das células eucarióticas. É responsável por produzir, alterar e entregar proteínas à via secretora e aos locais-alvo do espaço extracelular. As proteínas sofrem inúmeras alterações pós-traducionais e se dobram em sua conformação natural no RE, incluindo glicosilação ligada à asparagina e a criação de ligações dissulfeto intra e intermoleculares2. Portanto, altas concentrações de proteínas estão presentes no lúmen do RE e são muito propensas à agregação e dobramento incorreto. Várias condições fisiológicas, como choque térmico, infecções microbianas ou virais, que exigem maior síntese de proteínas ou mutação de proteínas, levam ao estresse do RE devido ao aumento do acúmulo de proteínas no RE, perturbando assim a homeostase do lúmen do RE. O estresse do RE ativa uma rede de vias de transdução de sinal adaptativas altamente conservadas, a Resposta de Proteína Desdobrada (UPR)3. A UPR é empregada para trazer de volta a condição fisiológica normal do RE, alinhando sua carga de proteína desdobrada e capacidade de dobramento. Isso é causado pelo aumento do tamanho do ER e das chaperonas e foldases moleculares residentes no ER, resultando em uma elevação da capacidade de dobramento do ER. A UPR também diminui a carga proteica do RE por meio da atenuação da síntese global de proteínas no nível translacional e aumenta a depuração de proteínas desdobradas do RE pela regulação positiva da degradação associada ao ER (ERAD) 4 , 5 .

O estresse do ER é detectado por três proteínas transmembranares residentes no ER: Proteína quinase R (PKR) - semelhante à quinase endoplasmática do retículo (PERK), Fator de transcrição ativador 6 (ATF6) e Inositol - Todos esses efetores são mantidos inativos pela ligação ao membro 5 (HSPA5) da família A da proteína de choque térmico chaperona (Hsp70), também conhecida como proteína de ligação (BiP) / proteína regulada por glicose de 78 kDa (GRP78). Após o estresse do RE e o acúmulo de proteínas desdobradas/mal dobradas, o HSPA5 se dissocia e leva à ativação desses efetores, que então ativam uma série de alvos a jusante que ajudam a resolver o estresse do RE e, em condições extremas, promovem a morte celular6. Após a dissociação do HSPA5, o PERK se autofosforila e sua atividade quinase é ativada7. Sua atividade quinase fosforila eIF2α, o que leva à atenuação translacional, diminuindo a carga proteica do ER8. No entanto, na presença do fator de iniciação fosfo-eucariótico 2α (eIF2α), quadros de leitura abertos não traduzidos em mRNAs específicos tornam-se preferencialmente traduzidos, como ATF4, regulando genes induzidos por estresse. ATF4 e proteína homóloga C/EBP (CHOP) são fatores de transcrição que regulam genes induzidos por estresse e regulam as vias de apoptose e morte celular 9,10. Um dos alvos do ATF4 e do CHOP é a proteína induzível por danos ao DNA (GADD34), que, juntamente com a proteína fosfatase 1, desfosforila peIF2α atua como um regulador de feedback para atenuação translacional11. Sob estresse ER, o ATF6 se dissocia do HSPA5 e seu sinal de localização de Golgi é exposto, levando à sua translocação para o aparelho de Golgi. No aparelho de Golgi, o ATF6 é clivado pela protease do sítio 1 (S1P) e pela protease do sítio 2 (S2P) para liberar a forma clivada do ATF6 (ATF6 P50). O ATF6 p50 é então translocado para o núcleo, onde induz a expressão de genes envolvidos no dobramento, maturação e secreção de proteínas, bem como na degradação de proteínas12,13. Durante o estresse do RE, o IRE1 se dissocia do HSPA5, multimeriza e autofosforila14. A fosforilação de IRE1 ativa seu domínio RNase, mediando especificamente o splicing de 26 nucleotídeos da parte central do mRNA da proteína de ligação X-box 1 (XBP1) 15 , 16 . Isso gera um novo terminal C que confere função de transativação, gerando a proteína XBP1s funcional, um potente fator de transcrição que controla vários genes induzidos por estresse do ER17,18. A atividade combinada desses fatores de transcrição ativa programas genéticos destinados a restaurar a homeostase do RE.

Existem vários métodos para detectar estresse de ER e UPR. Estes incluem os métodos convencionais de análise dos marcadores UPR 19,20. Vários métodos não convencionais incluem a medição do estado redox da UPR e da distribuição de cálcio no lúmen do RE, bem como a avaliação da estrutura do RE. A microscopia eletrônica pode ser usada para ver o quanto o lúmen do RE aumenta em resposta ao estresse do RE nas células e tecidos. No entanto, esse método é demorado e depende da disponibilidade de um microscópio eletrônico, que pode não estar disponível para todos os grupos de pesquisa. Além disso, medir o fluxo de cálcio e o estado redox do RE é um desafio devido à disponibilidade de reagentes. Além disso, a leitura desses experimentos é muito sensível e pode ser afetada por outros fatores do metabolismo celular.

Uma técnica poderosa e simples para monitorar as saídas da UPR é medir a ativação das diferentes vias de sinalização da UPR e tem sido usada há décadas em vários cenários de estresse. Esses métodos convencionais para medir a ativação da UPR são econômicos, viáveis e fornecem as informações em menos tempo em comparação com outros métodos conhecidos. Isso inclui immunoblotting para medir a expressão de marcadores UPR no nível da proteína, como fosforilação de IRE1, PERK e eIF2α e clivagem de ATF6 medindo a forma P50 de ATF6 e expressão proteica de outros marcadores, como HSPA5, XBP1 emendado, ATF4, CHOP e GADD34, bem como RT-PCR para determinar os níveis de mRNA, bem como splicing de mRNA de XBP1.

Este artigo descreve um conjunto validado e confiável de protocolos para monitorar o estresse do ER e a ativação da UPR em células infectadas pelo HIV-1 e para determinar a relevância funcional da UPR na replicação e infectividade do HIV-1. Os protocolos utilizam reagentes facilmente disponíveis e econômicos e fornecem informações convincentes sobre os resultados da UPR. O estresse do RE é o resultado do acúmulo de proteínas desdobradas/mal dobradas, que são propensas a formar agregados proteicos21. Descrevemos um método para detectar esses agregados proteicos em células infectadas pelo HIV-1. A coloração com tioflavina T é um método relativamente novo usado para detectar e quantificar esses agregados proteicos22. Beriault e Werstuck descreveram essa técnica para detectar e quantificar agregados de proteínas e, portanto, níveis de estresse de ER em células vivas. Foi demonstrado que a pequena molécula fluorescente tioflavina T (ThT) se liga seletivamente a agregados de proteínas, especialmente fibrilas amilóides.

Neste artigo, descrevemos o uso de ThT para detectar e quantificar o estresse do ER em células infectadas pelo HIV-1 e correlacioná-lo com o método convencional de monitoramento da UPR, medindo a ativação de diferentes vias de sinalização da UPR.

Uma vez que também há uma falta de informações abrangentes sobre o papel da UPR durante a infecção pelo HIV-1, fornecemos um conjunto de protocolos para entender o papel da UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion. Esses protocolos incluem o knockdown mediado por lentivírus de marcadores UPR, bem como o tratamento com indutores farmacológicos de estresse de RE. Este artigo também mostra os tipos de leitura que podem ser usados para medir a expressão do gene HIV-1, a produção viral, bem como a infectividade dos vírions produzidos, como ensaio de luciferase baseado em repetição terminal longa (LTR), ensaio de imunoabsorção enzimática p24 (ELISA) e ensaio de coloração repórter de β-gal, respectivamente.

Usando a maioria desses protocolos, relatamos recentemente a implicação funcional da infecção pelo HIV-1 na UPR em células T23, e os resultados desse artigo sugerem a confiabilidade dos métodos aqui descritos. Assim, este artigo fornece um conjunto de métodos para informações abrangentes sobre a interação do HIV-1 com o estresse do RE e a ativação da UPR.

Protocolo

NOTA: As linhagens celulares usadas aqui são HEK-293T e Jurkat J6 (uma linhagem celular CD4+T), que foram obtidas do Cell Repository, NCCS, Pune, Índia; TZM-bl, uma linhagem celular derivada de HeLa que integrou cópias dos genes da β-galactosidase e luciferase sob o promotor de repetição terminal longa (LTR) do HIV-124 e CEM-GFP (outra linhagem celular repórter T CD4+)25 foram obtidos do NIH AIDS Repository, EUA.

1. Preparação e armazenamento de estoque do vírus HIV-1

  1. Preparação do estoque do vírus HIV-1
    NOTA: É aconselhável praticar as diretrizes internacionais relacionadas à biossegurança, conforme disponíveis no manual da Organização Mundial da Saúde (OMS) ou dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em todos os experimentos envolvendo o HIV-1. O manuseio do vírus e qualquer experimento com o vírus vivo só deve ser feito em um gabinete de biossegurança apropriado alojado em pelo menos um laboratório de contenção de nível BSL2. A produção de partículas infecciosas de HIV-1 usando um kit de transfecção de fosfato de cálcio em mamíferos é descrita neste segmento do protocolo.
    1. Semear células HEK-293T em placas de 90 mm com 10 mL de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) completo (suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina) em um gabinete de biossegurança classe II tipo A2 e manter por aproximadamente 12 h em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C para que a confluência das células fique entre 50% -60%.
    2. No dia seguinte, faça a mistura de transfecção: Prepare a Solução A contendo 25 μg de DNA plasmidial pNL4.3 (um clone molecular do HIV-1) em tampão estéril, 86,8 μL de CaCl2 M e a água estéril restante para fazer o volume final de 700 μL para cada placa. Prepare a Solução B contendo 700 μL de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS) para 1 placa. Em seguida, ajuste o cálculo para o número total de placas.
    3. Agora adicione a Solução B à Solução A de maneira gota a gota enquanto vórtice continuamente a Solução A. O volume total da mistura de transfecção agora se torna 1,4 mL para uma placa.
      NOTA: A adição precisa de solução B à solução A enquanto o vórtice contínuo leva à formação de complexos de transfecção perfeitos.
    4. Incube esta mistura à temperatura ambiente (RT) por cerca de 20 min. Em seguida, adicione lentamente a mistura gota a gota a cada placa contendo 9 mL de DMEM completo e transfira as placas para a incubadora de CO2 . Após 8-10 h, troque o meio existente por 10 mL de DMEM completo.
    5. Após 24 h após a troca do meio, colete o sobrenadante (que contém as partículas do vírus) de todas as placas em tubos cônicos. Centrifugue a 600 x g por 5 min usando uma centrífuga de mesa de baixa velocidade (Tabela de Materiais) para remover os detritos das células.
    6. Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga polialômero e coloque-os no rotor basculante de uma ultracentrífuga (Tabela de Materiais). Verifique os pesos dos suportes dos tubos quanto ao equilíbrio e ajuste com um meio estéril, se necessário.
    7. Ultracentrífuga a 1,41,000 x g durante 2,5 h a 4 °C. Depois disso, retire cuidadosamente os tubos e decanta o sobrenadante lentamente dentro do gabinete de biossegurança.
    8. Ao pellet (que é o vírus concentrado agora) em cada tubo, adicione 1 mL de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incompleto e faça uma pipetagem vigorosa para desalojar o pellet.
      NOTA: O pellet após a ultracentrífuga é quase invisível a olho nu. Portanto, deve-se certificar-se de adicionar RPMI 1640 no meio do tubo para que o pellet seja desalojado corretamente.
    9. Em seguida, adicione 25 μL de HEPES 1 M pH 7,4 a 1 mL de suspensão do vírus. Alíquota 50 μL da suspensão para tubos de centrífuga de 1,5 mL e armazene-os imediatamente em um freezer a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
  2. Quantificação da concentração do vírus e infectividade do vírion
    NOTA: Para calcular a infectividade do vírus, é essencial primeiro quantificar sua concentração, o que é feito por ELISA de captura de antígeno p24 (de acordo com as instruções do fabricante e, portanto, não está sendo descrito aqui; consulte a Tabela de Materiais). Esse processo fornece a concentração do vírus em nanogramas por microlitro (ng / μL) do estoque, que é então usado para identificar o número de vírion infectante no estoque por meio do seguinte experimento em células repórter TZM-bl26.
    1. Conte e semeie 0,1 x 106 células TZM-bl em uma placa de 24 poços usando 500 μL de DMEM completo para cada poço e mantenha-o em uma incubadora de cultura de células por 10-12 h.
    2. Certifique-se de que as células sejam 50% -60% confluentes antes de iniciar a infecção para quantificação do vírus. Troque o meio existente com 250 μL de DMEM completo fresco para cada poço.
      NOTA: Mantenha um controle positivo bem para descartar qualquer falha experimental.
    3. Calcule a quantidade de vírus de estoque necessária para infecções de 1 ng, 0,1 ng e 0,01 ng em duplicatas. Adicionar a quantidade adequada de vírus aos alvéolos e manter a placa na incubadora a 37 °C durante 4 h.
    4. Lave as células duas vezes com 500 μL de DMEM incompleto e, em seguida, adicione 500 μL de DMEM completo.
    5. Prossiga com o procedimento de coloração de β gal após 36 h de troca de meio.
      1. Descarte o meio existente e lave as células duas vezes com 1 mL de PBS. Fixe as células adicionando 500 μL da solução de fixação (0,25% de glutaraldeído em PBS) a cada poço e incube em RT dentro do gabinete de biossegurança por 5-7 min.
      2. Prepare a solução de coloração conforme indicado na Tabela 1. Mantenha-o longe da luz, pois o X-gal é sensível à luz.
      3. Lave as células uma vez com 1 mL de PBS. Cubra as células com 500 μL de solução de coloração recém-preparada e incube a 37 ° C no escuro por 2-18 h.
      4. Para interromper a reação posteriormente, enxágue as células com 500 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a 3% em PBS duas vezes e, em seguida, mantenha as células em 500 μL de PBS fresco.
      5. Conte as células infectadas azuis (como mostrado na Figura 1A) ao microscópio com ampliação de 10x para 5 campos aleatórios. Faça uma contagem média dos 5 campos e multiplique-a pelo fator de campo e pelo fator de diluição. Isso quantifica as partículas de vírion infectantes no estoque de vírus.
        NOTA: Para uma placa de 24 poços, o fator de campo é 75.
ComponentesPreparaçãoVolume necessário
PBSPrepare 1x PBS a partir de um estoque de 10x PBS14 mL
Cianeto de ferro-ferro de potássioDissolva 0,82 g de Ferricianeto de Potássio e 1,06 g de Ferrocianeto de Potássio em 25 mL de 1x PBS0,75 mL
Cloreto de magnésio1 M em 1 mL de 1x PBS15 μL
X-galDissolver 30 mg em 0,6 ml de N,N-dimetilformamida (no escuro)0,3 mL
Total = 15 mL

Tabela 1: Lista de componentes necessários para a coloração de β-gal em células TZM-bl.

2. Infecção por HIV-1 de linhagens de células T

  1. Descongele e cultive uma linhagem de células T imortalizada. Este estudo utilizou a linhagem celular CEM-GFP cultivada em meio RPMI 1640 completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 500 μg/mL G418.
  2. Conte e pegue 2 milhões de células para cada ponto de tempo (Não infectado, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h). Colha as células não infectadas imediatamente centrifugando a 100 x g por 5 min e adicione tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), suplementado com coquetel inibidor de protease, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 1x inibidor de fosfatase (50 μL para 1-3 milhões de células) ou lise em reagente Trizol (1 mL para 1-3 milhões de células) para isolamento de RNA (ver Tabela de Materiais).
  3. Lave as células uma vez com 1 mL de meio RPMI 1640 completo contendo polibreno (5 μg / mL) a 100 x g por 5 min em RT. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo.
    NOTA: Polybrene é um polímero catiônico usado para aumentar a infecção retroviral em células de mamíferos.
  4. Ressuspenda os 8 milhões de células em 1 mL de polibreno contendo meio completo. Agora calcule o volume de estoque viral necessário para 4 milhões de partículas de vírion, adicione o estoque de vírus e perfaça o volume total para 2 mL adicionando meios completos. Isso o torna um MOI de 0,5.
  5. Mantenha as células dentro da incubadora de CO2 a 37 °C por 4 h, com batidas intermitentes a cada 30-45 min.
  6. Após 4 h, gire as células e descarte o sobrenadante cuidadosamente dentro do gabinete de biossegurança com métodos de descarte adequados.
    NOTA: A partir desta etapa, centrifugue as células a 100 x g por 5 min em RT.
  7. Lave as células duas vezes com 1 mL de meio incompleto. Ressuspenda as células em 8 mL de meio completo, tornando-se 1 milhão de células/mL.
  8. Numa placa de cultura de tecidos de 6 poços, semear um número igual de células no número necessário de alvéolos e manter a placa numa incubadora de CO2 mantida a 37 °C.
  9. Nos próximos 4 dias, colha as células a cada 24 h adicionando tampão de lise celular. Além disso, recolher o sobrenadante e transferi-lo imediatamente para o congelador a -80 °C.
  10. Para verificar se a infecção ocorreu, prossiga para o ELISA de captura do antígeno p24 para todos os pontos de tempo. Faça diluições adequadas para os pontos de tempo, ou seja, uma diluição menor para os pontos de tempo iniciais e maior para os posteriores, variando de 1:50 a 1:500. Plote as leituras em um gráfico que descreva a progressão da infecção (Figura 1B).

3. Coloração T de tioflavina para determinar o estresse do RE

  1. Fixe 1 milhão de células CEM-GFP não infectadas e 0,5 MOI infectadas (tomadas 72 h de células infectadas) com 200 μL de paraformaldeído a 4% em PBS por 20 min em RT.
  2. Pulverize as células a 100 x g por 5 min e trate com 500 μL de glicina 0,1 M por 5 min, seguido de lavagem com 500 μL de PBS duas vezes. Ressuspenda as células em 100 μL de PBS.
  3. Monte as lâminas de vidro, cartões de filtro e câmaras de amostra. Adicione os 100 μL de células ressuspensas às câmaras de amostra e gire as células a 1000 x g por 4 min para aderir as células às lâminas em uma citocentrífuga (Tabela de Materiais).
    NOTA: Não haveria células suficientes imobilizadas na lâmina após a centrifugação da citocentrífuga se a suspensão celular estiver muito diluída. É provável que as células se aglomerem e sejam mal distribuídas após a citocentrífuga, se a suspensão celular estiver muito concentrada.
  4. Permeabilize as células por 10 min usando gotas de 0,1% de Triton-X-100 em PBS (o suficiente para cobrir a área onde as células aderiram) e lave as células duas vezes colocando PBS gota a gota e limpando o PBS com tecido inclinando a lâmina.
  5. Incube as células com 10 μL de 5 μM de tioflavina T por 30 min.
    NOTA: Não lave após a incubação com ThT.
  6. Monte as lâminas usando 5 μL de mídia de montagem (80% de glicerol v / v, 20% de PBS v / v e 8 mg / mL de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano [DABCO]), coloque a lamínula e sele a lamínula com esmalte. Deixe as lâminas secarem.
    NOTA: Em todas essas etapas, certifique-se de que as células não sequem.
  7. Tire as imagens confocais de células fixas com uma lente de imersão de glicerol 63x em um microscópio confocal (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste as seguintes configurações de excitação e emissão: GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) e ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    NOTA: Cada canal fluorescente deve ser fotografado sequencialmente, em vez de simultaneamente, para evitar a sobreposição de canais. A GFP foi considerada a indicação de infecção pelo HIV-1, pois as células CEM-GFP têm GFP sob a regulação do promotor LTR, que dispara após a infecção pelo HIV-125.
  8. Converta as imagens fluorescentes em 8 bits antes de quantificar por análise de limiar. Quantifique a intensidade de cada célula manualmente usando um software como o Image J (~ 50 células) 27 . Plote o gráfico com a intensidade de cada célula como pontos no eixo Y em relação aos critérios não infectados e infectados.
  9. Para demonstrar a eficácia deste protocolo, tome um controle positivo, por exemplo, o tratamento com Thapsigargin (conhecido indutor de estresse do RE) neste caso28. Trate 1 milhão de células CEM-GFP, cada uma com 1 μL de DMSO (controle veicular) e 100 nM de Thapsigargin por 12 h.
  10. Colha as células e processe a coloração ThT conforme mencionado para amostras infectadas (etapas 3.1-3.8).
    NOTA: Para essas amostras, a fluorescência GFP não é necessária. Portanto, apenas a fluorescência ThT é capturada na microscopia confocal.

4. Determinação da ativação e expressão de vários marcadores UPR

NOTA: Para determinar a expressão dos marcadores UPR são utilizados dois métodos: Immunoblotting e RT-PCR. Para immunoblotting, colha as células CEM-GFP infectadas com 0,5 MOI HIV-1 em vários pontos de tempo pós-infecção (24 h, 48 h, 72 h e 96 h pós-infecção) e ressuspenda o pellet celular em tampão de lise (conforme mencionado na etapa 2.2). Alternativamente, para RT-PCR, os grânulos celulares são lisados no reagente Trizol (1 mL para 1-3 milhões de células) (ver Tabela de Materiais). As células ressuspensas em tampão de lise e o reagente Trizol podem ser armazenados a -80 °C até nova utilização.

  1. Immunoblotting para análise de marcadores UPR.
    1. Mantenha as células ressuspensas no tampão de lise no gelo por 45 min com mistura intermitente usando um vórtice.
    2. Derrube as células a 18000 x g por 15 min usando uma centrífuga de bancada de alta velocidade (consulte a Tabela de Materiais). Recolher o sobrenadante num tubo novo.
    3. Quantificar a concentração de proteínas em cada amostra utilizando Bradford ou um reagente semelhante.
    4. Pegue uma concentração igual de proteína para cada amostra e prepare as amostras de proteína em tampão Laemmli (6x tampão: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol; 5% β-mercaptoetanol).
      NOTA: Para immunoblotting para cada marcador UPR, foi utilizado um mínimo de 60-80 μg de proteína.
    5. Ferva as amostras de proteína a 96 °C por 5 min e dê uma volta curta.
    6. Resolva as amostras de proteína em um gel SDS-PAGE a 10% -12% e transfira as proteínas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (consulte a Tabela de Materiais).
    7. Bloqueie com 5% de leite em pó desnatado ou albumina de soro bovino (BSA) por 1-2 h, lave duas vezes com TBST (20 mM Tris pH7,4 e 0,137 M NaCl; 0,1% Tween 20) e sonde com anticorpos primários específicos de proteína contra marcadores UPR (consulte a Tabela de Materiais) em um balancim, durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, após lavar os borrões duas vezes com TBST, sondar com os respectivos anticorpos secundários por 1,5 h.
    8. Lave os borrões novamente com TBST e visualize as bandas de proteína usando um substrato de detecção de quimioluminescência (consulte a Tabela de Materiais) em um instrumento de imagem de western blot.
  2. RT PCR
    1. Isole o RNA total das células usando o reagente Trizol (ver Tabela de Materiais).
    2. Prepare o cDNA a partir de igual concentração de RNA usando a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV-RT) (ver Tabela de Materiais).
    3. Analisar a modulação da expressão de mRNA de HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP e GADD34 emendados usando qRT-PCR com primers específicos de genes (Tabela 2). Resumidamente, prepare 10 μL de misturas de reação contendo molde de cDNA (100 ng), 5 μL de corante SYBR Green (ver Tabela de Materiais) e 10 pmol de cada par de primers de oligonucleotídeos específicos do gene. Ajuste o volume usando H2O estéril.
    4. Execute as misturas em uma máquina de PCR em tempo real usando o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min e 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s, seguido pela análise da curva de fusão. Calcule a mudança de dobra na expressão do gene alvo em relação ao gene de manutenção (por exemplo, β-Actina) como:
      Mudança de dobra = 2-Δ(ΔCT)
      Onde ΔCT = CT (alvo) − CT (gene de manutenção)
      e Δ(ΔCT) = ΔCT (tratado) -ΔCT (controle)
    5. Para confirmar ainda mais o splicing de XBP1, realize um RT-PCR semiquantitativo com amostras não infectadas e infectadas por 72 h.
      NOTA: O splicing do mRNA XBP-1 é estudado usando RT-PCR no local do splice.
    6. Amplificar o cDNA com primers XBP1 (Tabela 2) usando uma mistura principal de PCR de alta fidelidade (ver Tabela de Materiais) nas seguintes condições: 1 ciclo de 98 °C por 30 s, seguido por 5 ciclos de 98 °C por 15 s, 65*Δ-5 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, seguido por 30 ciclos de 98 °C por 15 s, 55 °C durante 30 s e 72 °C durante 30 s, seguida de uma extensão final de 72 °C durante 10 min e manutenção a 4 °C.
    7. Separe os amplicons em um gel de agarose a 2,5% contendo 50 ng de brometo de etídio / mL e visualize em um instrumento de gel doc. A banda XBP1 emendada é menor em 26 nucleotídeos.

5. Knockdown de marcadores UPR e análise da expressão gênica orientada por HIV-1 LTR e produção de vírus

  1. Preparação de construções de shRNA para knockdown de marcadores UPR
    1. Crie construções shRNA usando o esqueleto do vetor pLKO.1-TRC (vetor de clonagem lentiviral) 29 .
    2. Construa duas construções de shRNA para cada gene (IRE1, PERK, ATF6 e HSPA5). Os oligonucleotídeos sense e anti-sense direcionados ao mRNA do respectivo gene são projetados pelo RNAi Consortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabela 3).
      NOTA: De maneira semelhante, construções de shRNA podem ser feitas para outros marcadores UPR.
    3. Recozer os primers (100 nM cada um para frente e para trás) a 95 °C, seguido de resfriamento gradual até RT.
    4. Em seguida, ligue-o aos sítios Age1 e EcoRI do vetor pLKO.1 usando uma DNA ligase T4 (consulte a Tabela de Materiais). Confirme a sequência por sequenciamento de DNA.
      NOTA: Uma construção shRNA direcionada ao gene LacZ é usada como um controle não direcionado.
  2. Knockdown de PERK, ATF6, IRE1 e HSPA5 em células HEK-293T, ensaio de luciferase e ELISA p24
    1. Prepare uma mistura de construção shRNA (0,9 μg) e um reagente de transfecção como polietilenonimina (PEI) (3 μL de PEI para 1 μg de DNA) (ver Tabela de Materiais) em 50 μL de meio livre de soro por vórtice e incubar por 20 min.
    2. A partir de células HEK-293T confluentes contendo frasco, tripsinizar e semear ~ 0,25 x 106 células junto com a mistura de transfecção em uma placa de 24 poços, perfazendo o volume total de 125 μL e incubar por 6 h a 37 ° C em uma incubadora de CO2 . Este método é chamado de transfecção reversa, onde as células são semeadas junto com a mistura de transfecção.
    3. Após 6 h, adicione 125 μL de meio completo aos poços e ressuspenda as células para uma semeadura uniforme.
      NOTA: Para experimentos de knockdown, a transfecção reversa (etapas 5.2.1-5.2.3) oferece melhor eficiência com shRNAs e siRNAs.
    4. Após 24 h, realizar uma segunda transfecção. Prepare uma mistura de construções pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) e pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) com PEI (3 μL de PEI para 1 μg de DNA) em 50 μL de meio incompleto por vórtice. Incubar a mistura durante 20 min a RT. Substituir o meio existente por 250 μL de meio incompleto fresco e adicionar a mistura às células.
      NOTA: Um vetor repórter para o HIV-1 LTR foi desenvolvido por subclonagem de LTR de pU3RIII30,31 em pGL3basic em laboratório anteriormente32. A expressão de GFP usando pEGFP-N1 foi utilizada para normalizar a eficiência da transfecção32.
    5. Troque o meio após 6 h após a transfecção com 500 μL de DMEM completo. Colha as células após 36 h para imunotransferência e ensaio de luciferase.
    6. Para o ensaio de luciferase, esfole as células e ressuspenda em um substrato de luciferase adquirido comercialmente (50 μL) (ver Tabela de Materiais). Adicione o lisado de células ressuspensas a uma placa opaca de 96 poços e incube por 10-15 min. Obtenha a leitura da luciferase em um luminômetro. Meça também a fluorescência GFP nas mesmas amostras para normalizar a leitura da luciferase em um leitor de placas micromodo de microplacas (Ex: 494 nm, Em: 519 nm).
    7. Plote o gráfico como a unidade Luciferase / GFP no eixo Y.
      NOTA: O knockdown dos respectivos marcadores UPR deve ser verificado e pode ser feito por immunoblotting ou qRT-PCR usando anticorpos específicos do gene ou primers, respectivamente.
    8. Colete os sobrenadantes para processar o ELISA p24 conforme mencionado acima.
  3. Criação de células estáveis com knockdown de marcadores UPR e infecção pelo HIV-1.
    1. Prepare as partículas de lentivírus transfectando células HEK-293T semeadas em uma placa de 6 poços, com as respectivas construções de shRNA (1 μg) junto com pMD2.G (vetor de envelope VSV-G) (0,75 μg) e psPAX2 (plasmídeo de embalagem lentiviral) (0,25 μg) (ver Tabela de Materiais) usando PEI na proporção de 1 μg de DNA: 3 μL de PEI. Prepare a mistura em 100 μL de DMEM incompleto e incube por 20 min em RT. Adicione a mistura a 1,8 mL de meio completo nas células HEK-293T semeadas.
      NOTA: Semeie as células HEK-293T em uma placa de 6 poços pelo menos 12 h antes da transfecção até que ganhem morfologia e sejam aproximadamente 60-70% confluentes.
    2. Após 24 h de transfecção, adicione 1 mL de DMEM completo a cada poço.
    3. Colete os sobrenadantes após 48 h, armazene a -80 ° C freezer e execute p24 ELISA para confirmar a presença do vírus nesses sobrenadantes. Use este sobrenadante lentiviral bruto para transduzir células J6.
    4. Incube 2 milhões de células em uma placa de 6 poços com um volume igual de sobrenadante lentiviral (500 μL) para cada controle e lentivírus knockdown específico do gene e adicione meio RPMI 1640 completo fresco na presença de polibreno (5 μg / mL) para perfazer o volume para 2 mL.
    5. Após 24 h, adicione Puromicina (1 μg/mL) a cada poço para selecionar células estáveis. Depois de adicionar Puromicina, pellet as células a cada 24 h e adicione 2 mL de meio fresco com Puromicina.
    6. Faça isso até que não haja morte celular (~ 1 semana). As células sobreviventes são as células estáveis com o knockdown do gene desejado.
      NOTA: O knockdown dos respectivos genes pode ser verificado em intervalos regulares e, finalmente, quando apenas as células sobreviventes são visíveis em meios contendo puromicina usando immunoblotting ou qRT-PCR.
    7. Infecte o LacZ e as células knockdown específicas do gene com 0,5 MOI de HIV-1, conforme descrito na seção 2, e colha as células 48 h após a infecção.
    8. Colete o sobrenadante de cada amostra e processe para p24-ELISA conforme descrito anteriormente e processe as células para verificar o nível de knockdown por immunoblotting.

6. Tratamento com indutor de estresse ER e análise de seu efeito na replicação do HIV-1

NOTA: Para determinar o efeito da superestimulação da UPR durante a replicação do HIV-1, a molécula indutora farmacológica, Thapsigargin, pode ser usada.

  1. Determinando a porcentagem de viabilidade celular após o tratamento com Thapsigargin.
    NOTA: A citotoxicidade da Thapsigargin é determinada pelo reagente MTT (ver Tabela de Materiais).
    1. Semeie 25.000-30.000 células CEM-GFP por poço em uma placa de 96 poços contendo 100 μL de RPMI 1640 completo. Adicione 100 nM de Thapsigargin ao meio e incube a 37 °C em uma incubadora.
      NOTA: As células tratadas com 1 μL de DMSO foram tomadas como controle do veículo.
    2. Após 48 h, adicione 10 μL de MTT (5 mg / mL) em cada poço e incube no escuro por 4 h para a formação de cristais de formazan a 37 ° C com 5% de CO2.
    3. Após 4 h, dissolver os cristais com 100 μL de isopropanol para formar uma cor púrpura e medir a absorvância a 570 nm com um espectrofotómetro.
    4. Calcule a porcentagem de viabilidade celular com base na equação abaixo
      % de viabilidade celular = (ControleOD570 - TratamentoOD570)/ ControleOD570 x 100
  2. Pré-tratamento de Thapsigargin e análise da progressão da infecção pelo HIV-1 por ELISA p24.
    1. Semear 1 milhão de células CEM-GFP em uma placa de 12 poços contendo 1 mL de RPMI 1640 completo e tratar as células com 100 nM de Thapsigargin ou 1 μL de DMSO (controle do veículo) por 12 h em uma incubadora de CO2 mantida a 37 ° C. Após 12 h, lave as células com RPMI 1640 completo e infecte com 0,5 MOI de HIV-1 conforme descrito anteriormente.
    2. Colha as células em diferentes momentos, como 24 h, 48 h e 72 h pós-infecção, para immunoblotting.
    3. Coletar os sobrenadantes de cada amostra e realizar o ELISA p24 conforme descrito anteriormente.
    4. Plote o gráfico com a concentração de p24 na amostra como o eixo Y e os respectivos pontos de tempo como o eixo X.
    5. Usando immunoblotting, analise a indução de estresse do RE devido ao tratamento com Thapsigargin, medindo o nível de quaisquer marcadores UPR. Este estudo utilizou HSPA5 como marcador.

7. Ensaio de infectividade de β-gal TZM-bl para determinar o efeito da UPR na infectividade do vírion

NOTA: Para entender o papel da UPR na infectividade do vírion, o sobrenadante do knockdown, bem como o tratamento com Thapsigargin, podem ser usados para o ensaio de infectividade TZM-bl β-gal, conforme descrito na seção 1.2, com base na concentração de p24 determinada pelo ELISA p24.

  1. Infecte as células TZM-bl com uma concentração igual de p24 de cada amostra e realize a coloração de β-gal. Conte as células infectadas azuis ao microscópio com ampliação de 10x para 5 campos aleatórios.
  2. Faça uma média da contagem dos 5 campos para cada amostra das etapas acima.
  3. Calcule a mudança de dobra conforme mencionado abaixo:
    Mudança de dobra = Número médio de células azuis nas amostras de teste/Número médio de células azuis na amostra de controle.

Resultados

Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para estudar o estresse in vitro do RE e a ativação da UPR após a infecção pelo HIV-1 em células T (Figura 2). Este estudo também descreve métodos para analisar a relevância funcional da UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion (Figura 3).

Para isso, analisamos o estresse do RE causado pela infecção pelo HIV-1, ob...

Discussão

O escopo do presente protocolo inclui (i) o manuseio dos estoques do vírus HIV-1 e a medição da concentração do vírus e da infectividade do vírion, (ii) Infecção de células T com HIV-1 e avaliação de seu efeito no estresse do ER e diferentes marcadores de UPR, (iii) Efeito do knockdown de marcadores UPR e seu efeito na atividade gênica do HIV-1 LTR, produção de vírus e infectividade do vírion e (iv) Superestimulação da UPR usando molécula farmacológica e analisando ...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro Nacional de Ciência Celular, Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, pelo apoio interno. AT e AD são gratos pelo Ph.D. apoio à pesquisa recebido do Centro Nacional de Ciência Celular, Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. DM agradece a bolsa nacional JC Bose da SERB, Governo da Índia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamamideBiorad, USA1610107
AgaroseG-Biosciences, USARC1013
Ammonium persulphateSigma-Aldrich, USAA3678
anti-ATF4 antibodyCell Signaling Technology, USA11815Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibodyAbcam, UKab122897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibodyCell Signaling Technology, USA2897Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibodyAbcam, UKab236516Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibodyCell Signaling Technology, USA3177Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibodyCell Signaling Technology, USA3294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody Biorad, USA1706516Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibodyInvitrogen, USA44-728GWestern blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibodyCell Signaling Technology, USA5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibodyAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibodyInvitrogen, USAPA5-40294Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibodyBiorad, USA1706515Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibodyAbcam, UKab37152Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifugeEppendorf, USA5804RRotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifugeEppendorf, USA5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, USA1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford reagentBiorad, USA5000006
CalPhos mammalian Transfection kitClontech, Takara Bio, USA631312Virus stock preparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL substrateBiorad, USA1705061chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrateBiorad, USA1705062chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscopeOlympus, JapanModel:FV3000
Cytospin centrifugeThermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
EtBrInvitrogen, USA`15585011
Fetal Bovine SerumInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Glutaraldehyde 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Infectivity assay
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Inverted microscopeNikon, JapanModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, USAM8266Infectivity assay
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT reagentSigma-Aldrich, USAM5655Cell viability assay
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255Infectivity assay
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 antigen capture ELISA kitABL, USA5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
Penicillin/StreptomycinInvitrogen, USA151140122
Phosphatase InhibitorSigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Potassium ferricyanideSigma-Aldrich, USA244023Infectivity assay
Potassium ferrocyanideSigma-Aldrich, USAP3289Infectivity assay
Protease InhibitorSigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260Lentiviral packaging plasmid
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Selection of stable cells
PVDF membraneBiorad, USA1620177
Random primersInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo substratePromega, USAE2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, USAT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
UltracentrifugeBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Infectivity assay

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