Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Resumo

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Resumo

Óptico de imagem (OI) é uma ferramenta fácil, rápida e barata para a monitorização in vivo de terapias à base de células-tronco novo. A técnica é baseada na rotulagem ex vivo de células-tronco com um corante fluorescente, injeção intravenosa subsequente das células rotuladas e visualização de sua acumulação em órgãos-alvo específicos ou patologias. A técnica apresentada demonstra como nós rotulamos células-tronco mesenquimais (hMSC) por incubação simples com o corante lipofílico fluorescente DiD (C67H103CIN2O3S) e como nós rotulamos células-tronco embrionárias (CTEh) com o FDA aprovou o corante fluorescente indocianina verde (ICG). O mecanismo de absorção é através de adesão e difusão do corante lypophilic através da bicamada fosfolipídica da membrana celular. A eficiência de marcação é normalmente melhorado se as células são incubadas com o corante, isento de soro de mídia em vez de incubação em soro contendo mídia. Além disso, a adição do sulfato de protamina transfecção agente melhora significativamente a absorção de agente de contraste.

Protocolo

Rotulagem de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DiD

1. Para iniciar o procedimento para a rotulagem de células-tronco mesenquimais, trypsinize e contar as células para obter uma suspensão com um número definido de células.
2. Tome as células fora da incubadora e aspirar a media de idade dos frascos contendo as células a serem rotulados
3. Lavar as células com 10 ml de Mg / Ca-free PBS. Aspirar o PBS. O Mg e Ca inibiria o Tripsina, portanto usamos PBS sem eles.
4. Adicionar pré-aquecido Tripsina 0,05%, para um frasco T75 usamos 5ml. Assegurar que toda a superfície do frasco é coberto.
5. Incubar a 37 ° C na incubadora por aproximadamente 5 minutos.
6. Confirme o destacamento sob o microscópio. Se as células continuam a aderir ao balão, toque-o algumas vezes e esperar um pouco mais até que a tripsinização é bem sucedida.
7. Agora, é necessário neutralizar a tripsina, adicionando a mídia contendo 10% SFB. Nós usamos uma quantidade igual de mídia como há Tripsina.
8. Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para garantir que todas as células são re-suspenso na mídia.
9. Transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno estéril 15ml tampado.
10. Centrifugar a 400 rcf durante 5 minutos.
11. Aspirar o sobrenadante garantindo não perturbar o pellet celular.
12. Ressuspender as células em DMEM e prosseguir com a contagem de células.
13. Suspender as células a ser rotulados com uma densidade de 1x10 ^ 6 por ml em soro livre de meio de cultura (DMEM).
14. Esta foi toda a preparação da suspensão de células. Agora, ele está pronto para iniciar a rotulagem.
15. Primeiro, adicione 5 mL de contraste DiD por ml de suspensão celular.
16. Em seguida, misturar a solução com cuidado pipetando.
17. Incubar as células com a solução de rotulagem a 37 ° C por 20 minutos em um prato bem 6-apego-baixo.
18. Uma vez que a incubação simples é completo, é necessário transferir a solução de célula para um tubo de polipropileno 15 ml tampados.
19. Centrífuga para baixo a 400 rcf durante 5 minutos.
20. Aspirar o meio de rotulagem, garantindo não perturbar pellet celular.
21. Lavar as células com PBS. Pipeta as células para cima e para baixo, certificando-se de quebrar o pellet celular.
22. Repita os dois últimos passos mais duas vezes, para que haja um total de 3 etapas de lavagem.
23. Contar as células e executar um teste de Trypan azul para determinar a viabilidade celular. Estes são protocolos padrão da pilha cultura que não vamos explicar aqui.
24. Suas células estão prontas a ser trabalhada no imager óptica.

Rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com o ICG corante fluorescente

1. Para iniciar o procedimento para a rotulagem células estaminais embrionárias humanas, prepare o agente de contraste Indocianina Verde. Misturá-lo com o agente de transfecção de protamina.
2. Meça 1mg do pó Indocianina Verde. Dissolver o pó ICG em 100 mL de dimetil sulfóxido (DMSO).
3. Adicionar 400 mL de Modified Dulbecco Eagles Medium (DMEM + 10% Calf Serum Fetal) meios de comunicação para a mistura e mexa bem. Isso resulta em uma concentração final de 2mg/ml de Indocianina Verde.
4. Adicione o Protamina agente de transfecção. Protamina atua como serviço de transporte para o agente de contraste, de modo que fica dentro da célula mais eficiente.
5. Mistura de 5 mL de sulfato de protamina, que é fornecido em uma concentração de 10mg/ml, com 300 mL ICG e 300 mL de soro livre Dulbecco Modificado Médio Eagles.
6. Agite suavemente a solução de transfecção novo por 5 minutos para permitir complexo a se formar.
7. A solução rotulagem está pronto.
8. Aspirar a velha mídia a partir CTEh placa de Petri de 10mm.
9. Adicionar 5 ml de soro pré-aquecido sem DMEM.
10. Adicionar a solução preparada anteriormente Protamina / ICG para as células. Iniciar a incubação de 1 hora de colocar o prato em uma incubadora a 37 ° C.
11. Após a incubação estiver completa, remova o prato da incubadora e aspire a solução de rotulagem.
12. Lavar as células por lavagem do prato com 5 ml de PBS.
13. Aspirar o PBS e substituir com 5 ml de tripsina 0,25%. Incubar o prato a 37 ° C por 5 minutos para permitir que tripsinização a ocorrer. Ela ajuda a agitar o prato um pouco de vez em quando.
14. Pipeta suavemente para cima e para baixo, para acabar com as colônias restantes.
15. Neutralizar a tripsina, adicionando uma quantidade igual de KSR ao prato.
16. Transferir a solução de células para um tubo de 15ml e centrifugar a solução a 400 rcf durante 5 minutos.
17. Ressuspender as células em meios de comunicação completa.
18. Se ainda há aglomerações, neste ponto, trypsinize e centrifugar novamente.
19. Uma vez que um aglomerado de células sem solução é alcançada, aspirar a velha mídia e ressuspender o sedimento em 10ml de pré-aquecido media total ESC.
20. Neste ponto, é necessário separar as células de camundongos a partir do alimentador hESCs. Isto é feito para garantir que, mais tarde, apenas as células-tronco da imagem ocorre.
21. Para isso, a transferência ªe solução de célula para um prato de gelatina centímetros revestidas 10.
22. Coloque o prato para a 37 ° C incubadora e deixe descansar por 45 minutos. Durante este tempo, certifique-se para não perturbar o prato. Agora, os alimentadores irá aderir ao prato e as células-tronco não.
23. Transferir a solução para fora da placa de Petri. e agora temos uma solução rotulados células isoladas de células estaminais embrionárias humanas.
24. As células podem agora ser contada e um teste de Trypan azul pode ser realizada sobre eles.
25. As células estão prontos para ser fotografada!

Discussão

OI é uma relativamente nova técnica de imageamento, com base na detecção de fluorescência. OI é tão sensível quanto técnicas de radiofármaco baseado em imagem, mas não associados com a exposição a irradiação. OI fornece um meio eficaz de rastreamento de células não-invasiva e repetidamente, assim, fornecendo informações sobre a migração celular para o site de destino. Uma grande limitação da técnica é a penetração nos tecidos limitado de sondas fluorescentes in vivo. Assim, um acúmulo de marcador nos tecidos prof...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners