Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Резюме

Это видео показывает методы маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентными красителями. Эта техника может быть использована для отслеживания в естественных условиях трансплантированных стволовых клеток с оптических изображений и гистопатологические корреляции с флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Оптическая томография (OI) это простой, быстрый и недорогой инструмент для прижизненного мониторинга новых стволовых клеток терапий. Методика основана на бывших маркировки естественных условиях из стволовых клеток с флуоресцентным красителем, последующее внутривенное введение меченых клеток и визуализации их накопление в определенных органах-мишенях или патологий. Представлена ​​методика демонстрирует, как мы называем мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSC) простым инкубации с липофильных флуоресцентного красителя DID (C67H103CIN2O3S) и как мы называем человека стволовых эмбриональных клеток (чЭСК) с FDA утвержденных флуоресцентного красителя индоцианина зеленого (МКГ). Поглощение через механизм соблюдения и распространение lypophilic красителя на мембране ячейки бислоя фосфолипидов. Маркировки эффективности, как правило, лучше, если клетки инкубировали с красителем в бессывороточной СМИ, в отличие от инкубации в сыворотке средах. Кроме того, добавление протамина сульфат агентом трансфекции значительно улучшает поглощение контрастного вещества.

протокол

Маркировка мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентным красителем DiD

1. Чтобы начать процедуру маркировки мезенхимальные стволовые клетки, trypsinize и посчитать клетки, чтобы получить подвеску с определенного количества клеток.
2. Возьмите клеток из инкубатора и аспирата из старых средств массовой информации из колбы, содержащие ячейки, которые будут помечены
3. Вымойте клеток с 10 мл Mg / Ca без PBS. Аспирацию из ФСБ. Mg и Са будет препятствовать трипсина, поэтому мы используем ФСБ без них.
4. Добавить подогретого 0,05% трипсина, для T75 колбе мы используем 5 мл. Убедитесь, что вся поверхность колбы покрыта.
5. Инкубировать при 37 ° C в инкубаторе в течение приблизительно 5 минут.
6. Подтвердите отряд под микроскопом. Если клетки, до сих пор придерживаются колбу, нажмите на него несколько раз и немного подождать, пока трипсинизации успешно.
7. Теперь, необходимо, чтобы нейтрализовать трипсина путем добавления среде, содержащей 10% FCS. Мы используем одинаковое количество средств массовой информации, поскольку есть трипсина.
8. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что все клетки ресуспендировали в средствах массовой информации.
9. Передача клетка решение стерильные 15 мл ограничен труба полипропилен.
10. Центрифуга при 400 RCF течение 5 минут.
11. Аспирацию из надосадочной обеспечения, чтобы не нарушить клеточный осадок.
12. Ресуспендируют клеток в DMEM и продолжить клеток.
13. Приостановить ячейки, которые будут помечены на плотность 1x10 ^ 6 на мл в свободной от сыворотки культуральной среде (DMEM).
14. Все это было подготовкой клеточной суспензии. Теперь он готов приступить к маркировке.
15. Во-первых, добавить 5 мкл DiD контрастного вещества на мл клеточной суспензии.
16. Затем, смешайте решение, осторожно пипеткой.
17. Инкубируйте клетки с маркировки раствора при температуре 37 ° С в течение 20 минут в 6-и низко-привязанность блюдо.
18. После простой инкубации завершена, необходимо передать ячейку решение 15 мл ограничен труба полипропилен.
19. Центрифуга его вниз на 400 RCF течение 5 минут.
20. Аспирацию из маркировки среды, обеспечение не мешать осадок клеток.
21. Вымойте клеток с PBS. Внесите клетки вверх и вниз, убедившись, что для разгона осадок клеток.
22. Повторите два последних шага еще два раза, так что в общей сложности 3 этапов промывки.
23. Граф клетки и осуществляют Трипановый синий тест для определения жизнеспособности клеток. Это стандартные культуре клеток протоколов, которые мы не собираемся объяснять здесь.
24. Ваши клетки теперь готовы для включения в образ в оптических изображений.

Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток с флуоресцентным красителем МКГ

1. Чтобы начать процедуру маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток, готовят контрастного вещества индоцианина Грин. Смешайте его с протамина агентом трансфекции.
2. Отмерьте 1 мг индоцианина зеленого порошка. Растворите порошок в МКГ по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
3. Добавить 400 мкл модифицированного орлы Дульбеко Средняя (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки) средств массовой информации к смеси и встряхните ее хорошо. Это приводит к конечной концентрации 2mg/ml из индоцианина Грин.
4. Добавить Протамина трансфекции агента. Протамина действует как челнок для контрастного вещества, так что она попадает в ячейку более эффективно.
5. Смешайте 5 мкл протамина сульфат, который поставляется в концентрации 10mg/ml, с 300 мкл МКГ и 300 мкл изменения бессывороточной Дульбеко орлы Средний.
6. Осторожно встряхните новое решение трансфекции в течение 5 минут, чтобы дать сложно форме.
7. Маркировки решение готово.
8. Аспирацию из старых средств массовой информации из чЭСК блюдо 10мм Петри.
9. Добавить 5 мл подогретого бессывороточной DMEM.
10. Добавить заранее подготовленные Протамина / МКГ решение клеток. Начало 1 час инкубации, поставив блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° C.
11. После инкубации завершено, удалить блюдо из инкубатора и аспирата из маркировки решение.
12. Вымойте клетки путем промывки блюдо с 5 мл PBS.
13. Аспирацию из PBS и заменить 5 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в течение 5 минут, чтобы дать трипсинизации произойти. Она помогает избавиться блюда понемногу каждый раз в то время.
14. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы разбить оставшиеся колонии.
15. Нейтрализовать трипсина путем добавления равное количество KSR на блюдо.
16. Передача клетка решение 15мл трубки и центрифуги решение при 400 RCF течение 5 минут.
17. Ресуспендируют клетки в полном объеме средства массовой информации.
18. Если еще есть сгустки в этой точке, trypsinize и центрифуга снова.
19. Как только комок решение без ячейки достигнута, аспирата из старых СМИ и ресуспендируют осадок в 10 мл подогретого полный СМИ ESC.
20. На данный момент, необходимо отделить мыши фидерных клеток из ЭСК. Это делается для обеспечения того, позже, только изображения стволовых клеток происходит.
21. Для этого, передача гоэлектронная ячейка решение желатин покрытием 10 см блюдо.
22. Поставьте блюдо в 37 ° С инкубатор и оставьте на 45 минут. В течение этого времени, убедитесь, не мешать блюдо. Теперь, питатели будет придерживаться блюдо и стволовые клетки не будут.
23. Перенесите раствор из чашки Петри. и теперь мы имеем помечены единое решение клетки человеческих эмбриональных стволовых клеток.
24. Клетки теперь могут быть посчитаны и тест Трипановый синий могут быть выполнены на них.
25. Клетки готовы для включения в образ!

Обсуждение

О. И. представляет собой относительно новую технику обработки изображений, основанный на обнаружении флуоресценции. О. И. столь же чувствительны, как радиоактивный индикатор основе методов визуализации, но не связан ни с облучением экспозиции. О. И. предоставляет эффективные средства отслеживани?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners