Detecção de Bacteriófagos em Amostras Ambientais

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Alex Wassimi

Os vírus são um grupo único de entidades biológicas que infectam organismos eucarióticos e procarióticos. São parasitas obrigatórios que não têm capacidade metabólica, e para se replicarem, dependem do metabolismo hospedeiro para produzir partes virais que se auto-montam dentro das células hospedeiras.

Os vírus são ultramicroscópicos — pequenos demais para serem vistos com o microscópio de luz, visível apenas com a maior resolução do microscópio eletrônico. Uma partícula viral consiste em um genoma ácido nucleico, seja DNA ou RNA, cercado por uma camada de proteína, conhecida como capsid, composta de subunidades proteicas ou capsomers. Em alguns vírus mais complexos, o capsídeo é cercado por um envelope lipídedo adicional, e alguns têm apêndices de superfície ou caudas.

Vírus que infectam o trato intestinal de humanos e animais são conhecidos como vírus entéricos. Eles são excretados em fezes e podem ser isolados de águas residuais domésticas. Os vírus que infectam bactérias são conhecidos como bacteriófagos, e aqueles que infectam bactérias coliformes são chamados de colifagos (Figura 1). Os phages de bactérias coliformes são encontrados em qualquer lugar que as bactérias coliformes são encontradas.

Figura 1. Coliphage T2.

1. Obtenha uma amostra de esgoto ou água contendo colifago.
2. Diluir a amostra 1:10 e 1:100 usando tampão Tris. Faça isso transferindo 1,0 mL de cultura para 9 mL de buffer Tris, e depois fazendo uma segunda diluição de 10 vezes.
3. Derreta três tubos de ágar macio (0,7% de ágar nutriente ou ágar de soja de tripática por tubo de 3 mL) colocando-os em um banho de vapor ou autoclave.
4. Coloque o ágar em um banho de água a 45-48 °C por 15 minutos para permitir que a temperatura do ágar se ajuste a 45 °C.
5. Ao pr

Diluição da amostra de esgoto = 10^-1

Número de placas obtidas = 9

Portanto, concentração de phage na amostra de esgoto
= 10 x 9 ÷ 1 mL
= 90 unidades formadoras de placas / mL

O esgoto bruto normalmente contém 10³ – 10⁴ colifagos por mL, com um intervalo de 10² – 10⁸ por mL.

Existem muitas aplicações potenciais de colifagos como indicadores ambientais. Estes incluem seu uso como indicadores de contaminação de esgoto, eficiência do tratamento de água e esgoto, e sobrevivência de vírus e bactérias entéricas no meio ambiente. O uso de bacteriófagos como indicadores da presença e comportamento de bactérias entéricas e vírus animais sempre foi atrativo devido à facilidade de detecção e baixo custo associado aos ensaios de phage. Além disso, podem ser quantificados em amostras a...