Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução.
Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução usando microscopia de iluminação estruturada. SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia widefield, atingindo um detalhe de cerca de 100 nanômetros. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.
A chave para permitir a análise em nível de super-resolução é, no entanto, os reagentes utilizados durante a aquisição, como tampas câmaradas e soluções de montagem compatíveis com o índice de difração do objetivo. Para obter um neurônio primário hipocampal de camundongos, isole o hipocampi de filhotes P1 a P4. Células de placa a 70.000 células por poço em um volume de 200 microliters por poço.
Espere até que os neurônios primários hipocampal estejam totalmente maduros 12 a 14 dias após o revestimento para realizar estudos de co-localização. Adicione 4% de paraformaldeído, PFA, em microlitrais PBS 200 por poço aos neurônios para corrigi-los rapidamente. Remova a solução e incuba as amostras com 1%de albumina de soro bovino, BSA, em PBS a 200 microliters por poço durante uma hora à temperatura ambiente para cobrir passivamente todas as superfícies de ligação livre da placa com uma proteína irrelevante para a análise.
Um buffer de bloqueio baseado em BSA sem Triton X-100 reduz o fundo do anticorpo de forma mais eficiente do que o mesmo buffer com 0,2% Triton X-100. Adicione o anticorpo primário. Como controle negativo, não adicione nenhum anticorpo primário a um dos poços.
Montagem de células usando um montador compatível com SIM, por exemplo, ProLong Glass Antifade Mountant. Cubra e proteja as células com um óculos de cobertura, por exemplo, uma tampa redonda com um diâmetro de oito milímetros.
Os quadrados também podem ser usados. Armazene as tampas em câmara à temperatura ambiente e espere pelo menos 48 horas antes de adquirir imagens. O vidro diamante requer pelo menos dois dias de cura antes das aquisições de super resolução.
Use duas estratégias para garantir a especificidade do anticorpo. O primeiro é o uso de pelo menos dois anticorpos diferentes visando o mesmo substrato. A segunda estratégia é a neutralização de anticorpos por incubação com o alvo proteico purificado, ou o usado para elevar o anticorpo.
Usamos rotineiramente um microscópio de super resolução N-SIM fabricado pela Nikon para nossa análise. As instruções a seguir devem ser destinadas à aquisição de imagens SIM independentemente do microscópio de uso. Também é importante maximizar o desempenho do microscópio para realizar uma calibração precisa dos instrumentos, incluindo anel de correção, alinhamento a laser e foco de bloco de grade.
Antes da aquisição de imagens SIM, o sistema requer uma calibração adequada com contas fluorescentes específicas de tamanho de sub-resolução. Um exemplo são as microesferas tetraspeck. Estas contas são manchadas com diferentes corantes fluorescentes para permitir a calibração de diferentes lasers com uma amostra.
Em um banho de água, sonicar cerca de 1,8 vezes 10 para a 8ª microesferas fluorescentes por 10 minutos. Diluir as microesferas fluorescentes uma em 500 em água dupla destilada. Sonicate uma segunda vez por mais 10 minutos.
Pipeta 15 microliters das contas diluídas em um poço de um deslizamento de cobertura câmara. Deixe a solução secar por cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 10 microliters da solução de montagem, por exemplo.
ProLong Glass, e coloque uma tampa de oito milímetros em cima. Espere pelo menos 48 horas para permitir uma cura adequada. Ligue o microscópio e os lasers.
Deixe o sistema aquecer para alcançar o equilíbrio térmico de todos os componentes do microscópio e o sistema de microscópio de super resolução SIM requer pelo menos três horas. Selecione o objetivo de 100X. Inicie a calibração alinhando os lasers ao centro do bloco de grade de difração.
No sistema N-SIM, um botão de micrômetro e uma câmera dedicada permitem o centro dos feixes de luz para o alvo. Insira a tampa de câmara do microscópio para visualização. Ajuste o sistema para a espessura do deslizamento de tampas câmara, ajustando a tampa de correção objetiva.
O NIS Software, software proprietário fornecido com sistemas de microscópio de super resolução N-SIM, tem uma função automática para regular a correção de cores. Ajuste o foco do bloco de grade para cada canal para garantir a iluminação de padrão estruturado focalizada na amostra. O software fornece uma função automática para esta tarefa.
Adquira imagens SIM 3D brutas das microesferas multicoloridas. Calcule para cada comprimento de onda separado a transformação Fourier da imagem super resolvida. Se a imagem transformada não conseguir um padrão correto semelhante a uma flor, reinicie a calibração, uma vez que a super-resolução não foi alcançada.
Na imagem super resolvida, selecione uma única microesfera e calcule seu perfil de intensidade para cada canal para medir a resolução alcançada. Agora deve estar perto de 100 nanômetros lateralmente. Realize o registro do canal sobrepondo uma aquisição multicanal das microesferas.
O objetivo é reunir todos os sinais do canal lateralmente e axily. Isso eliminará as aberrações cromáticas devido ao desalinhamento dos diferentes canais e ajudará na análise de co-localização. Confirme a qualidade da calibração usando a etapa de fase de iluminação das funções e o foco padronizado de iluminação do SIMcheck, um conjunto de plugins para o aplicativo de código aberto ImageJ.
Comece a analisar a amostra usando um objetivo de 40X no modo confocal ou widefield. Isso permite a navegação da amostra, mantendo bons detalhes e um grande campo de visão. Use o sinal de anticorpos MAP2 para detectar uma área que represente processos neuronais.
Adquira imagens da amostra no modo confocal para determinar a qualidade da coloração. Mude para o objetivo 100X. Aplique óleo ao objetivo de 100X.
Adquira uma imagem widefield ou confocal que será usada mais tarde para avaliar a qualidade da imagem super-resolvida. Mude para o modo SIM 3D. Usando janelas de diálogo para definir os parâmetros para aquisição, selecione a configuração de profundidade de bit mais alta disponível para maximizar as informações de cores.
Normalmente, 16 bits é a escolha padrão. Além disso, para melhorar a relação sinal-ruído, selecione um valor de baixa frequência para aquisição, como um mega-hertz. Usando janelas histogramas, defina poder laser para obter uma resposta linear do sinal para evitar a perda de informações, limitar pixels saturados nas imagens.
O sistema N-SIM usa uma câmera Andor iXon3. Ao trabalhar em 16 bits, escolha uma intensidade de destino de 16.000 para garantir a resposta linear da câmera. Alternativamente, escolha uma faixa entre 30.000 a 45.000 para maximizar o alcance dinâmico das aquisições.
Defina a potência laser entre 0,1% e 50% ao fotografar as amostras e os tempos de exposição entre 50 milissegundos e dois segundos. Os poderes a laser acima de 50% podem causar fotobleachamento rápido dos fluoroforos em uso. Comece a adquirir as imagens no modo SIM 3D.
Use o SIMcheck, um conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para avaliar a qualidade das aquisições das imagens brutas. Se o SIMcheck não detectar quaisquer artefatos ou problemas de qualidade, adquira um mínimo de 10 imagens a partir de réplicas técnicas completas para permitir a análise estatística. As imagens adquiridas são dados brutos que precisam ser processados para obter imagens SIM reconstruídas que serão usadas para análise posterior.
No protocolo, sugerimos usar a sinaptofisina e o PSD-95 como marcadores pré e pós-sináptico. No entanto, podem ser usados marcadores adicionais. Um enorme corpo de literatura apoia o uso de outras proteínas, como drebrina e fagote como marcadores sinápticos.
As imagens adquiridas 3D SIM são imagens brutas que precisam ser processadas para obter imagens super-resolvidas reconstruídas. A reconstrução incorreta de imagens brutas pode levar a artefatos que afetariam a análise das amostras. Deve-se, portanto, prestar muita atenção à escolha adequada dos parâmetros de reconstrução.
Processe as imagens brutas usando o software de análise de reconstrução do microscópio para obter uma imagem super-resolvida. Alternativamente, use um plugin ImageJ livremente disponível fairSIM para reconstruir as imagens brutas. Calcule a transformação Fourier das imagens super-resolvidas usando o software de reconstrução do microscópio ou o plugin ImageJ SIMcheck.
Uma boa imagem reconstruída deve retornar, para cada canal, uma imagem semelhante a uma flor. Se as imagens reconstruídas não recriarem uma forma semelhante a uma flor, reiniciem a partir das imagens brutas e reconstruam-nas modificando parâmetros de reconstrução, como filtragem linear, apodização e supressão de ordem zero. No Software NIS usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique o contraste de modulação de iluminação do parâmetro, a supressão de ruído de alta resolução e a supressão do foco.
Analise a imagem reconstruída para detectar artefatos imparcialmente usando NanoJ-SQUIRREL, um plugin baseado em ImageJ, para avaliar a qualidade de imagens super-resolvidas. Em nossa análise de co-localização, utilizamos duas abordagens. A primeira é uma abordagem visual baseada na análise de perfil que mostra eventos únicos de co-localização e que identifica a contribuição de cada canal.
Como primeiro passo para estudar a co-localização entre marcadores sinápticos e uma proteína de interesse, pegue uma imagem super resolvida e analise um único lócus para determinar a sobreposição de sinal. Identifique um único lócus na imagem super resolvida. Obtenha os perfis de intensidade dos sinais fluorescentes para o lócus de interesse.
Se a análise do perfil tiver sugerido a co-localização do locus único, uma análise mais geral de toda a imagem pode ser realizada calculando os coeficientes de Pearson e Mander. Use JACoP, um plugin ImageJ, para determinar dois parâmetros de co-localização, Pearson's e Mander's. Depois de calibrar o sistema e avaliar a qualidade das imagens reconstruídas, passamos a analisar as culturas neuronais primárias manchadas com um anticorpo contra MAP2, um marcador neuronal, PSD-95, um marcador pós-sináptico, e nossa proteína alvo SUMO1.
Primeiro analisamos a amostra realizando microscopia confocal de quatro canais com um objetivo de 40X. Ao selecionar uma área representando processos neuronais, mudamos para um objetivo de 100X. Adquirimos imagens confocal e SIM da mesma área para avaliar a qualidade da reconstrução com NanoJ-SQUIRREL e realizar análises de co-localização.
Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão tanto dos processos fisiológicos quanto patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto em condições normais as sinapses do estado são os blocos de construção da memória, eles também estão na base de distúrbios neurológicos complexos, como uma das formas mais comuns de demência da doença de Alzheimer. O protocolo descrito aqui permite o estudo da composição proteica das sinapses com uma técnica de microscopia de super resolução chamada microscopia de iluminação estruturada.
